Submitted by Alessandra Portugal (alessandradf@ioc.fiocruz.br) on 2013-10-03T12:12:48Z No. of bitstreams: 1 THIAGO JOSÉ FIGUEIRA RAMOS.pdf: 1733228 bytes, checksum: c1606fa7a4e1569d3cc660ae62c32331 (MD5) / Made available in DSpace on 2013-10-03T12:12:48Z (GMT). No. of bitstreams: 1 THIAGO JOSÉ FIGUEIRA RAMOS.pdf: 1733228 bytes, checksum: c1606fa7a4e1569d3cc660ae62c32331 (MD5) Previous issue date: 2012-10-10 / Fundação Oswaldo Cruz. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro, RJ, Brasil / A silicose é uma doença ocupacional causada pela inalação de sílica em sua forma livre e cristalina. A inflamação e fibrose pulmonar constituem as principais características da patologia, que envolve uma variedade de mediadores inflamatórios, como o TNF-α, um mediador de ações amplas e que exerce seus efeitos em um grande número de tipos celulares. LASSBio-468 é um análogo da talidomida já descrito como capaz de modular a produção de TNF-α e inibir o choque endotóxico e artrite reumatóide em modelos animais. Neste estudo, nós investigamos o potencial efeito do LASSBio-468 em modelo de silicose experimental em camundongos. Animais Swiss-webster machos (18 – 20g) foram instilados intranasalmente com uma suspensão de sílica (10 mg/50 μL) e veículo (salina). O tratamento consistiu na administração por via oral de LASSBio-468 (12,5 – 100 mg/kg) e talidomida (50 mg/Kg) durante 7 dias consecutivos, do vigésimo primeiro ao vigésimo oitavo dia após a instilação de sílica. Foram analisadas a função pulmonar (resistência e elastância) e hiperreatividade das vias aéreas à aerolização de metacolina (3 – 27 mg/mL), através de pletismógrafo invasivo de corpo inteiro (Finepoint, Buxco System), além de análises morfológicas e morfométricas do tecido pulmonar. A produção de colágeno tecidual foi acessada pelo método de sircol, enquanto que a quantificação de citocinas/quimiocinas foi realizada pelo ensaio de ELISA. A técnica de imunohistoquímica permitiu a identificação da população de miofibroblastos no pulmão. Através de uma digestão mecânica e enzimática do tecido pulmonar, obtivemos uma cultura primária de miofibroblastos que, assim como macrófagos alveolares AMJ2C11 e células epiteliais A549, foram pré-tratados com diferentes concentrações de LASSBio-468 e talidomida, estimulados com IL-13 ou sílica e avaliados quanto a proliferação celular, viabilidade e produção de mediadores inflamatórios in vitro. Demonstramos que animais silicóticos apresentaram níveis basais elevados de resistência pulmonar e elastância, bem como hiperreatividade frente à aerolização de metacolina. Resposta inflamatória tecidual, extensiva deposição de colágeno, formação de granuloma e produção de quimiocinas (KC and MCP-1) e citocinas (TNF- αand TGF-β) também foram detectadas em pulmões de animais silicóticos, assim como o aumento do número de miofibroblastos no tecido. O tratamento com LASSBio-468 reduziu o comprometimento da função pulmonar e hiperreatividade, formação de granulomas, expressão de miofibroblastos e deposição de colágeno no tecido pulmonar de animais doentes. Miofibroblastos oriundos de animais silicóticos apresentaram basal de proliferação superior, sendo responsivos também ao estímulo mitogênico da IL-13, que foi atenuado frente ao pré-tratamento com LASSBio-468. A estimulação de macrófagos alveolares e células epiteliais com sílica promoveu a liberação de TNF-α e IL-8, respectivamente, sendo o LASSBio-468 capaz de inibir de forma significativa esta produção. Em conjunto, nossos resultados mostraram que o tratamento com LASSBio-468 foi capaz de reduzir de forma curativa o comprometimento da função pulmonar e resposta granulomatosa, através de ações sobre células específicas, indicando que o composto em questão parece constituir uma promissora ferramenta para o tratamento de doenças pulmonares fibróticas crônicas como a silicose. / Silicosis, one of the oldest occupational diseases in the world, is a consequence of long-term exposure to inhaled dust containing silica in its free and crystalline form. Lung interstitial inflammation and fibrosis are the main features of the disease, involving a wide range of chemical mediators such as TNF-α. This is a pleiotropic molecule which exerts its effects on many cell types. LASSBio-468 is a thalidomide analogue which modulates TNF-α production and inhibits endotoxic shock and arthritis in animal models. In this study we investigated the effect of LASSBio-468 on experimental silicosis in mice. Anesthetized male Swiss-Webster mice (18-20g) received intranasal (i.n.) instillation of silica (10 mg/50 μL) and vehicle (saline). Treatment consisted of oral administration of the LASSBio-468 (12,5 - 100 mg/kg) and thalidomide (50 mg/Kg) during 7 consecutive days, from day 21 to 28 post-silica. The analyses included lung function (resistance and elastance) and airways hyperreactivity to aerosolized metacholine (3 -27 mg/mL) measured by whole body invasive plestimography (Finepoint, Buxco System). Morphological and morphometrical analyses included classical dyes such as Hematoxylin-Eosin and Picrus-Sirius. Collagen content and cytokine/chemokine generation were quantified by Sircol technique and ELISA, respectively. Immunohistochemistry was employed to identify the lung myofibroblastic population. Primary murine myofibroblasts cells were obtained after a mechanical and enzymatic digestion of the lung from saline and silicotic mice. Myofibroblasts, AMJ2C11 alveolar macrophages and A549 epithelial cells were pre-treated with LASSBio-468 and Thalidomide, stimulated with IL-13 or silica and evaluated thought proliferation, viability and production of inflammatory mediators in vitro. We showed that silicotic mice exhibited increased basal levels of lung resistance and elastance as well as airways hyperreactivity to methacholineaerosolization. Tissue inflammatory response, extensive collagen deposition, granuloma formation and chemokine (KC and MCP-1)/cytokine (TNF-α and TGF-β) generation were also detected in the silicotic lungs, as well as an increasing of myofibroblasts expression in the lung. Administration of LASSBio- 468 into silicotic mice reduced the decline lung function and airways hyperreactivity, myofibroblasts numbers, tissue collagen deposition and granulomatous area. The generation of cytokines and chemokines was also suppressed by the drug. The primary lung myofibroblasts obtained from silicotic mice showed a superior basal proliferation and IL-13, a pro-fibrotic cytokine, stimulated the (3H) incorporation in vitro, which was diminished by the treatment with LASSBio-468. Stimulation of alveolar macrophages and epithelial cells by silica in vitro increased the release of TNF-α and IL-8, respectively, and LASSBio-468 was able to reduce these inflammatory mediators production. The compound modulated key cells functions without decline in cell death. Altogether our findings show that the treatment of silicotic mice with LASSBio-468 reduced curatively the decline in lung function and granulomatous response, throught actions on myofibroblasts, macrophages and epithelial cells, indicating that this compound constitutes a promising tool for the treatment of chronic fibrotic pulmonary diseases such as silicosis.