El objetivo fundamental de la presente Tesis Doctoral ha sido comparar dos técnicas cromatográficas acopladas utilizadas en Cromatografía Líquida (acoplamiento LC-LC y acoplamiento SPE-LC), mediante su aplicación al análisis de residuos de diferentes familias de herbicidas en muestras de agua. El acoplamiento LC-LC con detección UV se ha utilizado para la determinación de residuos de bromacilo y diuron, de cuatro herbicidas triazínicos, y de atrazina junto a sus principales productos de transformación. Para ello, se han desarrollado tres procedimientos analíticos rápidos y selectivos basados en la inyección directa de 2 ml de muestra acuosa en el sistema LC-LC, con límites de detección entre 0.1 y 0.5 µg·l-1. La incorporación de una sencilla etapa previa de SPE "off-line" (en la determinación de triazinas y productos de transformación) permite disminuir los límites de detección hasta niveles inferiores a 0.1 µg·l-1, pudiendo aplicarse los métodos desarrollados a muestras de aguas potables. El acoplamiento "on-line" SPE-LC-DAD se ha llevado a cabo mediante modificación de un equipo instrumental originalmente diseñado para llevar a cabo SPE "off-line" (el ASPEC XL), habiéndose desarrollado procedimientos para la determinación de carbaril y su principal producto de transformación (1-naftol), bromacilo con cinco herbicidas ureicos, triazinas y TP´s, y finalmente, seis herbicidas fenilcarbamatos. Cabe destacar la completa automatización de los procedimientos desarrollados así como las altas sensibilidades obtenidas mediante preconcentración de volúmenes de muestra del orden de 50-100 ml. Complementariamente al desarrollo de metodología analítica, se han llevado a cabo estudios de degradación de carbaril a 1-naftol, así como de desmedifam y fenmedifam. En el caso de los fenilcarbamatos se detectaron varios TP´s, quedando pendiente una futura elucidación estructural de los mismos.Los procedimientos desarrollados se han utilizado para realizar control de plaguicidas en aguas superficiales de la Comunidad Valenciana, habiéndose detectado diferentes herbicidas como bromacilo, diuron y algunas triazinas (simazina, terbutilazina, terbutrina y terbumeton). Finalmente, se ha llevado a cabo un estudio comparativo de las dos modalidades de acoplamiento utilizadas en esta Tesis Doctoral, LC-LC y SPE-LC, destacándose las características más relevantes de cada una de ellas (rapidez, sensibilidad, selectividad y mayor o menor carácter multiresidual), mediante el apoyo de los datos experimentales obtenidos a partir de los métodos desarrollados para los distintos herbicidas analizados tanto por LC-LC como por SPE-LC.

O sequenciamento genético do DNA humano permitiu maior compreensão da funcionalidade dos seres vivos e principalmente a causa de muitas doenças. Entretanto, os estudos em genética têm se limitado a resolverem os problemas da ciência, e atualmente, a solução para o avanço nessa área tem se atribuído à proteômica. Dessa forma, a pesquisa em química analítica intensificou-se na busca de estratégias melhores para a caracterização de proteomas, em três aspectos principais: preparo de amostra, desenvolvimento da instrumentação analítica e bioinformática. Verifica-se a possibilidade da aplicação de muitas técnicas, atualmente, destaca-se a análise de peptídeos (proteômica shotgun) por cromatografia líquida multidimensional acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC/LC-MS/MS), devido à possibilidade de automatização, minimização dos problemas e resultados satisfatórios na análise de amostras biológicas complexas. Portanto, neste trabalho desenvolveu-se um método LC/LC-MS/MS (modalidade on-line column switching) o qual se constitui de coluna trocadora catiônica (homemade), trap de aprisionamento e limpeza, coluna capilar hidrofóbica e separação e detecção por espectrometria de massas sequencial automatizada. Com a proposta de uma instrumentação analítica aperfeiçoada, realizamos a confecção de um trap com partículas de elevada retenção dos peptídeos, o que permite ótima recuperação de amostra. Por se tratar de uma técnica de elevada complexidade instrumental, devido a difícil compatibilidade entre as dimensões cromatográficas, possíveis perda de analito no processo e elevado tempo de análise, propomos uma nova abordagem de otimização, por meio de estudos quimiométricos. Assim, neste trabalho, foram avaliados doze parâmetros instrumentais e destes houve uma simplificação de apenas dois fatores, responsáveis por 95% da resposta ótima do método. Este fato permitiu valores da cobertura da proteína de BSA (82,54%), número de peptídeos (65) e score (2134,05) superiores aos reportados na literatura, os quais apresentam tempos de análise maiores. Este estudo fornece informações do comportamento químico dos peptídeos em relação ao método proposto, por meio de uma superfície de resposta e equação matemática que pode contribuir para a aplicação em diferentes proteomas. / The genetic sequence of human DNA has helped the comprehension of life and principally the cause of various diseases. However, genetic studies have limited to resolve science problems and currently solutions to advance in this field have been attributed to proteomics. Thus, the analytical chemistry has intensified on the search for a better strategy to proteomic characterization in three principal aspects: sample preparation, development of analytical instrumentation, and bioinformatics. Proteomics involves the application of many techniques, currently; the peptide analyses (shotgun proteomics) by multidimensional liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC/LC-MS/MS) is the state of the art. The main reasons are because it allows full system automation, less problems in repeatability, and adequate results in analysis of highly complex biological samples. Therefore, this dissertation developed the method LC/LC-MS/MS (modality on-line column switching), this has a cation exchange column (homemade), trap column to clean, hydrophobic capillary column and separation and detection by tandem mass spectrometry. We have proposed an improved analytical instrumentation, with a homemade trap that particles have high retention of peptide, which permit great recuperation of samples. Because it is an instrumental technique difficult, such as, obtain compatibility between the chromatography dimensions, can lose samples in the process and long time analysis, we have proposed a new optimization approach with chemometric analysis of data. On that, were evaluated twelve instrumental parameters and there was a simplification only two factors, these were responsible for 95% of greater response of method. As a result, the coverage of BSA protein was 82,54%, number of peptides 65 and score of 2134,05 values of high significance if compare from that there are in literature that presented greater time analysis. This work describes information about chemistry of peptides to method proposed through a surface of response and math equation that can contribute to different proteomes.

O sequenciamento genético do DNA humano permitiu maior compreensão da funcionalidade dos seres vivos e principalmente a causa de muitas doenças. Entretanto, os estudos em genética têm se limitado a resolverem os problemas da ciência, e atualmente, a solução para o avanço nessa área tem se atribuído à proteômica. Dessa forma, a pesquisa em química analítica intensificou-se na busca de estratégias melhores para a caracterização de proteomas, em três aspectos principais: preparo de amostra, desenvolvimento da instrumentação analítica e bioinformática. Verifica-se a possibilidade da aplicação de muitas técnicas, atualmente, destaca-se a análise de peptídeos (proteômica shotgun) por cromatografia líquida multidimensional acoplada à espectrometria de massas sequencial (LC/LC-MS/MS), devido à possibilidade de automatização, minimização dos problemas e resultados satisfatórios na análise de amostras biológicas complexas. Portanto, neste trabalho desenvolveu-se um método LC/LC-MS/MS (modalidade on-line column switching) o qual se constitui de coluna trocadora catiônica (homemade), trap de aprisionamento e limpeza, coluna capilar hidrofóbica e separação e detecção por espectrometria de massas sequencial automatizada. Com a proposta de uma instrumentação analítica aperfeiçoada, realizamos a confecção de um trap com partículas de elevada retenção dos peptídeos, o que permite ótima recuperação de amostra. Por se tratar de uma técnica de elevada complexidade instrumental, devido a difícil compatibilidade entre as dimensões cromatográficas, possíveis perda de analito no processo e elevado tempo de análise, propomos uma nova abordagem de otimização, por meio de estudos quimiométricos. Assim, neste trabalho, foram avaliados doze parâmetros instrumentais e destes houve uma simplificação de apenas dois fatores, responsáveis por 95% da resposta ótima do método. Este fato permitiu valores da cobertura da proteína de BSA (82,54%), número de peptídeos (65) e score (2134,05) superiores aos reportados na literatura, os quais apresentam tempos de análise maiores. Este estudo fornece informações do comportamento químico dos peptídeos em relação ao método proposto, por meio de uma superfície de resposta e equação matemática que pode contribuir para a aplicação em diferentes proteomas. / The genetic sequence of human DNA has helped the comprehension of life and principally the cause of various diseases. However, genetic studies have limited to resolve science problems and currently solutions to advance in this field have been attributed to proteomics. Thus, the analytical chemistry has intensified on the search for a better strategy to proteomic characterization in three principal aspects: sample preparation, development of analytical instrumentation, and bioinformatics. Proteomics involves the application of many techniques, currently; the peptide analyses (shotgun proteomics) by multidimensional liquid chromatography coupled to tandem mass spectrometry (LC/LC-MS/MS) is the state of the art. The main reasons are because it allows full system automation, less problems in repeatability, and adequate results in analysis of highly complex biological samples. Therefore, this dissertation developed the method LC/LC-MS/MS (modality on-line column switching), this has a cation exchange column (homemade), trap column to clean, hydrophobic capillary column and separation and detection by tandem mass spectrometry. We have proposed an improved analytical instrumentation, with a homemade trap that particles have high retention of peptide, which permit great recuperation of samples. Because it is an instrumental technique difficult, such as, obtain compatibility between the chromatography dimensions, can lose samples in the process and long time analysis, we have proposed a new optimization approach with chemometric analysis of data. On that, were evaluated twelve instrumental parameters and there was a simplification only two factors, these were responsible for 95% of greater response of method. As a result, the coverage of BSA protein was 82,54%, number of peptides 65 and score of 2134,05 values of high significance if compare from that there are in literature that presented greater time analysis. This work describes information about chemistry of peptides to method proposed through a surface of response and math equation that can contribute to different proteomes.

Le caramel liquide, obtenu par le traitement thermique des sucres, est couramment utilisé pour modifier le goût ou la couleur des produits agroalimentaires.Parmi les promoteurs de caramélisation autorisés, l’ammoniaque (pour les caramels colorants de classe III) et les sels d’ammonium (pour ceux de classe IV) sont source de composés néoformés indésirables (CNI) comme le 2-acétyl-4-(1,2,3,4-tétrahydroxybutyl)imidazole (THI), immunosuppresseur, et le 4-méthylimidazole (4MeI), agent convulsif. Ces molécules ont des teneurs limitées par la réglementation Européenne à 10 et 250 ppm respectivement. Pour améliorer la connaissance de la chimie du caramel et la qualité des caramels colorants en contrôlant la formation des CNI, il est nécessaire de développer des méthodes analytiques fiables, rapides et faciles à mettre en œuvre. Ce travail de thèse présente le développement de nouvelles méthodes basées sur la chromatographie en phase liquide à deux-dimensions (LC-LC). Ces méthodes très sélectives permettent de minimiser le temps d’analyse puisque la préparation de l’échantillon se réduit à une simple dilution dans l’eau et les deux séparations chromatographiques en cascade sont réalisées sur un système totalement automatisé. La validation des méthodes par les profils d’exactitude a permis d’assurer que 90 % des résultats sont à moins de 20 % de la valeur vraie dans le domaine de concentration 10 à 50 ppm pour le THI, 20 à 500 ppm pour le 4MeI, 200 à 2500 ppm pour le fructose, saccharose, lactose, maltose et maltotriose et 500 à 2500 ppm pour le glucose.Ces méthodes sont enfin appliquées au suivi de la réaction de caramélisation et au contrôle qualité des produits finis. / Caramel liquid, obtained by heat treatment of sugars, is commonly used to alter the taste or colour of food products.Among promoters of caramelization allowed, ammonia (for caramel colours of class III) and ammonium salts (for those of class IV) are a source of neoformed contaminants (NFC) such as 2-acetyl-4-(1,2,3,4-tetrahydroxybutyl)imidazole (THI), immunosuppressive agent, and 4-methylimidazole (4MeI), convulsive agent. These molecules have contents limited by the European regulations to 10 and 250 ppm, respectively.To improve knowledge of the chemistry of caramel and quality of caramel colours by controlling the formation of NFC, it is necessary to develop analytical methods that are both reliable, fast and easy to implement. This thesis presents the development and validation of new methods based on two-dimensional liquid chromatography (LC-LC). These very selective methods can minimize analysis time since sample preparation is reduced to a simple dilution with water and the two consecutive chromatographic separations are performed on a fully automated system. The method validation by the accuracy profiles allowed to show that 90 % of obtained results correspond to the agreement value more or less 20 %, in the field of concentration 10 to 50 ppm for THI, 20 to 500 ppm for 4MeI, 200 to 2500 ppm for fructose, sucrose, lactose, maltose and maltotriose and 500 to 2500 ppm for glucose.These methods are finally applied to monitor the reaction of caramelization and to control the quality of finished products.

Le caramel liquide, obtenu par le traitement thermique des sucres, est couramment utilisé pour modifier le goût ou la couleur des produits agroalimentaires.Parmi les promoteurs de caramélisation autorisés, l'ammoniaque (pour les caramels colorants de classe III) et les sels d'ammonium (pour ceux de classe IV) sont source de composés néoformés indésirables (CNI) comme le 2-acétyl-4-(1,2,3,4-tétrahydroxybutyl)imidazole (THI), immunosuppresseur, et le 4-méthylimidazole (4MeI), agent convulsif. Ces molécules ont des teneurs limitées par la réglementation Européenne à 10 et 250 ppm respectivement. Pour améliorer la connaissance de la chimie du caramel et la qualité des caramels colorants en contrôlant la formation des CNI, il est nécessaire de développer des méthodes analytiques fiables, rapides et faciles à mettre en œuvre. Ce travail de thèse présente le développement de nouvelles méthodes basées sur la chromatographie en phase liquide à deux-dimensions (LC-LC). Ces méthodes très sélectives permettent de minimiser le temps d'analyse puisque la préparation de l'échantillon se réduit à une simple dilution dans l'eau et les deux séparations chromatographiques en cascade sont réalisées sur un système totalement automatisé. La validation des méthodes par les profils d'exactitude a permis d'assurer que 90 % des résultats sont à moins de 20 % de la valeur vraie dans le domaine de concentration 10 à 50 ppm pour le THI, 20 à 500 ppm pour le 4MeI, 200 à 2500 ppm pour le fructose, saccharose, lactose, maltose et maltotriose et 500 à 2500 ppm pour le glucose.Ces méthodes sont enfin appliquées au suivi de la réaction de caramélisation et au contrôle qualité des produits finis.