Los ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFAs) son nutrientes esenciales altamente demandados por las industrias acuícola, nutracéutica y alimentaria. Actualmente, el principal recurso que abastece de LC-PUFAs a la industria es el aceite de pescado. Sin embargo, las diversas problemáticas asociadas a su producción hacen necesaria la búsqueda de recursos alternativos. Ciertas microalgas marinas producen naturalmente estos compuestos por lo que surgen como una fuente alternativa prometedora de LC-PUFAs. Además, su síntesis puede modificarse manipulando las condiciones de crecimiento y, frente a condiciones de baja temperatura, ciertas especies responden sintetizando aún más LC-PUFAs. Sobre la base de estos antecedentes, el objetivo de esta Tesis fue aislar microalgas nativas del estuario de Bahía Blanca y desarrollar estrategias de cultivo que involucren el estrés por baja temperatura. Se plantearon como objetivos específicos aislar potenciales especies productoras de PUFAs e identificarlas morfológica y molecularmente; caracterizar su crecimiento a escala de laboratorio; cultivarlas en fotobiorreactor bajo condiciones óptimas y estresantes en términos de temperatura determinando su efecto sobre parámetros de crecimiento, producción de biomasa y cantidad, calidad y producción lipídica, con especial énfasis en LC-PUFAs, y de otros compuestos de alto valor como esteroles, pigmentos y/o proteínas. De las tres especies de diatomeas aisladas, se seleccionó a Cylindrotheca closterium por presentar los mejores resultados en cuanto crecimiento y producción de biomasa. Se corroboró la identidad de la cepa mediante análisis del gen cloroplástico rcbl. Se realizaron cultivos en fotobiorreactor de C. closterium a 20°C (control), y disminuyendo abruptamente la temperatura a 10oC durante la fase exponencial de crecimiento (EBTEx) y la fase estacionaria de crecimiento (EBTEs). La condición EBTEs, fue la estrategia de cultivo más adecuada para incrementar la producción de biomasa, lípidos y LC-PUFAs esenciales, particularmente en términos de ácidos eicosapentaenoico (EPA) y araquidónico (ARA). A su vez, la presencia de esteroles y aminoácidos esenciales para organismos acuáticos revelaron el valor de la biomasa para su posible uso en acuicultura. Por otra parte, otra especie aislada fue identificada como Pavlova gyrans (Haptophyta) a partir de sus características morfológicas y estudios moleculares en base al gen nuclear 18s rARN. P. gyrans mostró ser robusta para el crecimiento bajo las condiciones empleadas en el laboratorio. Se ensayaron cultivos en fotobiorreactor a una temperatura óptima (20oC) y bajo EBTEs. Ésta última condición demostró ser efectiva para incrementar la producción de biomasa y LC-PUFAs, particularmente los ácidos grasos EPA y docosapentaenoico (DPA). Además, la presencia de fitoesteroles y pigmentos otorgaron aún más valor a la biomasa. Finalmente, se analizó la calidad de los lípidos teniendo en cuenta indicadores de calidad nutricional de los mismos. P. gyrans mostró valores similares a los reportados para diferentes aceites de pescado por lo que puede considerarse una especie para uso alimentario. En conjunto, estos resultados evidencian el potencial de las cepas nativas C. closterium y P. gyrans como una posible fuente alternativa de LC-PUFAs. / Long-chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFA) are essential nutrients highly demanded by aquaculture, nutraceutical and food industries. Currently, the main source that supplies LC-PUFAs to the industry is fish oil. However, various problems associated with its production make it necessary to search for alternative resources. Certain marine microalgae naturally produce these compounds, emerging as promising alternative sources of LC-PUFA. Furthermore, its synthesis can be modify by manipulating their growth conditions and faced with low temperature conditions, certain species respond by synthesizing even more LC-PUFA. Based on this background, the objective of this Thesis was to isolate native microalgae from the Bahía Blanca Estuary and develop culture strategies involving low temperature stress. The specific objectives were to isolate possible PUFA- producing species and identify them morphologically and molecularly; characterize their growth on a laboratory scale; cultivate them in a photobioreactor under optimal and stressful conditions in terms of temperature, determining their effect on growth parameters, biomass production and quantity, quality and lipid production, with special emphasis on LC-PUFA, and other high-value compounds such as sterols, pigments and/or proteins. Of the three isolated diatom species, a Cylindrotheca closterium was selected as it showed the best results in terms of growth and biomass production. The identity of the strain was confirmed by analysis of the rcbl chloroplast gene. C. closterium cultures were performed in a photobioreactor at 20°C (control), and the temperature was abruptly decreased to 10oC during the exponential growth phase (EBTEx) and the stationary growth phase (EBTEs). The EBTEs condition was the most suitable culture strategy to increase the production of biomass, lipids and LC-PUFAs, particularly in terms of eicosapentaenoic (EPA) and arachidonic (ARA) acids. In turn, the presence of sterols and essential amino acids for aquatic organisms revealed the value of the biomass for its possible use in aquaculture. On the other hand, another isolated species was identified as Pavlova gyrans (Haptophyta) based on its morphological characteristics and molecular studies based on the nuclear 18s rRNA gene. P. gyrans was shown to be robust for growth under laboratory conditions. Cultures were also performed in a photobioreactor at optimal temperature (20oC) and under EBTEs. This last condition proved to be effective in increasing the production of biomass and LC-PUFAs, particularly EPA and docosapentaenoic (DPA) fatty acids. In addition, the presence of phytosterols and pigments added even more value to the biomass. Finally, lipids were analyzed taking into account indicators of nutritional quality. P. gyrans showed similar values to those reported for different fish oils, so it can be considered a species for food use. Taken together, these results show the potential of two native strains, C. closterium and P. gyrans, as alternative sources of LC-PUFAs.

Tesis por compendio / [ES] El rápido crecimiento de la acuicultura ha generado una serie de problemas relacionados con la disponibilidad de ingredientes marinos esenciales en la alimentación de peces, debido a su alto contenido en ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga (LC-PUFAs) omega-3. Una estrategia altamente innovadora para la obtención de nuevos ingredientes ricos en LC-PUFAs, consiste en el cultivo intensivo de organismos que sean capaces de producirlos a partir de fuentes que carecen de éstos, como son los subproductos de industrias agroalimentarias. Este enfoque requiere entender la capacidad biosintética del organismo en cuestión, y cómo ésta se puede modular para aumentar la acumulación de estos compuestos. Esta Tesis Doctoral plantea una serie de estudios dirigidos a esclarecer el potencial de los gamáridos para aplicar esta estrategia. La biosíntesis de LC-PUFAs en animales requiere de la acción coordinada de enzimas elongasas y desaturasas, implicadas en la conversión de ácidos grasos relativamente cortos y poco insaturados, en LC-PUFAs de alto valor nutricional. Así pues, esta Tesis Doctoral ha investigado, por un lado, la presencia y la actividad de genes involucrados en la biosíntesis de LC-PUFAs en gamáridos tanto marinos como dulceacuícolas. Por otro lado, ha estudiado cómo diferentes dietas y temperaturas afectan al metabolismo de ácidos grasos, crecimiento y supervivencia, en el gamárido marino Gammarus locusta, tanto a nivel fisiológico y composicional, como a nivel molecular. Los resultados de la primera parte demuestran que los gamáridos tienen varias elongasas, pero carecen de desaturasas. Se identificaron tres tipos de elongasas (elovl4, elovl6, y elovl1/7-like) en el gamárido marino Echinogammarus marinus, siendo elovl4 y elovl1/7-like clave para la elongación de LC-PUFAs. Este mismo patrón de elongasas se repite también para los gamáridos dulceacuícolas. Sorprendentemente, se han encontrado desaturasas front-end (fed), methyl-end (wx-des), y una elongasa del tipo Elovl2/5 únicamente en transcriptomas de gamáridos dulceacuícolas. Posteriores análisis moleculares y filogenéticos han podido determinar que estas secuencias fed, wx-des, y elovl2/5 son propias de rotíferos bdeloideos, epibiontes de gamáridos dulceacuícolas. Estos hallazgos, más allá de apuntar el potencial biosintético de los rotíferos bdeloideos, revela una relación constante entre éstos y los gamáridos en ecosistemas dulceacuícolas. La segunda parte de la Tesis analiza cómo dieta y temperatura modulan el metabolismo de ácidos grasos, crecimiento y supervivencia en Gammarus locusta. Los resultados han mostrado que G. locusta experimenta un mayor crecimiento, aunque también mayores tasas de mortalidad, cuando se cultiva a temperaturas elevadas. La mortalidad en G. locusta también aumenta cuando este se alimenta con una dieta rica en ácidos grasos saturados (SFAs) y carente de LC-PUFAs. Los perfiles de ácidos grasos en gamáridos reflejan las dietas consumidas, independientemente de la temperatura; aunque cabe destacar que los gamáridos alimentados con dietas carentes de LC-PUFAs conservan niveles apreciables de estos compuestos en sus lípidos corporales. A nivel molecular, una dieta sin LC-PUFAs y rica en SFAs disminuye el catabolismo de ácidos grasos y favorece su acumulación modulando la expresión de genes involucrados en estos procesos. Además, estas mismas condiciones afectan negativamente el desarrollo y supervivencia al influir en genes relacionados con el ciclo de muda. Además, se ha observado que temperaturas altas aceleran el desarrollo e incrementan la mortalidad. Según estos resultados, puede concluirse que las temperaturas elevadas y dietas carentes de LC-PUFAs no son adecuadas para el cultivo de G. locusta cuando el objetivo final es la obtención de biomasa rica en estos compuestos, ya que dichas condiciones afectan negativamente al perfil nutricional del animal y a su supervivencia. / [CA] El ràpid creixement de l'aqüicultura ha generat una sèrie de problemes relacionats amb la disponibilitat d'ingredients marins essencials en l'alimentació de peixos, a causa del seu alt contingut en àcids grassos poliinsaturats de cadena llarga (LC-PUFAs) omega-3. Una estratègia altament innovadora per a l'obtenció de nous ingredients rics en LC-PUFAs, consistix en el cultiu intensiu d'organismes que siguen capaços de produir-los a partir de fonts que no els ténen, com són els subproductes d'indústries agroalimentàries. Aquesta estratègia requerix entendre la capacitat biosintètica de l'organisme en qüestió, i com aquesta es pot modular per a augmentar l'acumulació d'estos compostos. Esta Tesi Doctoral planteja una sèrie d'estudis dirigits a esclarir el potencial dels gammàrids per a aplicar esta estratègia. La biosíntesi de LC-PUFAs en animals requerix de l'acció coordinada d'enzims elongases i desaturases, implicats en la conversió d'àcids grassos relativament curts i poc insaturats, en LC-PUFAs d'alt valor nutricional. Així doncs, esta Tesi Doctoral ha investigat, d'una banda, la presència i l'activitat de gens involucrats en la biosíntesi de LC-PUFAs en gammàrids tant marins com dulciaqüícoles. D'altra banda, ha estudiat com diferents dietes i temperatures afecten el metabolisme d'àcids grassos, creixement i supervivència, en el gammàrid marí Gammarus locusta, tant a nivell fisiològic i composicional, com a nivell molecular. Els resultats de la primera part demostren que els gammàrids ténen diverses elongases, però manquen de desaturases. Es van identificar tres tipus d'elongases (elovl4, elovl6, i elovl1/7-like) en el gammàrid marí Echinogammarus marinus, sent elovl4 i elovl1/7-like clau per a l'elongació de LC-PUFAs. Este mateix patró d'elongases es repetix també per als gammàrids dulciaqüícoles. Sorprenentment, s'han trobat desaturases front-end (fed), methyl-end (wx-des), i una elongasa del tipus Elovl2/5 únicament en transcriptomes de gammàrids dulciaqüícoles. Posteriors anàlisis moleculars i filogenètics han pogut determinar que estes seqüències fed, wx-des, i elovl2/5 són pròpies de rotífers bdeloides, epibionts de gammàrids dulciaqüícoles. Estes troballes, més enllà d'apuntar el potencial biosintètic dels rotífers bdeloides, revela una relació constant entre estos i els gammàrids en ecosistemes dulciaqüícoles. La segona part de la Tesi analitza com dieta i temperatura modulen el metabolisme d'àcids grassos, creixement i supervivència en Gammarus locusta. Els resultats han mostrat que G. locusta experimenta un major creixement, encara que també majors taxes de mortalitat, quan es cultiva a temperatures elevades. La mortalitat en G. locusta també augmenta quan este s'alimenta amb una dieta rica en àcids grassos saturats (SFAs) i sense LC-PUFAs. Els perfils d'àcids grassos en gammàrids reflectixen les dietes consumides, independentment de la temperatura; encara que cal destacar que els gamàrids alimentats amb dietes mancants de LC-PUFAs conserven nivells apreciables d'estos compostos en els seus lípids corporals. A nivell molecular, una dieta sense LC-PUFAs i rica en SFAs disminuïx el catabolisme d'àcids grassos i afavorix la seua acumulació modulant l'expressió de gens involucrats en estos processos. A més, estes mateixes condicions afecten negativament el desenvolupament i supervivència al influir en gens relacionats amb el cicle de muda. A més, s'ha observat que temperatures altes acceleren el desenvolupament i incrementen la mortalitat. Segons estos resultats, pot concloure's que les temperatures elevades i dietes mancants de LC-PUFAs no són adequades per al cultiu de G. locusta quan l'objectiu final és l'obtenció de biomassa rica en estos compostos, ja que estes condicions afecten negativament el perfil nutricional de l'animal i a la seua supervivència. / [EN] The rapid growth of aquaculture has generated a series of problems related to the availability of essential marine ingredients in fish feed, due to their high content of omega-3 long-chain polyunsaturated fatty acids (LC-PUFAs). A highly innovative strategy for obtaining new ingredients rich in LC-PUFAs relies on the intensive culture of organisms that are capable of producing LC-PUFAs from sources that lack them, such as the by-products of agri-food industries. This approach requires understanding the biosynthetic capacity of the organism, and how this can be modulated to increase the accumulation of these compounds. This Doctoral Thesis proposes a series of studies aimed at clarifying the potential of gammarids to apply this strategy. LC-PUFA biosynthesis requires the coordinated action of elongase and desaturase enzymes, involved in the conversion of relatively short and poorly unsaturated fatty acids into LC-PUFAs of high nutritional value. Thus, this Doctoral Thesis has investigated, on one hand, the presence and activity of genes involved in the LC-PUFAs biosynthesis in both marine and freshwater gammarids. On the other hand, we have studied how different diets and temperatures affect fatty acid metabolism, growth and survival, in the marine gammarid Gammarus locusta, both at a physiological and compositional level, and at a molecular level. The results of the first part demonstrate that gammarids have several elongases, but lack desaturases. Three types of elongases (elovl4, elovl6, and elovl1/7-like) were identified in the marine gammarid Echinogammarus marinus, being elovl4 and elovl1/7-like key for LC-PUFA elongation. This same pattern of elongases is also present in their freshwater counterparts. Surprisingly, front-end desaturases (fed), methyl-end (wx-des), and an Elovl2/5-type elongase have been found only in transcriptomes built from freshwater gammarids. Subsequent molecular and phylogenetic analyses have been able to determine that these fed, wx-des, and elovl2/5 sequences are typical of bdelloid rotifers, which are epibionts of freshwater gammarids. These findings, beyond pointing out the biosynthetic potential of bdelloid rotifers, reveal a constant relationship between them and gammarids in freshwater ecosystems. The second part of the Thesis focuses on how diet and temperature modulate fatty acid metabolism, growth and survival in Gammarus locusta. The results have shown that G. locusta experiences greater growth, but also higher mortality rates, when grown at higher temperatures. Mortality in G. locusta also increases when it is fed with a diet rich in saturated fatty acids (SFAs) and lacking LC-PUFAs. Fatty acid profiles in gammarids reflect the diets consumed, regardless of temperature; although it is worth noting that gammarids fed with diets lacking LC-PUFAs still show levels of these compounds in their body lipids. At a molecular level, a diet lacking LC-PUFAs and rich in SFAs decreases the catabolism of fatty acids and enhances their accumulation by modulating the expression of genes involved in these processes. Furthermore, these same conditions negatively affect development and survival by influencing genes related to the molting cycle. In addition, it has been observed that higher temperatures accelerate development and increase mortality. According to these results, it can be concluded that higher temperatures and diets lacking LC-PUFAs are not suitable for the culture of G. locusta when the final outcome is to obtain a biomass rich in these compounds, since these conditions negatively affect the nutritional profile of the animal and its survival. / This research was supported by the ERA-NET BlueBio COFUND Project SIDESTREAM (Grant ID 68), co-funded through national funds provided by the Agencia Estatal de Investigación, Spain, grant no. PCI2020-111960/MCIN/AEI/10.13039/501100011033, the German Federal Ministry of Education and Research (BMBF), FKZ161B0950B, and the Fundação para a Ciência e a Tecnologia, Por- tugal (BLUEBIO/0005/2019). Additional funding was received through the project IMPROMEGA Agencia Española de Investigación, Spain, grant no. RTI2018-095119-B-100, MCIU/AEI/FEDER/UE/ MCIN/AEI/10.13039/501100011033/ and FEDER ‘A way to make Europe / Ribes Navarro, A. (2024). Biosíntesis de ácidos grasos poliinsaturados de cadena larga en gamáridos [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/207006 / Compendio