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Die Redoxsensitivität des humanen La Protein (SS-B)Michalk, Irene 12 January 2016 (has links) (PDF)
Vor zirka 45 Jahren wurde das La Protein (SS-B) erstmals als Autoantigen von Patienten mit Systemischen Lupus Erythematodes (SLE) oder Primären Sjögren’s Syndrom beschrieben. Jahrzehntelange Forschungen befassten sich mit seiner Struktur- und Funktionsaufklärung, sowie der Untersuchung von monoklonalen anti-La Antikörpern (anti-La mAK). Doch noch immer werfen nukleäre Antigene wie das La Protein und die gegen sie gerichteten Autoantikörper verschiedene Fragen auf. Diese betreffen besonders deren Entstehung und die pathophysiologische Bedeutung.
So war es die Zielsetzung dieser Arbeit, die pathophysiologische Bedeutung des La Proteins in der Autoimmunkrankheit und der Krankheitsentstehung bei SLE-Patienten weiter aufzuklären. Im Zentrum der Untersuchungen stand dabei die Redoxsensitivität des La Proteins und deren Einfluss auf die räumliche Proteinstruktur, die zelluläre Lokalisation, die Funktion der Nukleinsäurebindung, sowie die Antigenität. Dabei konnte erstmals mit Hilfe von CD-Spektroskopieanalysen deutlich gezeigt werden, dass die drei Cysteine (C18, C232 und C245) des La Proteins für die Struktur eine zentrale Rolle spielen.
Es konnte demonstriert werden, dass die Fähigkeit zur redoxabhängigen Strukturumfaltung zum Verlust der protektiven Wirkung des La Proteins auf gebundene Nukleinsäure führt, wodurch diese für Nukleasen zugänglich gemacht wird und abgebaut werden kann. Dies ließ sich in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe verschiedener Experimente verifizieren, beispielsweise durch die Anwesenheit von Kupferionen (Cu2+), oder auch durch die Änderung des pH-Wertes von 7,0 auf 4,5. Parallel hierzu wurden neben Wildtyp La Protein auch verschiedene Cysteinmutanten getestet, um die Redoxabhängigkeit auch durch den Austausch der Cysteine C18, C232 und C245 zu zeigen.
Die Änderungen des Redoxzustands beeinflussten jedoch nicht nur Sekundär- und Tertiär-struktur des La Proteins, sondern auch sein Di- und Oligomerisationsverhalten, sowie die Antigenerkennung durch bestimmte anti-La mAK (mAK der 312B Gruppe). Erstmals konnte in dieser Arbeit auch gezeigt werden, dass Patientenautoantikörper nicht nur gegen die nor-malerweise nukleär vorliegende, reduzierte Form des La Proteins existieren. Es waren eben-so Patientenautoantikörper gegen die zytoplasmatische, oxidierte Form nachweisbar.
Auch auf zellulärer Ebene wurde die Wirkung einer redoxabhängigen Umfaltung des La Proteins deutlich. Durch den Einfluss von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) konnte eine zytoplasmatische Anreicherung beobachtet werden. Die dazu bereits bekannten Daten aus der Literatur konnten mit dieser Arbeit nochmals belegt und darüber hinaus ergänzt werden. Die zytoplasmatische Anreicherung wurde in der vorliegenden Arbeit für verschiedene ROS Stimuli gezeigt, darunter H2O2, Cu(II)SO4, Fe(II)Cl2 und darüber hinaus auch für NO-Glutathion (Stimulus reaktiver Stickstoffspezies NO). Des Weiteren konnte erstmals eine zytoplasmatische La Anreicherung durch eine Veränderung des intrazellulären ROS Levels nach Rezeptorstimulation gezeigt werden. Spannender Weise gelang dies für dendritische Zellen, wie moDCs und slanDCs, als auch für Endothelzellen (HUVECs). Die Induktion erfolgte dabei über Toll-like Rezeptoren (TLR), wie TLR4 (LPS-abhängiger Toll-like Rezeptor) und auch über TLR7/8, zwei Toll-like Rezeptoren, die für die Bindung von ssRNA, beispielsweise nach Virusinfektion zuständig sind.
Unter dem Einfluss dieser Stimuli, kommt es zur Umfaltung des La Proteins, zum Loslösen von seinem potentiellen, indirekt über den anti-La mAK 7B6 nachgewiesenen Bindepartner und zum Verlust der nukleären Lokalisation. Im Zytoplasma kann die oxidierte Proteinvariante ihre protektive Aufgabe bezüglich der gebundenen Nukleinsäure nicht weiter ausführen. Es kommt unter normalen Umständen zu Dissoziation der gebundenen Nukleinsäuren und einem potentiellen Abbau dieser. Da bei Autoimmunpatienten jedoch sehr häufig eine Reduktion der Nukleaseaktivität nachweisbar ist, könnte der Nukleinsäureabbau in diesen Patienten gestört sein, was zu einem oxidierten La Protein mit noch gebundener Nukleinsäure führen würde.
Neben der zytoplasmatischen Lokalisation wurde für das La Protein auch eine Lokalisation an der Zelloberfläche diskutiert. Die hier durchgeführten Studien mit den verschiedenen Sauerstoff- oder Stickstoffstressstimuli zeigten jedoch unter den gewählten Bedingungen keine Exposition des La Proteins auf die Zelloberfläche. Daher wurden apoptotische und nekrotische Zellen als mögliche La Proteinquelle für die Dekoration lebender Nachbarzellen untersucht. War in der Literatur noch über „apototic bodies“ als Quelle des La Proteins als Autoantigen spekuliert wurden, so konnte hier gezeigt werden, dass das La Protein aus humanen, apoptotischem Zellmaterial zu keiner nachweislichen Oberflächendekoration lebender Zellen führte. Anders verhielt es sich bei nekrotischem Zellmaterial. Hier konnte zum Beispiel humanes oxidiertes La Protein auf den murinen Zellen nachgewiesen werden.
Im Rahmen dieser Analysen zeigte sich darüber hinaus, dass sowohl oxidiertes als auch reduziertes La Protein auf die Oberfläche verschiedener Zelltypen binden kann. Insgesamt konnte jedoch mehr oxidiertes La Protein auf den verschiedensten Zellentypen nachge-wiesen werden, als reduziertes La Protein unter gleichen Bedingungen. Auch ergaben sich Unterschiede bezüglich der Proteinbindung zwischen einzelnen Zelltypen. Vertreter von Anti-gen präsentierenden Zellen, wie Monozyten oder B-Zellen (Radji), sowie Endothelzellen (HUVECs), aber auch murine A9 Fibroblasten konnten im Vergleich zu T-Zellen und NK-Zellen, mehr La Protein auf ihrer Oberfläche binden. Diese Resultate lassen eine pathophysiologische Bedeutung des La Proteins bei SLE Patienten erkennen. Im Zuge von Zellschä-digungen, wie beispielsweise nach UV-Stress, kommt es zu einem nekrotischen Zellzerfall. Dieser führt zur Freisetzung von oxidiertem La Protein, welches auf benachbarte Zellen bindet. Dadurch können sie zum Ziel einer komplementsystemvermittelten Immunreaktion, sowie einer antikörpervermittelten, NK-Zellen gestützten Zelllyse (ADCC) werden.
Für die Initiation einer Immunantwort, und im Besonderen für die Reifung autoreaktiver B-Zellen zu autoantikörpernproduzierenden Plasmazellen, bedarf es jedoch zunächst einer Aktivierung von dendritischen Zellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass lösliches La Protein dendritische Zellen aktivieren kann, belegt über die dokumentierte, finale TNFα Sekretion. Dabei war jedoch nicht entscheidend, ob La in einem reduzierten oder oxidierten Zustand vorlag, sondern das es assoziierte Nukleinsäuren aufwies. Experimentell führten an La Protein gebundene Nukleinsäuren zur Aktivierung von dendritischen Zellen (slanDCs). Wurde die Nukleinsäuren jedoch zuvor durch RNaseA Behandlung oder die Inkubation in Serum eines gesunden Spenders abgebaut, so lag keine oder eine nur sehr geringe Aktivierung von slanDCs vor. Eine Inkubation von La Protein in SLE Patientenserum hatte keine solche verminderte Aktivierung dendritischer Zellen zur Folge. Unter Berücksich-tigung der oben geschilderten Versuchsergebnisse ließ sich dieses Resultat mit der geringeren Nukleaseaktivität bei SLE Patienten begründen, was bereits aus der Literatur bekannt ist. Diese reduzierte Nukleaseaktivität stellt somit offensichtlich einen entscheidenden Faktor bei der Aktivierung einer Autoimmunantwort in Zusammenhang mit dem La Protein und anti-La Autoantikörpern dar.
Mit dieser Arbeit konnte also eindeutig gezeigt werden, dass das La Protein unter sich wechselnden Redoxbedingungen seine Struktur ändert. Dabei spielen die drei enthaltenden Cysteine eine bedeutende Rolle. Derartige Strukturveränderungen beeinflussen die Nukleinsäureschutzfunktion und die Erkennung durch Antikörper. Darüber hinaus bestätigte sich eine ROS induzierte Anreicherung von La im Zytoplasma. Auch die Fähigkeit des La Proteins, aus nekrotischem Zellmaterial auf die Oberflächen von lebenden Zellen zu binden, wurde gezeigt. Dadurch wäre es für Autoantikörper bei SLE Patienten zugänglich und somit pathophysiologisch relevant. Außerdem konnte auch die Eigenschaft von nukleinsäurege-koppelten La Proteins zur Aktivierung dendritischer Zellen belegt werden, was zur krankheitsauslösenden Aktivierung von autoreaktiven T- und im weiteren Verlauf von B-Zellen führen kann. Dadurch konnten die in dieser Arbeit erhaltenen Resultate deutliche Hinweise auf die pathophysiologische Bedeutung des La Proteins, nicht nur während der Autoimmunerkrankung, sondern auch für die Frühphase der Krankheitsentstehung, geben.
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Die Redoxsensitivität des humanen La Protein (SS-B): Analysen zu deren Einfluss auf Proteinstruktur, Funktion, Antigenität und ZelllokalisationMichalk, Irene 16 December 2015 (has links)
Vor zirka 45 Jahren wurde das La Protein (SS-B) erstmals als Autoantigen von Patienten mit Systemischen Lupus Erythematodes (SLE) oder Primären Sjögren’s Syndrom beschrieben. Jahrzehntelange Forschungen befassten sich mit seiner Struktur- und Funktionsaufklärung, sowie der Untersuchung von monoklonalen anti-La Antikörpern (anti-La mAK). Doch noch immer werfen nukleäre Antigene wie das La Protein und die gegen sie gerichteten Autoantikörper verschiedene Fragen auf. Diese betreffen besonders deren Entstehung und die pathophysiologische Bedeutung.
So war es die Zielsetzung dieser Arbeit, die pathophysiologische Bedeutung des La Proteins in der Autoimmunkrankheit und der Krankheitsentstehung bei SLE-Patienten weiter aufzuklären. Im Zentrum der Untersuchungen stand dabei die Redoxsensitivität des La Proteins und deren Einfluss auf die räumliche Proteinstruktur, die zelluläre Lokalisation, die Funktion der Nukleinsäurebindung, sowie die Antigenität. Dabei konnte erstmals mit Hilfe von CD-Spektroskopieanalysen deutlich gezeigt werden, dass die drei Cysteine (C18, C232 und C245) des La Proteins für die Struktur eine zentrale Rolle spielen.
Es konnte demonstriert werden, dass die Fähigkeit zur redoxabhängigen Strukturumfaltung zum Verlust der protektiven Wirkung des La Proteins auf gebundene Nukleinsäure führt, wodurch diese für Nukleasen zugänglich gemacht wird und abgebaut werden kann. Dies ließ sich in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe verschiedener Experimente verifizieren, beispielsweise durch die Anwesenheit von Kupferionen (Cu2+), oder auch durch die Änderung des pH-Wertes von 7,0 auf 4,5. Parallel hierzu wurden neben Wildtyp La Protein auch verschiedene Cysteinmutanten getestet, um die Redoxabhängigkeit auch durch den Austausch der Cysteine C18, C232 und C245 zu zeigen.
Die Änderungen des Redoxzustands beeinflussten jedoch nicht nur Sekundär- und Tertiär-struktur des La Proteins, sondern auch sein Di- und Oligomerisationsverhalten, sowie die Antigenerkennung durch bestimmte anti-La mAK (mAK der 312B Gruppe). Erstmals konnte in dieser Arbeit auch gezeigt werden, dass Patientenautoantikörper nicht nur gegen die nor-malerweise nukleär vorliegende, reduzierte Form des La Proteins existieren. Es waren eben-so Patientenautoantikörper gegen die zytoplasmatische, oxidierte Form nachweisbar.
Auch auf zellulärer Ebene wurde die Wirkung einer redoxabhängigen Umfaltung des La Proteins deutlich. Durch den Einfluss von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) konnte eine zytoplasmatische Anreicherung beobachtet werden. Die dazu bereits bekannten Daten aus der Literatur konnten mit dieser Arbeit nochmals belegt und darüber hinaus ergänzt werden. Die zytoplasmatische Anreicherung wurde in der vorliegenden Arbeit für verschiedene ROS Stimuli gezeigt, darunter H2O2, Cu(II)SO4, Fe(II)Cl2 und darüber hinaus auch für NO-Glutathion (Stimulus reaktiver Stickstoffspezies NO). Des Weiteren konnte erstmals eine zytoplasmatische La Anreicherung durch eine Veränderung des intrazellulären ROS Levels nach Rezeptorstimulation gezeigt werden. Spannender Weise gelang dies für dendritische Zellen, wie moDCs und slanDCs, als auch für Endothelzellen (HUVECs). Die Induktion erfolgte dabei über Toll-like Rezeptoren (TLR), wie TLR4 (LPS-abhängiger Toll-like Rezeptor) und auch über TLR7/8, zwei Toll-like Rezeptoren, die für die Bindung von ssRNA, beispielsweise nach Virusinfektion zuständig sind.
Unter dem Einfluss dieser Stimuli, kommt es zur Umfaltung des La Proteins, zum Loslösen von seinem potentiellen, indirekt über den anti-La mAK 7B6 nachgewiesenen Bindepartner und zum Verlust der nukleären Lokalisation. Im Zytoplasma kann die oxidierte Proteinvariante ihre protektive Aufgabe bezüglich der gebundenen Nukleinsäure nicht weiter ausführen. Es kommt unter normalen Umständen zu Dissoziation der gebundenen Nukleinsäuren und einem potentiellen Abbau dieser. Da bei Autoimmunpatienten jedoch sehr häufig eine Reduktion der Nukleaseaktivität nachweisbar ist, könnte der Nukleinsäureabbau in diesen Patienten gestört sein, was zu einem oxidierten La Protein mit noch gebundener Nukleinsäure führen würde.
Neben der zytoplasmatischen Lokalisation wurde für das La Protein auch eine Lokalisation an der Zelloberfläche diskutiert. Die hier durchgeführten Studien mit den verschiedenen Sauerstoff- oder Stickstoffstressstimuli zeigten jedoch unter den gewählten Bedingungen keine Exposition des La Proteins auf die Zelloberfläche. Daher wurden apoptotische und nekrotische Zellen als mögliche La Proteinquelle für die Dekoration lebender Nachbarzellen untersucht. War in der Literatur noch über „apototic bodies“ als Quelle des La Proteins als Autoantigen spekuliert wurden, so konnte hier gezeigt werden, dass das La Protein aus humanen, apoptotischem Zellmaterial zu keiner nachweislichen Oberflächendekoration lebender Zellen führte. Anders verhielt es sich bei nekrotischem Zellmaterial. Hier konnte zum Beispiel humanes oxidiertes La Protein auf den murinen Zellen nachgewiesen werden.
Im Rahmen dieser Analysen zeigte sich darüber hinaus, dass sowohl oxidiertes als auch reduziertes La Protein auf die Oberfläche verschiedener Zelltypen binden kann. Insgesamt konnte jedoch mehr oxidiertes La Protein auf den verschiedensten Zellentypen nachge-wiesen werden, als reduziertes La Protein unter gleichen Bedingungen. Auch ergaben sich Unterschiede bezüglich der Proteinbindung zwischen einzelnen Zelltypen. Vertreter von Anti-gen präsentierenden Zellen, wie Monozyten oder B-Zellen (Radji), sowie Endothelzellen (HUVECs), aber auch murine A9 Fibroblasten konnten im Vergleich zu T-Zellen und NK-Zellen, mehr La Protein auf ihrer Oberfläche binden. Diese Resultate lassen eine pathophysiologische Bedeutung des La Proteins bei SLE Patienten erkennen. Im Zuge von Zellschä-digungen, wie beispielsweise nach UV-Stress, kommt es zu einem nekrotischen Zellzerfall. Dieser führt zur Freisetzung von oxidiertem La Protein, welches auf benachbarte Zellen bindet. Dadurch können sie zum Ziel einer komplementsystemvermittelten Immunreaktion, sowie einer antikörpervermittelten, NK-Zellen gestützten Zelllyse (ADCC) werden.
Für die Initiation einer Immunantwort, und im Besonderen für die Reifung autoreaktiver B-Zellen zu autoantikörpernproduzierenden Plasmazellen, bedarf es jedoch zunächst einer Aktivierung von dendritischen Zellen. Im Rahmen dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass lösliches La Protein dendritische Zellen aktivieren kann, belegt über die dokumentierte, finale TNFα Sekretion. Dabei war jedoch nicht entscheidend, ob La in einem reduzierten oder oxidierten Zustand vorlag, sondern das es assoziierte Nukleinsäuren aufwies. Experimentell führten an La Protein gebundene Nukleinsäuren zur Aktivierung von dendritischen Zellen (slanDCs). Wurde die Nukleinsäuren jedoch zuvor durch RNaseA Behandlung oder die Inkubation in Serum eines gesunden Spenders abgebaut, so lag keine oder eine nur sehr geringe Aktivierung von slanDCs vor. Eine Inkubation von La Protein in SLE Patientenserum hatte keine solche verminderte Aktivierung dendritischer Zellen zur Folge. Unter Berücksich-tigung der oben geschilderten Versuchsergebnisse ließ sich dieses Resultat mit der geringeren Nukleaseaktivität bei SLE Patienten begründen, was bereits aus der Literatur bekannt ist. Diese reduzierte Nukleaseaktivität stellt somit offensichtlich einen entscheidenden Faktor bei der Aktivierung einer Autoimmunantwort in Zusammenhang mit dem La Protein und anti-La Autoantikörpern dar.
Mit dieser Arbeit konnte also eindeutig gezeigt werden, dass das La Protein unter sich wechselnden Redoxbedingungen seine Struktur ändert. Dabei spielen die drei enthaltenden Cysteine eine bedeutende Rolle. Derartige Strukturveränderungen beeinflussen die Nukleinsäureschutzfunktion und die Erkennung durch Antikörper. Darüber hinaus bestätigte sich eine ROS induzierte Anreicherung von La im Zytoplasma. Auch die Fähigkeit des La Proteins, aus nekrotischem Zellmaterial auf die Oberflächen von lebenden Zellen zu binden, wurde gezeigt. Dadurch wäre es für Autoantikörper bei SLE Patienten zugänglich und somit pathophysiologisch relevant. Außerdem konnte auch die Eigenschaft von nukleinsäurege-koppelten La Proteins zur Aktivierung dendritischer Zellen belegt werden, was zur krankheitsauslösenden Aktivierung von autoreaktiven T- und im weiteren Verlauf von B-Zellen führen kann. Dadurch konnten die in dieser Arbeit erhaltenen Resultate deutliche Hinweise auf die pathophysiologische Bedeutung des La Proteins, nicht nur während der Autoimmunerkrankung, sondern auch für die Frühphase der Krankheitsentstehung, geben.
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Aktivierungsfähigkeit von myeloiden dendritischen Zellen durch das Lupus-Autoantigen La/SS-BLudwig, Florian 03 April 2019 (has links)
Der systemische Lupus erythematodes (SLE) ist der Prototyp einer systemischen Autoimmunkrankheit, bei dem neben leichteren Verläufen mit spontan remittierendem Hautausschlag und Gelenkschmerzen häufig eine Nierenbeteiligung in Form der Glomerulonephritis vorkommt. Eine weitere Autoimmunerkrankung ist das Sjögren-Syndrom, bei der exokrine Drüsen befallen werden und v. a. zu anhaltender Mund- und Augen-trockenheit führen. Beide Erkrankungen gehören zu den Kollagenosen (Bindegewebs-erkrankung), bei denen organunspezifische Autoantikörper gegen Zellkernmaterial (anti-nukleäre Antikörper) zur Diagnosefindung beitragen. Eines der Antigene nennt sich La/SS-B (Sjögren-Syndrom-B), es wird bei 70 % der Sjögren-Syndrom- und 25 % der SLE-Patienten registriert. Im Rahmen von Zelluntergang wie bei Infektionen oder UV-Licht-Exposition, wenn La/SS-B extrazellulär für das Immunsystem zugänglich wird, kommt es zu Krankheitsschüben von SLE. La/SS-B ist bei fast allen Eukaryonten ein essentielles Kernprotein, das Nukleinsäuren, v. a. RNA, und in gewissem Grad auch DNA binden kann. Beim Menschen hat es eine wichtige Funktion in der Bindung von RNA-Polymerase III-Transkripten. Das Protein besteht funktionell aus einem N- und einem C-Terminus. Der N-Terminus beinhaltet das La-Motiv und das RRM1 (RNA recognition motif 1, RNA-Erkennungmotiv). Es kann davon ausgegangen werden, dass im Rahmen der Erkrankungen in einer oder mehrerer Phasen dendritische Zellen des Immunsystems mit dem Protein in Kontakt treten, da diese zentralen Zellen des Immunsystems für die Bildung von Antikörpern essenziell sind. 6 sulfo LacNAc+ dendritische Zellen (slanDC) sind die proinflammatorische Hauptpopulation myeloider dendritischer Zellen (mDC) und produzieren bei Stimulation große Mengen Tumornekrosefaktor α (TNF α). Sie besitzen wie alle mDCs keinen TLR9 (toll-like receptor, Toll-ähnlicher Rezeptor), der durch CpG-reiche, bakterielle DNA aktiviert würde, dafür aber solche TLRs, die zu einer Aktivierung der slanDCs u. a. durch bakterielle RNA oder Lipopolysaccharide (LPS) führen.
Eine entscheidende Frage ist, warum es zur Bildung von Autoantikörpern gegen das Kern- und RNA-Bindeprotein La kommt und ob La-Autoantikörper eine Begleiterscheinung sind oder ob es tatsächlich immunstimulierende Formen von La gibt. Da La ein Nukleinsäure-bindendes Protein ist, ist eine Assoziation mit bakteriellen Nukleinsäuren nach prokaryontischer Herstellung wie in dieser Arbeit wahrscheinlich. Da der N-Terminus des La-Proteins die RNA-Bindedomäne enthält, wurde dieser näher untersucht. Die Stimulierbarkeit von DCs durch La ist noch unzureichend erforscht. In dieser Arbeit wurde repräsentativ die Stimulierbarkeit von slanDCs durch La/SS-B nach Aufreinigung durch zwei variierende Verfahren untersucht. Zu prüfen war, ob und in welchem Umfang die gebundenen Nukleinsäuren Einfluss auf die Aktivierungsfähigkeit haben.
La-Protein wurde prokaryontisch rekombinant in E. coli-Bakterien hergestellt und mit Nickel-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Durch Einbau eines Stopcodons konnte zusätzlich der N-terminale Teil von La (LaN) separat hergestellt werden. Bei einer erneuten Aufreinigung wurde das Aufreinigungsverfahren um einen DNase-/RNase-Verdau erweitert. Um gebundene Nukleinsäuren nachzuweisen und zu messen wurden UV-Spektren der aufgereinigten Proteine bei 220–300 nm angefertigt. Zudem erfolgten Fluoreszenzfärbungen mit RiboGreen®, welches auf Nukleinsäuren reagiert. Für verschiedene Referenzversuche und Vergleiche wurden E. coli- und eukaryontische RNA mit TriPure Isolation Reagent und Chloroform isoliert. Die slanDCs wurden über magnetischer Zellseparierung aus PBMCs isoliert, die zuvor aus buffy coats mittels Ficoll-Dichtezentrifugation gewonnen wurden. Sie wurden bei Raumtemperatur 24 Stunden kultiviert, die Probenzugabe erfolgte 4 Stunden nach Kulturbeginn. Im Überstand wurde die TNF α-Konzentration mittels ELISA bestimmt.
Nach erfolgter Aufreinigung bestätigten Westernblots die Identität der Proteine La und LaN. Die UV-Spektren ergaben Protein-Nukleinsäure-Mischspektren, der Nukleasen-verdau verringerte jedoch den gebundenen Nukleinsäure-Anteil. RiboGreen®-Probefärbungen verschiedener Nukleinsäuren sowie Verdauungsversuche mit Nuklease zeigten eine Inhomogenität der Fluoreszenzintensitäten abhängig von der Art und Länge der Nukleinsäure. Dadurch war eine korrekte Quantifizierung des La-gebundenen bakteriellen Nukleinsäure-Gemischs nicht möglich. Trotzdem konnte beim getrennten Verdau mit DNase und RNase die Nukleinsäure an La-Protein als größtenteils RNA, an LaN als fast ausschließlich RNA identifiziert werden. In den slanDC-Aktivierungsversuchen erwiesen sich sowohl 5 pmol La-Volllänge als auch 5 pmol von dessen seperatem N-Terminus als potente Stimulatoren. Die Nuklease-verdauten Varianten von La und LaN waren signifikant weniger immunstimulierend. Selbst 50 pmol Nuklease-behandeltes La führten zu weniger TNF α-Produktion als 5 pmol unbehandeltes La. In einem Kontrollversuch war aufgereinigter E. coli-RNA ebenfalls stimulierend, eukaryontische RNA hingegen nicht. CpG-DNA führte ebenfalls zu keiner Aktivierung von slanDCs. Reassoziationsversuche von Nuklease-behandeltem N-terminalen La-Protein mit eukaryontischer RNA konnten keine immunstimulierende Wirkung hervorrufen.
Es kann aus den Versuchen mit slanDCs geschlossen werden, dass an La gebundene bakterielle Nukleinsäuren für die Aktivierung der Immunzellen hauptverantwortlich waren. Mit großer Wahrscheinlichkeit beruht die Aktivierung auf RNA. Einerseits wurde v. a. RNA in den Proteinaufreinigungen nachgewiesen, andererseits tragen mDCs keinen TLR9 zur DNA-Erkennung. Diese Arbeit wirft die Frage auf, ob dem Protein La/SS B eine Funktion als Alarmin innewohnt, ähnlich dem Protein LL 37, das selbst das Immunsystem nicht stimuliert, aber körpereigene DNA komplexieren und dadurch in eine autostimulierende Form verwandeln kann. Möglicherweise wird durch Zellschaden freigewordenes La durch gleichzeitig vorhandene körperfremde Nukleinsäuren in Immunzellen geschleust, um auf diesem Weg die Immuntoleranz zu durchbrechen. Nachdem in dieser Arbeit offenbar die Nukleinsäuren für die Aktivierung von slanDCs verantwortlich waren, könnte in weiterführenden Versuchen an isolierten T Helferzellen oder an murinen T-Zellen in vivo untersucht werden, ob sie durch Stimulation mit La-aktivierten DCs tatsächlich auf La-Protein geprimt (priming, Prägung) werden. Zudem wird die Vermutung aufgeworfen, ob extrazelluläres La während einer bakteriellen Infektion deren Nukleinsäuren stabilisiert und vor Nukleasen schützt. Dadurch vermehrt auftretende extrazelluläre bakterielle Nukleinsäure könnte einen SLE-Schub auslösen, was für SLE charakteristisch wäre.:Inhaltsverzeichnis 3
Abbildungsverzeichnis 6
Tabellenverzeichnis 8
Abkürzungsverzeichnis 9
1. Einleitung 13
1.1 Das menschliche Immunsystem 13
1.1.1 Die zentrale Rolle dendritischer Zellen bei der Einleitung der Immunantwort 14
1.1.2 Die besondere Rolle dendritischer Zellen bei der spezifischen Immunantwort 15
1.1.3 SlanDCs, eine neue Gruppe dendritischer Zellen 17
1.1.4 Überempfindlichkeitsreaktionen des Immunsystems 18
1.2 Systemischer Lupus Erythematodes (SLE) 18
1.2.1 Allgemeines und Epidemiologie 18
1.2.2 Aspekte zur Pathogenese 20
1.3 Das Autoantigen La/SS B 23
1.4 Die Rolle von Nukleinsäuren bei autoimmunen Prozessen 26
1.5 Zielstellung 28
2. Materialien 30
2.1 Chemikalien und Reagenzien 30
2.2 Puffer und Lösungen 31
2.3 Medien 33
2.4 Bakterienstamm 33
2.5 Zelllinien 34
2.6 DNAs und RNAs 34
2.7 Enzyme 34
2.8 Antikörper 35
2.9 Molekulargewichtsmarker 35
2.10 Kitsystem 36
2.11 Verbrauchsmaterialien 36
2.12 Geräte und Software 36
3. Methoden 39
3.1 Molekularbiologische Methoden 39
3.1.1 Arbeiten mit Bakterien 39
3.1.1.1 Kultivierung von Bakterien für die prokaryotische Proteinproduktion 39
3.1.1.2 Bestimmung der OD600 40
3.1.2 Herstellung von RNA-Totalextrakten 40
3.1.2.1 RNA aus E. coli 40
3.1.2.2 RNA aus eukaryontischen Zellen 41
3.1.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 41
3.1.4 Bestimmung des Nukleinsäure-Gehalts mit RiboGreen® RNA Quantification Kit 41
3.2 Zellbiologische Methoden 43
3.2.1 Kultivierung von Raji- und U937-Zellen 43
3.2.2 Isolierung von peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) aus buffy coats 43
3.2.3 Bestimmung der Zellzahl 44
3.2.4 Isolierung von slanDCs aus PBMCs 44
3.2.5 Durchflusszytometrie 44
3.2.5.1 Messung der Reinheit der slanDCs 45
3.2.5.2 Untersuchung von Oberflächenmarkern auf slanDCs 46
3.3 Proteinbiochemische Methoden 46
3.3.1 Aufreinigung der prokaryontisch produzierten Proteine 46
3.3.2 Dialyse 48
3.3.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Proteinen 48
3.3.4 Spektralanalyse von Protein-Lösungen und von DNA 48
3.3.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 48
3.3.6 Coomassiefärbung von SDS-Gelen 50
3.3.7 Konzentrationsbestimmung mit Proteinstandard im SDS-Gel 50
3.3.8 Western Blotting und Immundetektion 50
3.3.9 Aktivierungsversuche von slanDCs durch Zugabe von La 51
3.3.10 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 51
4. Ergebnisse 53
4.1 Herstellung des Proteins La und dessen N-terminaler Domäne 53
4.2 Charakterisierung der Proteine und Quantifizierung des Nukleinsäure-Gehalts 56
4.2.1 Westernblots und Färbung mit verschiedenen Antikörpern 56
4.2.2 Quantifizierung des Nukleinsäure-Gehalts in La und LaN mittels UV-Spektrum 57
4.2.3 Quantifizierung und Differenzierung der an La gebundenen Nukleinsäuren mit RiboGreen® 63
4.3 Aktivierungsversuche mit slanDCs, der Hauptpopulation von mDCs 67
4.3.1 La und slanDCs 68
4.3.2 Immunstimulierende Kapazität von bakteriell exprimiertem La nach RNase- und DNase-Behandlung 72
4.3.3 Das Teilprotein LaN (N-terminale Domäne von La) 76
4.3.4 Die Reaktion von slanDCs auf eukaryontische und prokaryontische RNA sowie CpG-DNA 79
5. Diskussion 83
5.1 Erläuterungen zur Herstellung der Proteine La und dessen N-terminaler Domäne 83
5.2 Ist an bakteriell gewonnenem La-Protein Nukleinsäure gebunden? 84
5.3 SlanDCs werden durch La-Protein aktiviert, wenn bakterielle Nukleinsäure gebunden ist 87
6. Zusammenfassung 91
Summary 94
Literaturverzeichnis 97
Danksagung 107
Anlagen 109 / Systemic lupus erythematosus (SLE) is the prototype of a systemic autoimmune disease. Apart from a spontaneously remitting rash and joint pain a glomerulonephritis often damages the kidney. Sjögren’s syndrome is another autoimmune disease. It affects the exocrine glands whose destruction leads to persistent mouth and eye dryness. Both diseases belong to the group of collagenoses (connective tissue diseases) where organ non specific autoantibodies against nuclear material (antinuclear antibodies) are used for diagnosis. One antigen called La/SS-B (Sjögren’s Syndrome-B) has been detected in seventy percent of the patients with Sjögren’s syndrome and in twenty-five percent of the patients with SLE. On cell death, for example due to infections or exposure of UV light, La/SS-B is exposed to the extracellular space becoming available to the immune system and leads to an exacerbation of SLE. La/SS-B is an essential nuclear protein in almost all eukaryotes. It binds nucleic acids, particularly RNA, but also DNA to a lesser extent. A major function in humans is the binding of RNA polymerase III transcripts. The protein can be divided into an amino- and a carboxyl-terminus, each serving a different function. The amino-terminus contains the La motif and the RRM1 (RNA recognition motif 1). In one or more phases during the disease La/SS-B will interact with dendritic cells (DC). These central cells of the immune systems are essential for the generation of an antibody response. 6 sulfo LacNAc+ dendrite cells (slanDC) are the major population of myeloid dendritic cells (mDC) and have a high proinflammatory potential. In case of stimulation they produce large amounts of tumor necrosis factor α (TNF α). Like all mDCs they have no TLR9 (toll-like receptor), which could activate the slanDCs via bacterial DNA, but they have TLRs that activate these cells by bacterial RNA and lipopolysaccharide (LPS).
A crucial question is why autoantibodies against the nuclear RNA binding protein La are generated. These autoantibodies could be the consequence of an epiphenomenon or of active immunostimulation. Because La is a nucleic acid binding protein, an association with bacterial nucleic acids after purification from transformed prokaryotes seemed possible. The amino-terminus was analyzed closer since in contains the RNA binding domain. The stimulation of DCs is still insufficiently researched. In this dissertation the stimulation of slanDCs by La/SS-B after purification, using two different methods, was studied. The goal was to clarify whether the bound nucleic acids have an effect on the activation ability of La/SS-B.
La protein was produced recombinantly in E. coli bacteria and purified with nickel affinity chromatography. It was possible to create and purify the separate amino-terminus of La (LaN) by insertion of a stop codon in the transformed prokaryotic DNA. In a second purification of La and LaN the procedure was supplemented by a treatment with DNase and RNase. An UV spectral analysis at 220–300 nm was performed to verify and measure bound nucleic acid of the purified proteins. Furthermore RiboGreen®, which reacts to nucleic acids, was used for fluorescence staining. E. coli and eukaryotic RNA were isolated with TriPure Isolation Reagent and Chloroform for several experiments and comparisons. The slanDCs were isolated by magnetic cell isolation from PBMCs which were obtained from buffy coats by Ficoll density centrifugation. The DCs were cultivated for 24 hours at room temperature and the samples were added 4 hours into the process. In the supernatant the TNF α concentration was measured by ELISA.
After protein purification, western blots were used to verify the identity of La and LaN. The UV spectral analysis showed mixed spectra of proteins and nucleic acids, however the treatment with nucleases reduced the amount of nucleic acids bound to the proteins. RiboGreen® fluorescence staining of various nucleic acids and digestion experiments with nucleases reveal an inhomogeneous fluorescence depending on the type and length of the nucleic acid. This made it impossible to quantify the correct amount of the La-bound bacterial nucleic acid mixture. With the use of a separate treatment with either DNase or RNase the biggest part of the nucleic acid bound to La could be identified as RNA. For LaN this was almost exclusively RNA. 5 pmol La as well as its amino-terminus LaN proved to be potent stimulators in the activation experiment of slanDCs. The nuclease-treated protein variants of La and LaN were significantly less immunostimulatory. Even 50 pmol nuclease-treated La led to less TNF α production than 5 pmol untreated La. E. coli RNA was equally stimulatory to slanDCs in the control experiment. The same did not hold true for eukaryotic RNA. CpG DNA also did not lead to an activation of slanDCs well. The attempt to reassociate nuclease-treated LaN with eukaryotic RNA did not induce a conversion of LaN in an immunestimulatory activator for slanDCs.
It was shown that La-bound bacterial nucleic acids are mainly responsible for the activation of slanDCs. The activation seems to be triggered by the RNA. On one hand RNA was found to be large part of the purified proteins, on the other hand mDCs do not have a TLR9 for the recognition of DNA. This dissertation raises the question whether La/SS B has a role as an alarmin similar to the small protein LL 37, that could not stimulate the immune system itself, but complex the body’s own DNA and convert it to an autostimulatory form. Extracellular La from cell death might be taken up by DCs which are stimulated by foreign nuclein acids at the same time, leading to an immune response against La, too. Due to the observation that nucleic acids were responsible for the activation of slanDCs, further experiments with isolated T helper cells or murine T cells in vivo should be performed. These experiments should address questions whether La specific T cells, which are subsequently responsible for the activation of B cells, are primed. The results of this dissertation led to the assumption that extracellular La could potentially stabilize and protect bacterial nucleic acids during infections from nucleases. This increase of extracellular bacterial nucleic acids could trigger an exacerbation of SLE, which is typically observed in SLE.:Inhaltsverzeichnis 3
Abbildungsverzeichnis 6
Tabellenverzeichnis 8
Abkürzungsverzeichnis 9
1. Einleitung 13
1.1 Das menschliche Immunsystem 13
1.1.1 Die zentrale Rolle dendritischer Zellen bei der Einleitung der Immunantwort 14
1.1.2 Die besondere Rolle dendritischer Zellen bei der spezifischen Immunantwort 15
1.1.3 SlanDCs, eine neue Gruppe dendritischer Zellen 17
1.1.4 Überempfindlichkeitsreaktionen des Immunsystems 18
1.2 Systemischer Lupus Erythematodes (SLE) 18
1.2.1 Allgemeines und Epidemiologie 18
1.2.2 Aspekte zur Pathogenese 20
1.3 Das Autoantigen La/SS B 23
1.4 Die Rolle von Nukleinsäuren bei autoimmunen Prozessen 26
1.5 Zielstellung 28
2. Materialien 30
2.1 Chemikalien und Reagenzien 30
2.2 Puffer und Lösungen 31
2.3 Medien 33
2.4 Bakterienstamm 33
2.5 Zelllinien 34
2.6 DNAs und RNAs 34
2.7 Enzyme 34
2.8 Antikörper 35
2.9 Molekulargewichtsmarker 35
2.10 Kitsystem 36
2.11 Verbrauchsmaterialien 36
2.12 Geräte und Software 36
3. Methoden 39
3.1 Molekularbiologische Methoden 39
3.1.1 Arbeiten mit Bakterien 39
3.1.1.1 Kultivierung von Bakterien für die prokaryotische Proteinproduktion 39
3.1.1.2 Bestimmung der OD600 40
3.1.2 Herstellung von RNA-Totalextrakten 40
3.1.2.1 RNA aus E. coli 40
3.1.2.2 RNA aus eukaryontischen Zellen 41
3.1.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Nukleinsäuren 41
3.1.4 Bestimmung des Nukleinsäure-Gehalts mit RiboGreen® RNA Quantification Kit 41
3.2 Zellbiologische Methoden 43
3.2.1 Kultivierung von Raji- und U937-Zellen 43
3.2.2 Isolierung von peripheren mononukleären Zellen (PBMCs) aus buffy coats 43
3.2.3 Bestimmung der Zellzahl 44
3.2.4 Isolierung von slanDCs aus PBMCs 44
3.2.5 Durchflusszytometrie 44
3.2.5.1 Messung der Reinheit der slanDCs 45
3.2.5.2 Untersuchung von Oberflächenmarkern auf slanDCs 46
3.3 Proteinbiochemische Methoden 46
3.3.1 Aufreinigung der prokaryontisch produzierten Proteine 46
3.3.2 Dialyse 48
3.3.3 Photometrische Konzentrationsbestimmung von Proteinen 48
3.3.4 Spektralanalyse von Protein-Lösungen und von DNA 48
3.3.5 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 48
3.3.6 Coomassiefärbung von SDS-Gelen 50
3.3.7 Konzentrationsbestimmung mit Proteinstandard im SDS-Gel 50
3.3.8 Western Blotting und Immundetektion 50
3.3.9 Aktivierungsversuche von slanDCs durch Zugabe von La 51
3.3.10 Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) 51
4. Ergebnisse 53
4.1 Herstellung des Proteins La und dessen N-terminaler Domäne 53
4.2 Charakterisierung der Proteine und Quantifizierung des Nukleinsäure-Gehalts 56
4.2.1 Westernblots und Färbung mit verschiedenen Antikörpern 56
4.2.2 Quantifizierung des Nukleinsäure-Gehalts in La und LaN mittels UV-Spektrum 57
4.2.3 Quantifizierung und Differenzierung der an La gebundenen Nukleinsäuren mit RiboGreen® 63
4.3 Aktivierungsversuche mit slanDCs, der Hauptpopulation von mDCs 67
4.3.1 La und slanDCs 68
4.3.2 Immunstimulierende Kapazität von bakteriell exprimiertem La nach RNase- und DNase-Behandlung 72
4.3.3 Das Teilprotein LaN (N-terminale Domäne von La) 76
4.3.4 Die Reaktion von slanDCs auf eukaryontische und prokaryontische RNA sowie CpG-DNA 79
5. Diskussion 83
5.1 Erläuterungen zur Herstellung der Proteine La und dessen N-terminaler Domäne 83
5.2 Ist an bakteriell gewonnenem La-Protein Nukleinsäure gebunden? 84
5.3 SlanDCs werden durch La-Protein aktiviert, wenn bakterielle Nukleinsäure gebunden ist 87
6. Zusammenfassung 91
Summary 94
Literaturverzeichnis 97
Danksagung 107
Anlagen 109
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