As bacteriocinas são peptídeos antimicrobianos produzidos por algumas bactérias, que atuam como bio-conservantes e têm grande potencial de aplicação em produtos cárneos. Estudos mostram que as bacteriocinas de bactérias lácticas (BAL) a serem utilizadas em um determinado alimento são mais eficientes quando produzidas por bactérias lácticas isoladas do mesmo tipo de alimento. Este estudo objetivou obter novas BAL produtoras de bacteriocinas a partir de mortadela fatiada, caracterizar as bacteriocinas produzidas, obter a bacteriocina semi-purificada e verificar seu potencial de aplicação in vitro e in situ no controle de Listeria monocytogenes e na vida de prateleira (VDP) de mortadela fatiada. Foram obtidos 19 isolados de BAL comprovadamente produtoras de bacteriocinas, que foram avaliadas quanto ao espectro de ação frente a uma grande variedade de bactérias Gram positivas e Gram negativas, e estabilidade em diferentes pH. As que apresentaram melhor estabilidade e inibiram maior número de bactérias foram avaliadas quanto a estabilidade térmica e resistência a diferentes agentes químicos e concentrações de NaCl. As que apresentaram maior resistência foram submetidas a testes de otimização da produção da bacteriocina em diferentes combinações de tempo/temperatura. Com base nestes resultados, selecionou-se um isolado que identificado como Lactobacillus curvatus pelo sequenciamento do gene 16S e confirmado por reações de PCR com primers específicos. A bacteriocina produzida por este isolado foi submetida a uma purificação por extração ácida e aplicada em fatias de mortadela experimentalmente contaminadas com um pool de cepas de Listeria monocytogenes, observando-se as contagens deste patógeno durante o armazenamento em refrigeração (7°C) por 40 dias em embalagem à vácuo. Paralelamente, foi realizada contagem de bactérias láticas para avaliar o efeito da bacteriocina nesta população, responsável pela VDP deste produto. A bacteriocina parcialmente purificada foi capaz de reduzir em 1 ciclo logarítmico a população inicial de Listeria monocytogenes na mortadela fatiada, que foi mantida durante os 40 dias de análise. Durante toda a VDP, a contagem de L. monocytogenes permaneceu constante, sem multiplicação nas condições de armazenamento do produto tanto nas amostras testes quanto controle. A bacteriocina semi-purificada não teve ação inibitória contra as bactérias lácticas presentes no produto e portanto não teve impacto na VDP do produto. Os resultados indicaram que a bacteriocina produzida pelo isolado L. curvatus RJC 1 apresenta potencial de aplicação em produtos cárneos fatiados como bioconservante. / Bacteriocins are peptides with antimicrobial properties produced by some bacteria, that act as bio-preservatives with great potential of application in meat products. Several studies show that bacteriocins from lactic acid bacteria (LAB) to be used in a specific food product have a better performance when produced by LAB isolated from the same kind of product. This study aimed to obtain new bacteriocinogenic LAB from sliced Bologna, to characterize the bacteriocins produced, to obtain a semi-purified bacteriocin, and to verify its potential of application in vitro and in situ in the control of Listeria monocytogenes and in the shelf-life of sliced bologna. 19 bacteriocin producer LAB, were evaluated as to spectrum of action against a great variety of Gram positives and Gram negatives bacteria and pH stability. The ones with better stability and that inhibited a larger number of bacteria were evaluated according to its thermal stability and resistance against different chemical agents and NaCl concentrations. The ones that showed better resistance were submitted to tests to optimize the bacteriocin production in different combinations of time and temperature. Based on these results, one was selected, identified as Lactobacillus curvatus by gene 16S sequencing and confirmed by PCR reactions with specific primers. The bacteriocin produced by this strain was submitted to partial purification by acid extraction and was applied in mortadella slices experimentally contaminated with a pool of L. monocytogenes strains, observing the counts of this pathogen along refrigerated (7ºC) storage fo r 40 days in vacuum package. Parallel, it was done LAB counts to evaluate the effect of the bacteriocin on this population, responsible for limiting the shelf life of this product. The semi-purified bacteriocin was able to reduce 1 log cicle of the initial population of L. monocytogenes in the sliced mortadella, which was maintained during the 40 days of analysis. Along the whole shelf-life, the counts of L. monocytogenes remained constant, without multiplication in the storage conditions in the test samples as well as in the control samples. The semi-purified bacteriocin did not act against de LAB naturally present at the product, having no impact in the shelf life of the product. The results indicated that the bacteriocin produced by the isolated L. curvatus RJC 1 presents potential of application in sliced deli products as a bio-preservative.

As bacteriocinas são peptídeos antimicrobianos produzidos por algumas bactérias, que atuam como bio-conservantes e têm grande potencial de aplicação em produtos cárneos. Estudos mostram que as bacteriocinas de bactérias lácticas (BAL) a serem utilizadas em um determinado alimento são mais eficientes quando produzidas por bactérias lácticas isoladas do mesmo tipo de alimento. Este estudo objetivou obter novas BAL produtoras de bacteriocinas a partir de mortadela fatiada, caracterizar as bacteriocinas produzidas, obter a bacteriocina semi-purificada e verificar seu potencial de aplicação in vitro e in situ no controle de Listeria monocytogenes e na vida de prateleira (VDP) de mortadela fatiada. Foram obtidos 19 isolados de BAL comprovadamente produtoras de bacteriocinas, que foram avaliadas quanto ao espectro de ação frente a uma grande variedade de bactérias Gram positivas e Gram negativas, e estabilidade em diferentes pH. As que apresentaram melhor estabilidade e inibiram maior número de bactérias foram avaliadas quanto a estabilidade térmica e resistência a diferentes agentes químicos e concentrações de NaCl. As que apresentaram maior resistência foram submetidas a testes de otimização da produção da bacteriocina em diferentes combinações de tempo/temperatura. Com base nestes resultados, selecionou-se um isolado que identificado como Lactobacillus curvatus pelo sequenciamento do gene 16S e confirmado por reações de PCR com primers específicos. A bacteriocina produzida por este isolado foi submetida a uma purificação por extração ácida e aplicada em fatias de mortadela experimentalmente contaminadas com um pool de cepas de Listeria monocytogenes, observando-se as contagens deste patógeno durante o armazenamento em refrigeração (7°C) por 40 dias em embalagem à vácuo. Paralelamente, foi realizada contagem de bactérias láticas para avaliar o efeito da bacteriocina nesta população, responsável pela VDP deste produto. A bacteriocina parcialmente purificada foi capaz de reduzir em 1 ciclo logarítmico a população inicial de Listeria monocytogenes na mortadela fatiada, que foi mantida durante os 40 dias de análise. Durante toda a VDP, a contagem de L. monocytogenes permaneceu constante, sem multiplicação nas condições de armazenamento do produto tanto nas amostras testes quanto controle. A bacteriocina semi-purificada não teve ação inibitória contra as bactérias lácticas presentes no produto e portanto não teve impacto na VDP do produto. Os resultados indicaram que a bacteriocina produzida pelo isolado L. curvatus RJC 1 apresenta potencial de aplicação em produtos cárneos fatiados como bioconservante. / Bacteriocins are peptides with antimicrobial properties produced by some bacteria, that act as bio-preservatives with great potential of application in meat products. Several studies show that bacteriocins from lactic acid bacteria (LAB) to be used in a specific food product have a better performance when produced by LAB isolated from the same kind of product. This study aimed to obtain new bacteriocinogenic LAB from sliced Bologna, to characterize the bacteriocins produced, to obtain a semi-purified bacteriocin, and to verify its potential of application in vitro and in situ in the control of Listeria monocytogenes and in the shelf-life of sliced bologna. 19 bacteriocin producer LAB, were evaluated as to spectrum of action against a great variety of Gram positives and Gram negatives bacteria and pH stability. The ones with better stability and that inhibited a larger number of bacteria were evaluated according to its thermal stability and resistance against different chemical agents and NaCl concentrations. The ones that showed better resistance were submitted to tests to optimize the bacteriocin production in different combinations of time and temperature. Based on these results, one was selected, identified as Lactobacillus curvatus by gene 16S sequencing and confirmed by PCR reactions with specific primers. The bacteriocin produced by this strain was submitted to partial purification by acid extraction and was applied in mortadella slices experimentally contaminated with a pool of L. monocytogenes strains, observing the counts of this pathogen along refrigerated (7ºC) storage fo r 40 days in vacuum package. Parallel, it was done LAB counts to evaluate the effect of the bacteriocin on this population, responsible for limiting the shelf life of this product. The semi-purified bacteriocin was able to reduce 1 log cicle of the initial population of L. monocytogenes in the sliced mortadella, which was maintained during the 40 days of analysis. Along the whole shelf-life, the counts of L. monocytogenes remained constant, without multiplication in the storage conditions in the test samples as well as in the control samples. The semi-purified bacteriocin did not act against de LAB naturally present at the product, having no impact in the shelf life of the product. The results indicated that the bacteriocin produced by the isolated L. curvatus RJC 1 presents potential of application in sliced deli products as a bio-preservative.

Dissertação composta por 2 artigos. / INTRODUÇÃO E OBJETIVOS ─ Nos produtos cárneos industrializados cozidos a maior parte da microbiota é inativada pela aplicação de calor em processo que simula uma pasteurização. Esses produtos também recebem aditivos em sua composição que geram efeito inibidor no crescimento de determinados grupos de microrganismos. Com a microbiota patogênica reduzida a níveis aceitáveis, em amostras embaladas a vácuo ou em atmosfera modificada, criam-se condições para o crescimento de bactérias ácido láticas (BAL), descritas como microrganismos Gram positivos, não formadores de esporos, catalase negativa, desprovidos de citocromos, anaeróbios facultativos, fastidiosos, mesofílicos, ácidos tolerante, com metabolismo estritamente fermentativo, que produzem ácido láctico como o principal produto final da fermentação de carboidratos. O desenvolvimento desses microrganismos gera aroma, sabor e aspecto indesejável nos produtos cárneos. Tendo em vista estas considerações, o objetivo geral desse trabalho foi avaliar a possibilidade da inibição do crescimento de BAL em amostras de presunto fatiado embalado a vácuo, pela aplicação de bacteriocinas. Os objetivos específicos incluíram: a quantificação e identificação das espécies de BAL predominantes nas amostras de presunto cozido fatiado embalado a vácuo; o estudo dos ingredientes que compõem a formulação do presunto cozido combinados com nisina e pediocina, realizados em caldo Man Rogosa e Sharp (MRS) pela aplicação da estratégia de planejamento experimental aliada à microbiologia preditiva na avaliação do crescimento do Lactobacillus sakei; a validação dos resultados obtidos nos caldos MRS na matriz alimentar a partir da elaboração de três formulações envolvendo a utilização da nisina e uma formulação controle, submetidas a análises físico-químicas e microbiológicas durante a vida de prateleira do produto. MÉTODOS ─ Inicialmente foi realizada a quantificação das BAL totais presentes, para 4 lotes semanais de presunto cozido fatiado embalado a vácuo, nos tempos de 1 e 45 dias de armazenamento a 4 C e 8 C. Paralelamente foi realizada a identificação fenotípica dos gêneros presentes; adicionalmente, no tempo de 45 dias foram realizadas análises moleculares do gene 16S rRNA para a identificação das espécies predominantes, por meio da qual selecionou-se a espécie Lactobacillus sakei. Posteriormente, utilizou-se uma estratégia sequencial de planejamento experimental, que objetivou estudar a inibição do crescimento celular da espécie Lactobacillus sakei em caldo MRS, aplicando-se um Planejamento Fatorial Fracionário 26-2 com as variáveis cloreto de sódio, tripolifosfato de sódio, lactato de sódio, eritorbato de sódio e as bacteriocinas nisina e pediocina. Adicionalmente foi realizado um Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) 22 objetivando otimizar a aplicação de nisina e pediocina por meio da redução das concentrações aplicadas que apresentassem eficiência semelhante, considerando os altos custos desses ingredientes. As respostas estudadas em ambos delineamentos experimentais foram os parâmetros preditos pelos ajuste das curvas de crescimento ao Modelo de Gompertz Modificado, a citar a população máxima atingida (A), velocidade específica máxima de crescimento () e a duração da fase lag (). Para a validação dos resultados obtidos na etapa de estudo em caldo MRS, foram elaboradas três formulações teste (com diferentes concentrações de nisina) e uma controle (sem adição de nisina) para o acompanhamento da vida de prateleira do produto por meio de análises físico-químicas e microbiológicas. PRINCIPAIS RESULTADOS ─ Foram observadas contagens médias de 1,98 log UFC.g-1 no tempo 1 dia; 7,59 log UFC.g-1 a 4 C e 8,25 log UFC.g-1 a 8 C no tempo 45 dias para a contagem total de BAL. As espécies predominantemente identificadas no tempo de 45 dias foram o Lactobacillus curvatus e o Lactobacillus sakei. Na etapa de estudo em caldo MRS, os resultados do Planejamento Fatorial Fracionário evidenciaram que o tripolifosfato de sódio, a nisina e a pediocina, foram as variáveis com efeito estatisticamente significativo (p ≤ 0,05) na inibição do crescimento do Lactobacillus sakei. No Delineamento Composto Central Rotacional, a nisina foi a variável que apresentou efeito significativo na inibição do crescimento do Lactobacillus sakei, indicando a possibilidade de redução na concentração aplicada para níveis inferiores ao indicado pela legislação brasileira (12,5 mg/Kg), com efeito semelhante na inibição. A validação dos estudos em caldo MRS pela aplicação das quantidades reduzidas de nisina (indicadas pelo DCCR) na matriz alimentar, mostrou que a quantidade mínima aplicada (0,001%) apresentou um efeito semelhante na inibição das BAL em relação à quantidade máxima aplicada (0,013%); sendo em ambos os casos eficiente quando comparada à amostra controle. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO ─ De acordo com os resultados obtidos, verificou-se que os principais gêneros de BAL envolvidos na deterioração das amostras de presunto cozido fatiado embalado a vácuo, armazenadas durante 45 dias a 4 C e 8 C, foram o Lactobacillus curvatus e Lactobacillus sakei. A contagem de BAL totais após 45 dias mostrou-se significativamente influenciada pela temperatura de armazenamento, pois as contagens foram maiores para as amostras armazenadas a 8 C quando comparadas às armazenadas a 4 C. Dentre os ingredientes comumente adicionados na formulação do presunto cozido, o tripolifosfato de sódio mostrou efeito significativo na inibição do Lactobacillus sakei nos estudos em caldo MRS. De forma semelhante, a nisina e a pediocina mostraram efeito significativo na redução das contagens do microrganismo estudado quando avaliados pela aplicação de um Planejamento Fatorial Fracionário. No Delineamento Composto Central Rotacional envolvendo as variáveis nisina e pediocina com faixas de estudos redefinidas, a nisina apresentou efeito significativo na inibição do Lactobacillus sakei, quando aplicada em concentrações inferiores ao estipulado pela legislação brasileira. Os resultados obtidos no Delineamento Composto Central Rotacional foram validados pela aplicação das quantidades otimizadas de nisina na matriz alimentar, que mesmo na concentração mínima (0,001%) mostrou um efeito similar ao obtido pela aplicação da concentração máxima (0,013%). A contagem de BAL e bactérias aeróbias mesófilas (BAM) totais mostrou-se inferior para as amostras contendo nisina quando comparada com a amostra controle, em torno de 2 a 3 ciclos logarítmicos para as BAL, e 3 ou 4 ciclos logarítmicos para as BAM; em relação ao pH, o mesmo manteve-se praticamente inalterado até o final da vida de prateleira (60 dias), enquanto o pH da amostra controle diminuiu de forma significativa. De um modo geral constatou-se que o presunto cozido fatiado embalado a vácuo é um produto com condições favoráveis ao desenvolvimento de BAL deteriorantes, a citar as espécies Lactobacillus curvatus e Lactobacillus sakei, e que dentre as bacteriocinas estudadas, a nisina apresentou efeito na inibição do Lactobacillus sakei nos estudos em caldo MRS e também na inibição das BAL deteriorantes totais no presunto cozido fatiado embalado a vácuo, mesmo em concentrações inferiores ao indicado pela legislação brasileira. / INTRODUCTION AND AIMS ─ In processed cooked meat products most of the microbiota is inactivated by heat application process which simulate a pasteurization. These products also receive additives in composition that generate inhibitory effect on the certain microorganisms groups growth. With the reduce of pathogenic microorganisms on vacuum packed or modified atmosphere samples, conditions are created for the lactic acid bacteria (LAB) growth, as described Gram positive, non-spore forming, catalase negative, devoid of cytochromes, facultative anaerobic, fastidious, mesophilic, acid tolerant, strictly fermentative metabolism that produce lactic acid as the major end product of fermentation of carbohydrates. The development of these microorganisms causes aroma, flavour and appearance undesirable in meat products. In view of these considerations, the aim of this work was to evaluate the LAB inhibition growth in samples of sliced vacuum-packed cooked ham, by the application of bacteriocins. Specific aims included: the quantification and identification of species of predominate LAB in the samples of sliced vacuum-packed cooked ham; the study of the ingredients of the formulation of cooked ham combined with nisin and pediocin conducted in Man Rogosa and Sharp (MRS) broth using a strategy of experimental design combined with predictive microbiology on evaluation of Lactobacillus sakei growth; and a validation of results obtained in MRS broths on food matrix by the elaboration of three formulations involving the use of nisin and a control formulation, which were submitted for microbiological and physico-chemical analysis during the shelf life of the product. METHODS ─ Initially, the quantification of total LAB present was performed for 4 weekly batches of sliced vacuum-packed cooked ham at time 1 and 45 days of shelf life storage at 4 C and 8 C. Simultaneously was performed phenotypic identification of the genera present; additionally, at the time of 45 days of storage, was carried out a molecular analyze of 16S rRNA gene for identification of the predominant species, whereby selected the specie Lactobacillus sakei. Subsequently, a strategy of sequential experimental design was performed to evaluate the Lactobacillus sakei cell growth inhibition in MRS broth, applying a Fractional Factorial Design 26-2 with the variables sodium chloride, sodium tripolyphosphate, sodium lactate, sodium erythorbate and the bacteriocins nisin and pediocin. The statistically significant variables in relation to Lactobacillus sakei growth inhibition were selected and a Central Composite Rotatable Design (CCRD) 22 was performed to optimize the application of nisin and pediocin by reducing the concentration applied to present similar efficiency, considering the high cost of these ingredients. The responses studied in both experimental design were the parameters logarithmic increase of population (A), maximum specific growth rate (µ) and lag phase duration (), obtained by the adjustment of Modified Gompertz predictive model. For validation of the results obtained in MRS broth, three test formulations were prepared (with different concentrations of nisin) and a control (without addition of nisin) for monitoring the shelf life of the product by physico-chemical and microbiological analyzes. MAIN RESULTS ─ Mean counts around log 1.98 CFU.g-1 at time 1 day, log 7.59 CFU.g-1 at 4C, and log 8.25 CFU.g-1 at 8C on time 45 days, was detected for the total LAB. The species predominantly identified on time 45 days were Lactobacillus curvatus and Lactobacillus sakei. In step of study in MRS broth, the results of the Fractional Factorial Design showed the sodium tripolyphosphate, nisin and pediocin like variables with statistically significant effects in Lactobacillus sakei growth inhibition. In the Central Composite Rotatable Design, nisin was the variable that had a significant effect in the Lactobacillus sakei growth inhibition, indicating that it may be reduced to smaller amounts than indicated by Brazilian law (12.5 mg/Kg) with similar effect on inhibition. The validation of MRS broth studies for applying the reduced amounts of nisin (indicated by the CCRD) in the food matrix, showed that the minimum amount applied (0.001%) presented a similar effect on LAB growth inhibition related to the maximum quantity applied (0.013%); being efficient in both cases when compared to the control sample. DISCUSSION AND CONCLUSION ─ From the results obtained, was possible to conclude that the LAB comprise the microbiota of sliced vacuum-packed cooked ham and the Lactobacillus curvatus and Lactobacillus sakei were the major species that cause deterioration on the samples stored at 4 C and 8 C for 45 days. Total LAB counts after 45 days was significantly affected by storage temperature, because the counts were higher for samples stored at 8 C compared to the samples stored at 4 C. Among the ingredients added in the formulation of cooked ham, sodium tripolyphosphate showed significant effect in Lactobacillus sakei inhibition in MRS broth. Similarly, nisin and pediocin showed significant effects on microorganism reducing, evaluated by applying a Fractional Factorial Design. The Central Composite Rotatable Design involving the variables nisin and pediocin with redefined ranges of concentrations showed that nisin presented significant effect on the Lactobacillus sakei growth inhibition, when applied in smaller amounts in comparison to the stipulated by Brazilian law. The results obtained in Central Composite Rotatable Design was validated by applying the optimized quantities of nisin in food matrix, that even when applying minimal concentration (0.001%) showed a similar effect to that obtained by applying the maximum concentration (0.013%). The count of LAB and mesophilic aerobic bacteria (MAB) total were lower for the samples containing nisin than control sample, approximately 2 to 3 log cycles for LAB, and 3 or 4 log cycles for MAB, while the pH was maintained until the end of shelf life (60 days); at the same time the pH of the control sample had a significant decrease. Altogether the sliced vacuum-packed cooked ham is a favorable product to the LAB spoilage development, principally to the species Lactobacillus curvatus and Lactobacillus sakei, and that among the studied bacteriocins against the inhibition of LAB, nisin showed effect on the Lactobacillus sakei growth inhibition by studies in MRS broth, and also on the LAB spoilage growth inhibition in sliced vacuum-packed cooked ham, even in smaller quantities than indicated by Brazilian law. / 5000

Dissertação composta por 2 artigos. / INTRODUÇÃO E OBJETIVOS ─ Nos produtos cárneos industrializados cozidos a maior parte da microbiota é inativada pela aplicação de calor em processo que simula uma pasteurização. Esses produtos também recebem aditivos em sua composição que geram efeito inibidor no crescimento de determinados grupos de microrganismos. Com a microbiota patogênica reduzida a níveis aceitáveis, em amostras embaladas a vácuo ou em atmosfera modificada, criam-se condições para o crescimento de bactérias ácido láticas (BAL), descritas como microrganismos Gram positivos, não formadores de esporos, catalase negativa, desprovidos de citocromos, anaeróbios facultativos, fastidiosos, mesofílicos, ácidos tolerante, com metabolismo estritamente fermentativo, que produzem ácido láctico como o principal produto final da fermentação de carboidratos. O desenvolvimento desses microrganismos gera aroma, sabor e aspecto indesejável nos produtos cárneos. Tendo em vista estas considerações, o objetivo geral desse trabalho foi avaliar a possibilidade da inibição do crescimento de BAL em amostras de presunto fatiado embalado a vácuo, pela aplicação de bacteriocinas. Os objetivos específicos incluíram: a quantificação e identificação das espécies de BAL predominantes nas amostras de presunto cozido fatiado embalado a vácuo; o estudo dos ingredientes que compõem a formulação do presunto cozido combinados com nisina e pediocina, realizados em caldo Man Rogosa e Sharp (MRS) pela aplicação da estratégia de planejamento experimental aliada à microbiologia preditiva na avaliação do crescimento do Lactobacillus sakei; a validação dos resultados obtidos nos caldos MRS na matriz alimentar a partir da elaboração de três formulações envolvendo a utilização da nisina e uma formulação controle, submetidas a análises físico-químicas e microbiológicas durante a vida de prateleira do produto. MÉTODOS ─ Inicialmente foi realizada a quantificação das BAL totais presentes, para 4 lotes semanais de presunto cozido fatiado embalado a vácuo, nos tempos de 1 e 45 dias de armazenamento a 4 C e 8 C. Paralelamente foi realizada a identificação fenotípica dos gêneros presentes; adicionalmente, no tempo de 45 dias foram realizadas análises moleculares do gene 16S rRNA para a identificação das espécies predominantes, por meio da qual selecionou-se a espécie Lactobacillus sakei. Posteriormente, utilizou-se uma estratégia sequencial de planejamento experimental, que objetivou estudar a inibição do crescimento celular da espécie Lactobacillus sakei em caldo MRS, aplicando-se um Planejamento Fatorial Fracionário 26-2 com as variáveis cloreto de sódio, tripolifosfato de sódio, lactato de sódio, eritorbato de sódio e as bacteriocinas nisina e pediocina. Adicionalmente foi realizado um Delineamento Composto Central Rotacional (DCCR) 22 objetivando otimizar a aplicação de nisina e pediocina por meio da redução das concentrações aplicadas que apresentassem eficiência semelhante, considerando os altos custos desses ingredientes. As respostas estudadas em ambos delineamentos experimentais foram os parâmetros preditos pelos ajuste das curvas de crescimento ao Modelo de Gompertz Modificado, a citar a população máxima atingida (A), velocidade específica máxima de crescimento () e a duração da fase lag (). Para a validação dos resultados obtidos na etapa de estudo em caldo MRS, foram elaboradas três formulações teste (com diferentes concentrações de nisina) e uma controle (sem adição de nisina) para o acompanhamento da vida de prateleira do produto por meio de análises físico-químicas e microbiológicas. PRINCIPAIS RESULTADOS ─ Foram observadas contagens médias de 1,98 log UFC.g-1 no tempo 1 dia; 7,59 log UFC.g-1 a 4 C e 8,25 log UFC.g-1 a 8 C no tempo 45 dias para a contagem total de BAL. As espécies predominantemente identificadas no tempo de 45 dias foram o Lactobacillus curvatus e o Lactobacillus sakei. Na etapa de estudo em caldo MRS, os resultados do Planejamento Fatorial Fracionário evidenciaram que o tripolifosfato de sódio, a nisina e a pediocina, foram as variáveis com efeito estatisticamente significativo (p ≤ 0,05) na inibição do crescimento do Lactobacillus sakei. No Delineamento Composto Central Rotacional, a nisina foi a variável que apresentou efeito significativo na inibição do crescimento do Lactobacillus sakei, indicando a possibilidade de redução na concentração aplicada para níveis inferiores ao indicado pela legislação brasileira (12,5 mg/Kg), com efeito semelhante na inibição. A validação dos estudos em caldo MRS pela aplicação das quantidades reduzidas de nisina (indicadas pelo DCCR) na matriz alimentar, mostrou que a quantidade mínima aplicada (0,001%) apresentou um efeito semelhante na inibição das BAL em relação à quantidade máxima aplicada (0,013%); sendo em ambos os casos eficiente quando comparada à amostra controle. DISCUSSÃO E CONCLUSÃO ─ De acordo com os resultados obtidos, verificou-se que os principais gêneros de BAL envolvidos na deterioração das amostras de presunto cozido fatiado embalado a vácuo, armazenadas durante 45 dias a 4 C e 8 C, foram o Lactobacillus curvatus e Lactobacillus sakei. A contagem de BAL totais após 45 dias mostrou-se significativamente influenciada pela temperatura de armazenamento, pois as contagens foram maiores para as amostras armazenadas a 8 C quando comparadas às armazenadas a 4 C. Dentre os ingredientes comumente adicionados na formulação do presunto cozido, o tripolifosfato de sódio mostrou efeito significativo na inibição do Lactobacillus sakei nos estudos em caldo MRS. De forma semelhante, a nisina e a pediocina mostraram efeito significativo na redução das contagens do microrganismo estudado quando avaliados pela aplicação de um Planejamento Fatorial Fracionário. No Delineamento Composto Central Rotacional envolvendo as variáveis nisina e pediocina com faixas de estudos redefinidas, a nisina apresentou efeito significativo na inibição do Lactobacillus sakei, quando aplicada em concentrações inferiores ao estipulado pela legislação brasileira. Os resultados obtidos no Delineamento Composto Central Rotacional foram validados pela aplicação das quantidades otimizadas de nisina na matriz alimentar, que mesmo na concentração mínima (0,001%) mostrou um efeito similar ao obtido pela aplicação da concentração máxima (0,013%). A contagem de BAL e bactérias aeróbias mesófilas (BAM) totais mostrou-se inferior para as amostras contendo nisina quando comparada com a amostra controle, em torno de 2 a 3 ciclos logarítmicos para as BAL, e 3 ou 4 ciclos logarítmicos para as BAM; em relação ao pH, o mesmo manteve-se praticamente inalterado até o final da vida de prateleira (60 dias), enquanto o pH da amostra controle diminuiu de forma significativa. De um modo geral constatou-se que o presunto cozido fatiado embalado a vácuo é um produto com condições favoráveis ao desenvolvimento de BAL deteriorantes, a citar as espécies Lactobacillus curvatus e Lactobacillus sakei, e que dentre as bacteriocinas estudadas, a nisina apresentou efeito na inibição do Lactobacillus sakei nos estudos em caldo MRS e também na inibição das BAL deteriorantes totais no presunto cozido fatiado embalado a vácuo, mesmo em concentrações inferiores ao indicado pela legislação brasileira. / INTRODUCTION AND AIMS ─ In processed cooked meat products most of the microbiota is inactivated by heat application process which simulate a pasteurization. These products also receive additives in composition that generate inhibitory effect on the certain microorganisms groups growth. With the reduce of pathogenic microorganisms on vacuum packed or modified atmosphere samples, conditions are created for the lactic acid bacteria (LAB) growth, as described Gram positive, non-spore forming, catalase negative, devoid of cytochromes, facultative anaerobic, fastidious, mesophilic, acid tolerant, strictly fermentative metabolism that produce lactic acid as the major end product of fermentation of carbohydrates. The development of these microorganisms causes aroma, flavour and appearance undesirable in meat products. In view of these considerations, the aim of this work was to evaluate the LAB inhibition growth in samples of sliced vacuum-packed cooked ham, by the application of bacteriocins. Specific aims included: the quantification and identification of species of predominate LAB in the samples of sliced vacuum-packed cooked ham; the study of the ingredients of the formulation of cooked ham combined with nisin and pediocin conducted in Man Rogosa and Sharp (MRS) broth using a strategy of experimental design combined with predictive microbiology on evaluation of Lactobacillus sakei growth; and a validation of results obtained in MRS broths on food matrix by the elaboration of three formulations involving the use of nisin and a control formulation, which were submitted for microbiological and physico-chemical analysis during the shelf life of the product. METHODS ─ Initially, the quantification of total LAB present was performed for 4 weekly batches of sliced vacuum-packed cooked ham at time 1 and 45 days of shelf life storage at 4 C and 8 C. Simultaneously was performed phenotypic identification of the genera present; additionally, at the time of 45 days of storage, was carried out a molecular analyze of 16S rRNA gene for identification of the predominant species, whereby selected the specie Lactobacillus sakei. Subsequently, a strategy of sequential experimental design was performed to evaluate the Lactobacillus sakei cell growth inhibition in MRS broth, applying a Fractional Factorial Design 26-2 with the variables sodium chloride, sodium tripolyphosphate, sodium lactate, sodium erythorbate and the bacteriocins nisin and pediocin. The statistically significant variables in relation to Lactobacillus sakei growth inhibition were selected and a Central Composite Rotatable Design (CCRD) 22 was performed to optimize the application of nisin and pediocin by reducing the concentration applied to present similar efficiency, considering the high cost of these ingredients. The responses studied in both experimental design were the parameters logarithmic increase of population (A), maximum specific growth rate (µ) and lag phase duration (), obtained by the adjustment of Modified Gompertz predictive model. For validation of the results obtained in MRS broth, three test formulations were prepared (with different concentrations of nisin) and a control (without addition of nisin) for monitoring the shelf life of the product by physico-chemical and microbiological analyzes. MAIN RESULTS ─ Mean counts around log 1.98 CFU.g-1 at time 1 day, log 7.59 CFU.g-1 at 4C, and log 8.25 CFU.g-1 at 8C on time 45 days, was detected for the total LAB. The species predominantly identified on time 45 days were Lactobacillus curvatus and Lactobacillus sakei. In step of study in MRS broth, the results of the Fractional Factorial Design showed the sodium tripolyphosphate, nisin and pediocin like variables with statistically significant effects in Lactobacillus sakei growth inhibition. In the Central Composite Rotatable Design, nisin was the variable that had a significant effect in the Lactobacillus sakei growth inhibition, indicating that it may be reduced to smaller amounts than indicated by Brazilian law (12.5 mg/Kg) with similar effect on inhibition. The validation of MRS broth studies for applying the reduced amounts of nisin (indicated by the CCRD) in the food matrix, showed that the minimum amount applied (0.001%) presented a similar effect on LAB growth inhibition related to the maximum quantity applied (0.013%); being efficient in both cases when compared to the control sample. DISCUSSION AND CONCLUSION ─ From the results obtained, was possible to conclude that the LAB comprise the microbiota of sliced vacuum-packed cooked ham and the Lactobacillus curvatus and Lactobacillus sakei were the major species that cause deterioration on the samples stored at 4 C and 8 C for 45 days. Total LAB counts after 45 days was significantly affected by storage temperature, because the counts were higher for samples stored at 8 C compared to the samples stored at 4 C. Among the ingredients added in the formulation of cooked ham, sodium tripolyphosphate showed significant effect in Lactobacillus sakei inhibition in MRS broth. Similarly, nisin and pediocin showed significant effects on microorganism reducing, evaluated by applying a Fractional Factorial Design. The Central Composite Rotatable Design involving the variables nisin and pediocin with redefined ranges of concentrations showed that nisin presented significant effect on the Lactobacillus sakei growth inhibition, when applied in smaller amounts in comparison to the stipulated by Brazilian law. The results obtained in Central Composite Rotatable Design was validated by applying the optimized quantities of nisin in food matrix, that even when applying minimal concentration (0.001%) showed a similar effect to that obtained by applying the maximum concentration (0.013%). The count of LAB and mesophilic aerobic bacteria (MAB) total were lower for the samples containing nisin than control sample, approximately 2 to 3 log cycles for LAB, and 3 or 4 log cycles for MAB, while the pH was maintained until the end of shelf life (60 days); at the same time the pH of the control sample had a significant decrease. Altogether the sliced vacuum-packed cooked ham is a favorable product to the LAB spoilage development, principally to the species Lactobacillus curvatus and Lactobacillus sakei, and that among the studied bacteriocins against the inhibition of LAB, nisin showed effect on the Lactobacillus sakei growth inhibition by studies in MRS broth, and also on the LAB spoilage growth inhibition in sliced vacuum-packed cooked ham, even in smaller quantities than indicated by Brazilian law. / 5000

Une recherche de souches bactériennes lactiques productrices de bactériocine a été entreprise à partir daliments traditionnels dorigine sénégalaise et les souches les plus actives ont été mises en uvre comme barrière en supplément du sel (NaCl) contre la croissance de la flore contaminante de différents poissons maigre [sompat (Pomadasys jubelini)], moyennement gras [capitaine (Polydactylus quadrifilis)], et gras [mâchoiron (Arius heudeloti)] de production artisanale au Sénégal. La prévalence des bactéries lactiques a été déterminée à 109 UFC/(g ou ml) dans les produits fermentés traditionnels à base de céréale et de lait, et 103 UFC/g dans les produits de la pêche fermentés. Douze souches bactériennes à activité inhibitrice de type bactériocine ont été détectées au sein de 220 souches de bactéries lactiques isolées de 32 échantillons de ces différents types de produits. Les 11 souches ont été caractérisées (API 50 CH, 16S rDNA) comme étant des souches de Lactococcus lactis subsp. lactis qui portent le gène codant pour la nisine, la souche restante est une souche dEnterococcus faecium et possède le gène codant pour lEntérocine B. Les deux souches, Lactococcus lactis subsp. lactis CWBI-B1410, isolée de farine de mil fermentée et productrice de nisine, et la souche Lactobacillus curvatus CWBI-B28 provenant de la collection du CWBI de la FUSAGx, produisant trois bactériocines de type curvalicine 28a, b et c, ont été mises en uvre en combinaison avec du sel comme barrière contre la croissance de la flore contaminante dans les poissons. La flore totale dans les poissons de production artisanale atteingnait 5,70 log UFC/g. La transformation des poissons par fermentation naturelle à 30°C (sans traitement préalable : procédé traditionnel), entraîne une prolifération de bactéries Gram-négatives comme Proteus sp, Shewanella putrefaciens et des souches de Bacillus sp qui atteignent 109-10 UFC/g en moins de 24 h dans les produits. Lutilisation de CWBI-B1410 (107 UFC/g) comme ferment avec ajout de glucose (1% m/m) dans les filets, entraîne une production in situ de substances antagonistes (acides organiques et bactériocine). Il en résulte une réduction du niveau de la flore contaminante entérique de 2 (P. quadrifilis) et de 4 (P. jubelini) log UFC/g par rapport aux poissons préparés traditionnellement. Lajout de sel dans des produits ainsi fermentés réduit la flore entérique. Laddition des surnageants de culture neutralisés (pH 6) bactéricides issus de CWBI-B1410 ou de CWBI-B28 en combinaison avec du chlorure de sodium (0,14 g/ml) sur les filets crus (100 ml/100 g) incubés à 10°C réduit le niveau de la contamination bactérienne de 1,5 log UFC/g et retarde laugmentation de la flore qui reste à un niveau < 106 UFC/g pendant 13 à 18 jours dincubation à 10°C selon le type de poisson, alors que pour les filets contrôles, traités avec des surnageants de culture neutralisés de souches non productrices de bactériocines (Lactobacillus curvatus LMG 21688 et Lactococcus lactis LMG 6890) salés (NaCl 0,14 g/ml), la flore contaminante dépasse 106 UFC/g au bout de 3 à 7 jours. Les effets antibactériens des surnageants de cultures neutralisés bactéricides et salés (NaCl 0,14 g/ml), sont par ailleurs, plus importants que ceux dune solution salée (NaCl 0,14 g/ml) supplémentée de sels de benzoate et de sorbate en concentration de 0,5 mg/ml chacun sur les poissons riches en lipides. Ces résultats suggèrent que, la combinaison des effets antibactériens des bactéries lactiques productrices de bactériocines et du sel, plus particulièrement lutilisation de SCN salés, comme préservatifs, peut constituer un moyen approprié damélioration de la conservation et de la qualité microbiologique des produits de la pêche artisanale au Sénégal. Le traitement des poissons selon lune ou lautre des stratégies décrites précédemment, combiné à un système de séchage devrait permettre de produire des produits halieutiques traditionnels de meilleures qualités microbiologiques et de durée de conservation plus longue, justifiant limportance de continuer cette étude sur lamélioration de la productivité de bactériocine par CWBI-B1410, et les impacts des nouveaux traitements sur les qualités organoleptiques et nutritionelles des produits. A screening of bacteriocin-producing lactic acid bacteria from Senegalese traditional food products was undertaken and the most active strains were tested in combination with sodium chloride as barrier to control spoilage bacteria growth on different artisanal fish products [lean sumpat grunt (Pomadasys jubelini), moderarely fat giant African threadfin (Polydactylus quadrifilis) and fat smoothmouth sea catfish (Arius heudeloti)] in Senegal. The prevalence of lactic acid bacteria was determined at 109 CFU/(g or ml) in traditional fermented cereals and fermented milk products, and 103 CFU/g in fermented seafood products. Twelve bacteriocin-producing strains were detected of 220 lactic acid bacteria strains randomly selected from such products. The eleven were characterized (API 50CH and 16S rDNA) as Lactococcus lactis subsp lactis strains and contain gene encoding nisin, and the remaining one an Enterococcus faecium strain which contains gene encoding Enterocin B. Two strains, Lactococcus lactis subsp. lactis CWBI-B1410, a nisin producer isolated from fermented millet flour from Senegal, and Lactobacillus curvatus CWBI B28 which produces three bacteriocins (Curvalicin 28a, b et c) from CWBI collection, were tested in combination with sodium chloride as barrier to control spoilage bacteria growth on fish from artisanal production. The total bacterial counts of fishes reached 5.7 log CFU/g. The processing of such products by natural fermentation at 30°C (without any preliminary treatment as in traditional process) result in proliferation of Gram-negative bacteria such as Proteus sp and Shewanella putrefaciens, and some Bacillus sp strains, which reached 109-10 CFU/g in products within less than 24 h of incubation. When using CWBI-B1410 living culture (107 CFU/g) with glucose (1% wt/wt) supplementation as barrier against bacterial growth in fishes, a depression of the pH as well as a bacteriocin-like activity were noted, resulting in a decrease of the Gram negative strains counts of 4 log CFU/g (P. jubelini) and 2 log CFU/g (P. quadrifilis) in comparison to fishes prepared in using traditional process. The addition of salt in such fermented products reinforced the antimicrobial effect by CWBI-B1410 strain. The addition of neutralized (pH 6) culture supernatants of CWBI-B1410 or CWBI-B28 strains in combination with sodium chloride (0.14 g/ml) as preservatives on fishes (100 ml/100 g) incubated at 10°C, declined the level of total bacterial counts of 1.5 log CFU/g within 48 h, and delayed the increase of bacteria number in fishes: bacterial counts remained under 106 CFU/g for 13 to 18 days of storage at 10°C following the fish, whereas they were over 106 CFU/g after 3 to 7 days fish storage at 10°C in controls, treated with salted (NaCl 0.14 g/ml) neutralized (pH 6) culture supernatants of non-bacteriocin producers (Lactococcus lactis LMG 6890 and Lactobacillus curvatus LMG 216888). The antimicrobial effects by salted neutralized culture supernatants of the bacteriocin producers were higher to those of salted solution (NaCl 0.14 g/ml) supplemented with benzoate and sorbate acid salts each at concentration of 0.5 mg/ml on the moderate and fat fishes. These data suggest that the use of bacteriocin-producing lactic acid bacteria in combination with sodium chloride as described above, particularly the use of salted bactericidal culture supernatant, as preservatives, can be a suitable strategy to enhance the storage and the bacterial quality of traditional fish products in Senegal. The treatment of fishes in using one of the strategies as described above combined with a drying process could permit production of seafood commodities with higher bacterial quality and time of storage, justifying to continue this investigation on the enhancement of the bacteriocin-productivity by CWBI-B1410, and the evaluation of the effects of the new treatments on the organaoleptic and nutritional quality of products.