Die antiinflammatorischen, proproliferativen und antiapoptotischen Eigenschaften mesenchymaler Stromazellen (MSC) stellen einen innovativen Therapieansatz zur Förderung der Leberregeneration nach einer Leberteilresektion dar. Nach der bereits erfolgreichen Etablierung im murinen Kleintiermodell galt es nun die Erkenntnisse auf ein dem humanen Organismus näherstehendes Großtiermodell zu übertragen. Die hier vorliegende Arbeit soll dabei die Wirkung mesenchymaler Stromazellen im Rahmen einer ausgedehnten Leberteilresektion auf die Funktion und Morphologie des Restlebergewebes im porcinen Großtiermodell untersuchen. Insgesamt wurden 12 Landrasseschweine einer 70 %igen Leberteilresektion unterzogen. Weitere drei Schweine wurden ebenfalls dem perioperativen Procedere unterzogen, erhielten jedoch keine Leberteilresektion (sogenannte Sham-Gruppe). Jeweils vier Schweine erhielten im Rahmen der Resektion entweder zentralvenös (MSC_ZV-Gruppe) oder portalvenös (MSC_PV-Gruppe) applizierte porcine bone marrow-MSC. Die restlichen vier Tiere erhielten mit PBS lediglich die Trägersubstanz der MSC (PBS-Gruppe). 24 h nach Resektion wurden alle Tiere euthanasiert. Während des Versuches erfolgten zu definierten Zeitpunkten die Erhebung laborchemischer Parameter, die Ermittlung der Indocyaningrün (ICG)-Clearance (LiMON®-Test) und die Entnahme von Leberbiopsien. Dabei zeigten sich signifikante Unterschiede zwischen den MSC-Gruppen und der PBS-Gruppe. Die Auswertung der laborchemischen Parameter erbrachte postoperativ für die MSC-Gruppen signifikante Vorteile für den Verlauf der Transaminasen, des Serumammoniaks, der GGT, der LDL, der freien Fettsäuren im Serum, der aPTT, der INR und des CRP. Betrachtet man die Messung der Plasmaverschwinderate des ICG ergaben sich signifikant höhere Clearance-Raten für die mit MSC behandelten Tiere im Vergleich zur PBS-Gruppe. Sowohl die zentral- als auch die portalvenöse Injektion der MSC ließen sich als sichere Applikationswege der MSC etablieren. Die histologischen Untersuchungen mittels HE- und Sudan III-Färbung sowie die immunhistochemischen Färbungen detektierten eine geringere Lipidakkumulation, einen höheren Anteil der Zell-Zell-Kontaktproteine E-Cadherin und ZO-1 sowie einen geringeren Anteil an Thrombospondin-1 (Suppressor der Leberregeneration) in den mit MSC behandelten Tieren verglichen mit der PBS-Gruppe. Die Zusammenschau der Befunde spricht für eine durch MSC induzierte Verbesserung der postoperativen Leberfunktion nach ausgedehnter Leberteilresektion. Mechanistisch könnte dabei die Unterstützung des Erhalts der hepatischen Mikroarchitektur und die Verminderung des Thrombospondin-1 eine Rolle spielen. Letzteres gilt als negativer Prädiktor des Outcomes nach ausgedehnter Leberresektion. Somit stellt die Applikation mesenchymaler Stromazellen eine innovative therapeutische Option zum Erhalt der Leberfunktion nach einer ausgedehnten Leberteilresektion dar.

Die erweiterte Leberteilresektion wird gegenwärtig als kurative Therapie verschiedenster Erkrankungen der Leber durchgeführt, zumeist bei primären oder sekundären Lebertumoren. Perioperativ erleiden die Patienten häufig eine akute Nierenschädigung mit erhöhter Morbidität und Mortalität nach dem operativen Eingriff. Dies hat gravierende Auswirkungen auf den Patienten und bei einer intensivmedizinisch notwendigen Versorgung auch auf unser Gesundheitssystem. Um dies abzumildern ist die Früherkennung der Nierenschädigung essentiell. Die derzeit etablierte Therapie fungiert nur supportiv bis hin zum Einsatz von Nierenersatzverfahren und ist zeit- und kostenintensiv. Die Suche nach neuen innovativen Therapieansätzen gewinnt daher zunehmend an Bedeutung. In einem Tiermodell am Schwein wurde nach erweiterter Leberteilresektion und 150 min Ischämiezeit bei Kontrolltieren eine akute Leberschädigung mit Anzeichen einer akuten Nierenschädigung beobachtet. Innerhalb von 24 Stunden stieg die Konzentration des Biomarkers NGAL (Neutrophilen Gelatinase-assoziiertes Lipocalin), der für die frühzeitige Diagnostik einer akuten Nierenschädigung verwendet wird, signifikant im Urin und Blut an. Dies erfolgte noch bevor Veränderungen des Routineparameters Kreatinin im Serum erfasst werden konnten. Nach intravenöser Transplantation mesenchymaler Stromazellen (MSC) aus dem Knochenmark von Spendertieren wurde eine signifikant verringerte Konzentration von NGAL im Blut und Urin von Versuchstieren im Beobachtungszeitraum von 24 Stunden gemessen. Somit konnte eine Abschwächung der entstandenen Nierenschädigung durch MSC-Transplantation gezeigt werden. Auf der Suche nach der Wirkungsweise der Stromazellen wurde eine signifikant erhöhte Konzentration von 14 verschiedenen Zytokinen im Serum und Nierengewebe nach MSC-Transplantation festgestellt. Im Blut wurde vermehrt zirkulierendes PDGF gemessen, welches die Blutdruck-Stabilität optimierte und somit für eine verbesserte Organperfusion sorgte. Im Nierengewebe wurden immunmodulierende und regenerationsfördernde sowie die Differenzierung und das Wachstum von Zellen regulierende Zytokine vermehrt exprimiert. Auf zellulärer Ebene konnte eine veränderte Expression des Zelladhäsionsmoleküls N-Cadherin identifiziert werden. Nach akuter Nierenschädigung reduzierte sich dessen Expression in den betroffenen Zellmembranen der proximalen Nierentubuli, wohingegen die im distalen unberührt blieb. Nach MSC-Transplantation normalisierte sich die Expression wieder. Somit trugen die MSC zum Erhalt der epithelialen Integrität und Funktionalität bei. Konstatiert werden kann daher, dass eine akute Nierenschädigung nach einer erweiterten Leberteilresektion durch die Transplantation von MSC abgemildert wurde. Eine Behandlung mit MSC scheint ein vielversprechender neuer Therapieansatz zur Behandlung einer akuten Nierenschädigung zu sein. Weiterführende klinische Untersuchungen zur Überprüfung der Sicherheit, Durchführbarkeit und Wirksamkeit sollten sich anschließen, um den Weg der MSC-basierten Therapie bei Nierenerkrankungen zu ebnen.:Inhaltsverzeichnis ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 3 ABBILDUNGSVERZEICHNIS 5 TABELLENVERZEICHNIS 7 1 EINFÜHRUNG 8 1.1 Niere 8 1.1.1 Anatomie und Physiologie 8 1.1.2 Akute Nierenschädigung 9 1.1.3 Diagnostik 12 1.1.4 Komplikationen 14 1.1.5 Therapeutische Möglichkeiten und Prognose 15 1.2 Erweiterte Leberteilresektion 16 1.3 Mesenchymale Stromazellen 17 1.3.1 Definition 17 1.3.2 Potential 18 1.3.3 Anwendung 18 1.3.4 Zytokine 19 1.4 Tiermodell 20 2 AUFGABENSTELLUNG 22 3 MATERIAL UND METHODEN 23 3.1 Versuchsgruppenplanung 23 3.2 Gewinnung der MSC 24 3.2.1 Isolation der MSC 24 3.2.2 Kultivierung 24 3.2.3 Zellernte 25 3.2.4 Bestimmung der Vitalität und Kryokonservierung 25 3.3 Hepatogene Differenzierung 26 3.4 Tierversuche 27 3.4.1 Vorbereitung der Versuchstiere 27 3.4.2 Durchführung der Leberteilresektion 29 3.4.3 Probengewinnung 30 3.4.4 Organentnahme und Euthanasie der Versuchstiere 31 3.4.5 Probenaufarbeitung 31 3.5 Statistische Auswertung 38 4 ERGEBNISSE 39 4.1 Postoperative Leberschädigung nach erweiterter Leberteilresektion 39 4.2 Makroskopische Untersuchung der Nieren und Urinproduktion 40 4.3 Kreatinin-Konzentration im Serum 42 4.4 Kim-1-Konzentration im Urin 43 4.5 Wirkung der MSC-Transplantation auf die NGAL-Konzentration im Urin 44 4.6 Wirkung der MSC-Transplantation auf die NGAL-Konzentration im Blut 45 4.7 Histologische Veränderungen 46 4.8 Veränderte Zytokinexpression durch MSC-Transplantation 49 5 DISKUSSION 54 5.1 Akute Nierenschädigung nach erweiterter Leberteilresektion 54 5.1.1 Serum-Kreatinin, KIM-1 und NGAL als Marker der akuten Nierenschädigung 54 5.1.2 Zusammenhang der Leber- und Nierenschädigung 57 5.2 Wirkung der MSC auf die akute Nierenschädigung 59 5.2.1 Biomarker und Urinproduktion diagnostizieren Verbesserung der Nierenfunktion durch MSC 59 5.2.2 MSC-Wirkung in der Niere durch Verbesserung der epithelialen Integrität 60 5.2.3 MSC zeigen organprotektive Eigenschaften nach großen chirurgischen Eingriffen 62 5.2.4 Wirkungsweise der MSC über Zytokine 63 5.2.5 Verbesserung der Blutdruck-Stabilität durch MSC mittels PDGF 68 5.2.6 VEGF als protektiver Faktor für die Nierenfunktion 71 5.3 Ausblick 73 6 ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT 75 7 LITERATURVERZEICHNIS 77 8 ERKLÄRUNG ÜBER DIE EIGENSTÄNDIGE ABFASSUNG DER ARBEIT 91 9 CURRICULUM VITAE 92 10 PUBLIKATIONEN 93 11 DANKSAGUNG 94

Eine Leberteilresektion stellt bei verschiedenen Indikationen den Eingriff der Wahl dar. Die beiden gängigsten Verfahren zur postoperativen Schmerztherapie sind die epidurale Lokalanästhetika- oder die intravenöse (i. v.) Opioidgabe. Aufgrund der Möglichkeit einer transienten Leberfunktionsstörung nach dem oben genannten Eingriff ist hierbei jedoch die Gefahr einer Koagulopathie und einer Metabolisierungsstörung diverser Analgetikagruppen gegeben. Dementsprechend kontrovers wird der Einsatz einer epiduralen Analgesie mittels Lokalanästhetikum und Opioid mit der Gefahr der rückenmarksnahen Einblutung oder einer systemischen intravenösen Opioidgabe mit der Gefahr der Atemdepression und Sedierung diskutiert. Ziel dieser Studie war die Betrachtung der beiden angewandten Verfahren aus Sicht des Patienten und dessen Einschätzung der Zufriedenheit mit dem von ihm individuell gewählten Applikationsmodus. Als Nebenaspekt wurden aufgetretene Nebenwirkungen und die Schmerzintensität sowie dessen Empfindung erfasst. In die Gruppe der Patienten mit einem Epiduralkatheter konnten insgesamt 14 Patienten einbezogen werden, in die der Patienten mit intravenöser Opioidgabe 15 Patienten. Präoperativ wurden die demografischen Daten und der Fragebogen Short-Form-12-Health-Survey (SF-12-HS) erhoben. Letzterer diente der Basisdokumentation der psychischen und körperlichen Gesundheit um eventuell vorbestehende Gruppenunterschiede bereits herauszufiltern. Im Verlauf der ersten vier postoperativen Tage wurden die Schmerzintensität und die Patientenzufriedenheit mittels Numerischer Ratingskalen (NRS) und zweier standardisierter Fragenbögen ausgewertet. Hierbei fanden der Patientenbogen zur Beurteilung der perioperativen Phase (PPP-33) und der Fragebogen zur Zufriedenheit (ZUF-8) Verwendung. Eine Reihe von hämodynamischen und laborchemischen Parametern und die Menge des verbrauchten Analgetikums wurden täglich erfasst. Im Vergleich der prä- und intraoperativ erhobenen Daten konnten keine Unterschiede zwischen beiden Studiengruppen festgestellt werden. Ebenso wurden bei der statistischen Auswertung der postoperativen Nebenwirkungsprofile, der Laborparameter, der Werte für die numerischen Ratingskalen (NRS) von Schmerz sowie Zufriedenheit und bei der Auswertung der Fragebögen zur Eruierung der Zufriedenheit mit der gewählten Analgesiemethode keine signifikanten Gruppenunterschiede gefunden. Die Auswahl des postoperativen Analgesieverfahrens nach einer Leberteilresektion hat somit keinen Einfluss auf die Zufriedenheit der Patienten mit dem perioperativen Analgesiemanagement und die Zufriedenheit mit der Schmerztherapie wurde in beiden Kollektiven sehr hoch eingestuft. Die bei der Epiduralanalgesie gefürchtete Blutungskomplikation wurde in dieser Untersuchung nicht beobachtet, müsste jedoch in einem größeren Kollektiv erfasst werden. Weitere Investitionen in das Feld der Zufriedenheit mit einer Schmerzmitteltherapie nach einer Leberteilresektion wären im Spannungsfeld der kontrovers diskutierten Verfahren wünschenswert.

In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Verfahren untersucht, die eine erfolgreiche Protektion vor hepatischer Ischämie/Reperfusionsschädigung versprachen: ischämische Präkonditionierung (IP) und pharmakologische Konditionierung mit Methylprednisolon (MP). Dabei wurde zunächst das Ausmaß der hepatozellulären Schädigung nach warmer Leberischämie durch Abklemmen der blutzuführenden Gefäße im Ligamentum hepatoduodenale (Pringle-Manöver) analysiert, wobei beide Behandlungsstrategien eine vergleichbar starke Gewebsprotektion erzielten. Nach 70%-iger Leberteilresektion mit Pringle-Manöver war jedoch trotz reduzierter Ischämie/Reperfusionsschädigung die Leberregeneration nach IP-Behandlung nachhaltig eingeschränkt. Im Gegensatz dazu waren die regenerativen Vorgänge nach MP-Behandlung nicht schneller, aber doch mit einer vergleichbaren Kinetik zu unbehandelten, ischämischen Kontrollen abgelaufen. Zusammenfassend gilt, daß sowohl IP- als auch MP-Behandlung die Ischämie/Reperfusionsschädigung deutlich reduzieren. Dies hat jedoch keinen positiven Einfluß auf die nachfolgende Regeneration nach Leberteilresektion mit Pringle-Manöver. / The present study analyses two strategies to protect from hepatic ischemia-reperfusion injury: ischemic preconditioning (IP) and pharmacologic administration of methylprednisolone (MP). First, the extent of hepatocellular damage after warm liver ischemia induced by cross clamping of the hepatic vessels in the hepatoduodenal ligament (Pringle manöver) was analysed demonstrating comparable tissue protection by both treatment modalities. After 70% partial hepatectomy including Pringle manöver however, the hepatocellular regerneration was markedly decreased after IP treatment, despite reduced ischemia-reperfusion injury. Moreover, MP treatment did not improve hepatic regeneration since it showed a comparable timing to untreated, ischemic controls. In conclusion, both IP and MP significantly reduced hepatic ischemia-reperfusion injury. However, no beneficial effects on hepatocellular regeneration after partial hepatectomy including pringle manöver were observed.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist die retrospektive Beurteilung der Sicherheit und Effektivität der Leberteilresektion bei der Behandlung von Lebermetastasen des kolorektalen Karzinoms sowie der Re-Resektion bei Patienten mit Rezidivlebermetastasen. Weiterhin soll das operative Vorgehen bei synchronen Lebermetastasen hinsichtlich simultaner Resektionsverfahren und zweizeitigen Vorgehens untersucht werden. Insgesamt wurden die Ergebnisse von 660 Patienten ausgewertet, die zwischen 1988 und 2004 mit 685 Leberteilresektionen behandelt wurden. Unter diesen waren 75 Patienten, die eine Re-Resektion erhielten sowie 202 Patienten, bei denen die Lebermetastasen synchron auftraten. Neben der Analyse der postoperativen Letalität und postoperativen Komplikationen sollen prognostische Faktoren für das Langzeitüberleben und das Auftreten von Tumorrezidiven nach Leberteilresektion identifiziert werden. Da sich die Studienpopulation aus einem Zeitraum von über 15 Jahren rekrutiert, sollen außerdem verschiedene Zeitabschnitte vergleichend analysiert werden. Die Leberteilresektion ist derzeit die einzige potentiell kurative Therapie bei kolorektalen Lebermetastasen. Als prognostisch günstige Parameter in der multivariaten Analyse zeigten sich die Radikalität des Eingriffes, die Anzahl der Metastasen, vorhandene ligamentäre Lymph-knotenmetastasen sowie das Jahr der Resektion. Auch bei Rezidiven kolorektaler Lebermetastasen ist das chirurgische Vorgehen derzeit die einzige kurative Intervention. Re-Resektionen weisen ein vergleichbares operatives Risiko und vergleichbare Langzeitüberlebensraten auf wie Erstresektionen. Als einziger prognostischer Parameter für das Langzeitüberleben erwies sich in der multivariaten Analyse die Radikalität des Eingriffes. Bei synchronen Lebermetastasen sind die wichtigsten Kriterien, um eine simultane Resektion durchzuführen, die Berücksichtigung des Alters sowie des Resektionsausmaßes. Simultane Resektionen sind bei synchronen kolorektalen Lebermetastasen dann so sicher und effizient durchführbar wie Resektionen im zweizeitigen Vorgehen.

Ziel der vorliegenden Arbeit ist die retrospektive Beurteilung der Sicherheit und Effektivität der Leberteilresektion bei der Behandlung von Lebermetastasen des kolorektalen Karzinoms sowie der Re-Resektion bei Patienten mit Rezidivlebermetastasen. Weiterhin soll das operative Vorgehen bei synchronen Lebermetastasen hinsichtlich simultaner Resektionsverfahren und zweizeitigen Vorgehens untersucht werden. Insgesamt wurden die Ergebnisse von 660 Patienten ausgewertet, die zwischen 1988 und 2004 mit 685 Leberteilresektionen behandelt wurden. Unter diesen waren 75 Patienten, die eine Re-Resektion erhielten sowie 202 Patienten, bei denen die Lebermetastasen synchron auftraten. Neben der Analyse der postoperativen Letalität und postoperativen Komplikationen sollen prognostische Faktoren für das Langzeitüberleben und das Auftreten von Tumorrezidiven nach Leberteilresektion identifiziert werden. Da sich die Studienpopulation aus einem Zeitraum von über 15 Jahren rekrutiert, sollen außerdem verschiedene Zeitabschnitte vergleichend analysiert werden. Die Leberteilresektion ist derzeit die einzige potentiell kurative Therapie bei kolorektalen Lebermetastasen. Als prognostisch günstige Parameter in der multivariaten Analyse zeigten sich die Radikalität des Eingriffes, die Anzahl der Metastasen, vorhandene ligamentäre Lymph-knotenmetastasen sowie das Jahr der Resektion. Auch bei Rezidiven kolorektaler Lebermetastasen ist das chirurgische Vorgehen derzeit die einzige kurative Intervention. Re-Resektionen weisen ein vergleichbares operatives Risiko und vergleichbare Langzeitüberlebensraten auf wie Erstresektionen. Als einziger prognostischer Parameter für das Langzeitüberleben erwies sich in der multivariaten Analyse die Radikalität des Eingriffes. Bei synchronen Lebermetastasen sind die wichtigsten Kriterien, um eine simultane Resektion durchzuführen, die Berücksichtigung des Alters sowie des Resektionsausmaßes. Simultane Resektionen sind bei synchronen kolorektalen Lebermetastasen dann so sicher und effizient durchführbar wie Resektionen im zweizeitigen Vorgehen.