Orientador: Selma Giorgio / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-08-02T22:39:32Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Silva_WagnerWelberArraisda_M.pdf: 3615109 bytes, checksum: 4ad56b306a1d94d293f6c223070386d6 (MD5) Previous issue date: 2003 / Resumo: As infecções, em geral, provocam mudanças na pressão parcial de oxigênio tornando o microambiente tecidual hipóxico (oxigenação diminuída). O fluxo sangüíneo alterado, a isquemia e a proliferação de células e microrganismos infectantes são alguns dos fatores responsáveis pela hipóxia associada às infecções. Os macrófagos se adaptam a ambientes hipóxicos, alterando o metabolismo, a produção de linfocinas pró-inflamatórias e as atividades exo, endo e fagocíticas. A lesão causada pelo parasita Leishmania amazonensis tem as características que levam a hipóxia tecidual, como a presença de um grande número de amastigotas em divisão, a migração de células inflamatórias, as infecções secundárias com bactérias aeróbicas e anaeróbicas e as mudanças no fluxo sangüíneo tecidual. Assim, analisamos neste trabalho o papel da hipóxia no modelo in vitro da infecção com L. amazonensis e investigamos os possíveis mecanismos de reversão deste ambiente na evolução da lesão na leishmaniose murina, utilizando a terapia com oxigênio hiperbárico. A cultura de macrófagos J774 incubada com amastigotas em ambiente hipóxico (5% de O2) apresentou diminuição da porcentagem de células infectadas quando comparada ao controle normóxico, mas manteve o mesmo percentual de infecção ao ser ativada com gIFN e LPS e não apresentou na produção de nitrito. O tratamento com oxigênio hiperbárico em formas promastigotas e amastigotas inibiu o crescimento e a diferenciação celular. Camundongos BALB/c tratados com oxigênio hiperbárico (1h/dia, 2,5 ATA e 100% de 02) mostraram uma significativa diminuição do tamanho da lesão. Houve diminuição do processo edematoso e conseqüente melhora do fluxo sangüíneo local, mas ocasionou um precoce comprometimento sistêmico com diminuição da sobrevida dos camundongos tratados. Concluímos que a hipóxia é um importante estimulador/ativador de macrófagos e que a restrição de O2 resulta em uma produção deficiente de nitrito, mas não impede que as células restrinjam a infecção com L. amazonensis. Os mecanismos pelos quais os macrófagos matam os amastigotas não são ainda conhecidos, mas podemos sugerir uma ação independente de NO, como, por exemplo, o aumento da atividade lisossomal. Sugerimos também que a HBO favoreceu a metástase, apesar da significativa melhora no fluxo sangüíneo da área lesionada, propiciando futuros estudos sobre o efeito adjuvante do oxigênio hiperbárico com drogas anti-parasitárias no modelo murino da leishmaniose e de outros parasitas / Abstract: Infections can cause the formation of hypoxic areas (low PO2). The altered blood flow, isquemia, cell proliferation and the presence of microorganisms causes hypoxia in injured tissues. Macrophages adapt to the presence of hypoxia and alter their metabolism, pro-inflammatory lymphokines production and phagocytosis activity. Lesions induced by Leishmania amazonensis are characterized by a large number of amastigotes, inflammatory cells migration, secondary infection with anaerobic and aerobic bacteria and altered tissue blood flow which can cause chronic areas of hypoxia. We have analyzed the effect of hypoxia on L. amazonensis in vitro and in vivo models and also studied the effect of hyperbaric therapy on murine leishmaniasis. The murine 1774 macrophages cultures infected with L. amazonensis amastigotes under hypoxic conditions (5% Oz) showed a decrease in the number of infected cells compared with cell cultures infected in normoxia (21% O2). However macrophage cultures activated with gamma-interferon and bacterial lipopolisaccharides showed the same percentage of infected cells compared with non stimulated macrophages in hypoxia and, no significant nitrite production. Hyperbaric treatment inhibited the growth and differentiation of L. amazonensis promastigotes and amastigotes. In addition BALB/c mice infected with L. amazonensis and treated with hyperbaric therapy (1 hour/day, 2.5 ATA, 100% O2) showed a significant decrease of lesions size. We also observed a decreased of the edematous process, an improvement of local blood flow, and early metastasis. Taken together our results provided evidences that hypoxia is an important stimulator/activator factor for L. amazonensis killing macrophages and also that hyperbaric therapy can be tested as an adjuvant therapy with anti-leishmanial drugs / Mestrado / Mestre em Parasitologia

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Patologia Molecular, 2016. ____________________________________________________________________________________________________ / Em atenção aos artigos 11 e 96 da Lei nº 9.279/96 (Lei da Propriedade Industrial) e em consonância com a Resolução CAD 005/2008 da Universidade de Brasília, informamos que o presente trabalho somente foi publicado na data indicada neste informativo. A respectiva defesa, para obtenção do título pretendido, foi realizada na modalidade de sessão fechada, conforme a documentação anexada, de forma que o requisito da novidade, exigida nos referidos artigos da Lei, foi devidamente preservado. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-12-02T16:09:04Z No. of bitstreams: 1 2016_HerickSampaioMüller_Parcial.pdf: 2537971 bytes, checksum: 0e36706acc171881428e752f4348e1a4 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-01-04T20:37:33Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_HerickSampaioMüller_Parcial.pdf: 2537971 bytes, checksum: 0e36706acc171881428e752f4348e1a4 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-04T20:37:33Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_HerickSampaioMüller_Parcial.pdf: 2537971 bytes, checksum: 0e36706acc171881428e752f4348e1a4 (MD5) / A leishmaniose é uma antropozoonose que possui diferentes manifestações clinicas, sendo transmitida durante o repasto sanguíneo de flebotomíneos e causada por várias espécies de parasitos do gênero Leishmania. Esta doença causa grandes agravos na saúde humana em escala global, com altas taxas de mortalidade anualmente. Inúmeros fatores de risco impulsionam a transmissão do parasito para áreas anteriormente não endêmicas provocados tanto pelo ser humano quanto por variações naturais do ambiente. O controle da leishmaniose visceral (LV) no Brasil se faz por meio da detecção e eliminação dos reservatórios da doença, controle das populações de vetor, prevenção do contato com vetores infectados e tratamento dos casos humanos. No entanto, essas medidas são aplicadas frequentemente de forma isolada e tem-se mostrado limitadas. Como consequência, observase a manutenção ou mesmo expansão da LV para áreas onde sua ocorrência não era registrada. Nesse contexto, medidas que visem à redução da transmissão e suas aplicações de forma integrada são de fundamental importância, tais como o diagnóstico precoce e com alta sensibilidade dos humanos e dos cães infectados, tratamento eficaz e o emprego de vacinas. O diagnóstico tradicional da LV é baseado na presença de anticorpos anti-Leishmania e o padrão-ouro é a visualização de formas amastigotas do parasito em amostras biológicas. No entanto, a introdução da vacinação de cães nos últimos anos gera a necessidade de novos métodos sorológicos capazes de diferenciar entre animais vacinados e infectados. Assim, o objetivo do presente trabalho foi avaliar a metalopeptidase mitocondrial zinco dependente, secretada de L. infantum como marcador para diagnóstico sorológico de LV. A análise in sílico revelou que a proteína teria 47,35% de resíduos de aminoácidos expondo sua superfície ao solvente e nestas áreas foram encontradas possíveis zonas para epitopos de células B, sítios de glicosilação e fosforilação. A expressão das proteínas em sistemas diferentes possibilitou avaliar a imunogenicidade das proteínas heterólogas com e sem modificações pós-traducionais contra soro de cães infectados e sadios. O resultado do ensaio de ELISA mostrou altos índices de anticorpos específicos contra as proteínas heterólogas e a comparação dos resultados indicou que a proteína heteróloga expressa em modelo procarioto identificou todos os animais infectados nas diluições 1:50 e 1:100 de soro. Os dados estatísticos do teste t mostraram p value < 0.01, dando credibilidade na hipótese de uso desta proteína em possível diagnóstico para LV. O estudo realizado apresenta informações relevantes sobre o uso da metalopeptidase estudada para que possa ser associada ao melhoramento do diagnóstico da LV. Testes para definição da sensibilidade e especifidade fazem-se necessários em futuros trabalhos. / Leishmaniasis is a anthropozoonosis with different clinical manifestations, being transmitted by sandfly during blood feeding and caused by several species of parasites of the genus Leishmania. This disease causes major health problems on a global scale, with high mortality rates annually. Several risk factors drive the transmission of the parasite to areas not previously endemic due to man activities and by natural environmental variations. Control of visceral leishmaniasis (VL) in Brazil is made through the detection and elimination of disease reservoirs, control of vector populations, preventing contact with infected vectors and treatment of human cases. However, these measures are often applied in isolation and has shown limited 0efficacy. As a result, there is the maintenance or expansion of the VL to areas where their occurrence was not recorded. In this context, measures aimed to reduce transmission and its applications in an integrated manner are of fundamental importance, such as early diagnosis with high sensitivity of humans and infected dogs, effective treatment and the use of vaccines. Traditional diagnosis of VL is based on the presence of anti-Leishmania antibodies and the gold standard is the visualization of amastigote forms of the parasite in biological samples. However, the introduction of vaccination of dogs in recent years creates the need for new serological methods able to differentiate between vaccinated and infected animals. The objective of this study was to evaluate the metallopeptidase zinc dependent secreted from L. infantum, as a marker for serological diagnosis of VL. In silico analysis revealed that the protein had 47.35% of amino acid residues exposed to the solvent, exhibiting on your surface areas for possible B cell epitopes, glycosylation and phosphorylation sites. The expression of proteins in different systems allowed to assess the immunogenicity of the heterologous proteins, with and without post-translational modifications, against sera from infected and healthy dogs. The results of the ELISA assay showed high levels of specific antibodies against heterologous proteins and the comparison of the results shows that heterologous protein expressed in a prokaryotic model was able to differentiate all infected animals at dilutions 1:50 and 1: 100 serum. Statistical analysis emphasize the potential of this protein to be used in diagnosis for VL. The study presents relevant information on the use of metallo-peptidase studied so it can be associated with the improvement of the diagnosis of VL. Tests to define the sensitivity and specificity are made necessary in future work.