Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, 2015. / Submitted by Raquel Viana (raquelviana@bce.unb.br) on 2015-10-20T19:44:19Z No. of bitstreams: 1 2015_WilsonOliveiraSantos.pdf: 885429 bytes, checksum: 5be36bd125c215438c3dad1144fa155e (MD5) / Approved for entry into archive by Marília Freitas(marilia@bce.unb.br) on 2015-11-11T14:02:31Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_WilsonOliveiraSantos.pdf: 885429 bytes, checksum: 5be36bd125c215438c3dad1144fa155e (MD5) / Made available in DSpace on 2015-11-11T14:02:31Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_WilsonOliveiraSantos.pdf: 885429 bytes, checksum: 5be36bd125c215438c3dad1144fa155e (MD5) / A leucemia linfoide crônica (LLC) é uma doença linfoproliferativa em que há acúmulo de células B monoclonais na medula óssea, sangue periférico, linfonodos e baço. O curso clínico da LLC é bastante variável, sendo os sintomas mais comuns o acúmulo de linfócitos B e, nos casos mais graves, a ocorrência de hepatomegalia, esplenomegalia, anemia e trombocitopenia. Embora a fisiopatologia da doença seja desconhecida, alguns marcadores prognósticos da LLC são bem definidos, sendo a expressão de ZAP70+ um dos mais avaliados. Atualmente, a fisiopatologia de diversos tipos de neoplasias tem sido relacionada a mecanismos epigenéticos. Nessa linha, nosso grupo recentemente demonstrou o envolvimento da família SMYD no desenvolvimento da leucemia linfoide aguda. Essa associação da família SMYD com uma neoplasia linfoide nos levou a desenvolver o presente trabalho, em que investigamos o padrão de expressão gênica de componentes da família SMYD em amostras de LLC e avaliamos a influência desse achado sobre dados laboratoriais como leucometria, número de plaquetas, expressão da proteína ZAP70 e achados citogenéticos dos pacientes estudados. Para isso, usamos 59 amostras de LLC e 10 amostras de células B obtidas de doadores saudáveis, como controles. Os pacientes com LLC foram submetidos a coleta de sangue para determinação do hemograma. Por citometria de fluxo determinamos a expressão da proteína ZAP-70 nas células B leucêmicas. Além disso, todas as amostras foram submetidas à análise citogenética e a extração de RNA para a análise do perfil de expressão genica da família SMYD por PCR em tempo real. Analisando as características clínicas e laboratoriais dos pacientes com LLC enrolados no estudo, 66% dos casos foram classificados como Binet A, 22% como Binet B e 12% como Binet C. Nessa amostragem, 25% dos casos apresentaram cariótipo normal e 75% dos casos apresentaram algum tipo de alteração citogenética. As amostras de células B leucêmicas e normais não expressaram SMYD1. Entretanto, as células da LLC, comparadas as amostras controle, apresentaram maior expressão de SMYD2, SMYD3, SMYD4 e SMYD5. Tendo em vista a heterogeneidade na expressão desses genes pelas amostras de LLC, as amostras neoplásicas foram dicotomizadas em casos de baixa e alta expressão dos membros SMYD. As amostras que tiveram menor expressão de SMYD2, SMYD3 e SMYD4 dentro do grupo de LLC apresentaram maior número de leucócitos, comparadas aos casos de maior expressão desses genes. É interessante, pois essas amostras com baixa expressão de SMYD2 e SMYD3 apresentaram um elevado índice de alterações citogenéticas complexas, que é um indicador de progressão e de mau prognóstico na LLC. Outro aspecto importante é que existe forte correlação entre a expressão dos genes SMYDs na LLC, indicando a possibilidade de existir na LLC um mecanismo de regulação comum para indução da expressão dos membros dessa família. Por fim, mais estudos são necessários para estabelecer os mecanismos pelo qual essas metiltransferases regulam a evolução da LLC. Esses resultados poderão servir de base para o desenvolvimento de novas estratégias terapêuticas para prevenir a progressão da LLC. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a lymphoproliferative disease that coexists with monoclonal B cells accumulated in the bone marrow, peripheral blood, lymph nodes and spleen. The clinical course of CLL is highly variable, and the most common symptoms are the accumulation of B lymphocytes and, in severe cases, the occurrence of hepatomegaly, splenomegaly, anemia and thrombocytopenia. Although the pathophysiology of the disease is unknown, some CLL prognostic markers are well defined, being the expression of ZAP70+ is one of the most assessed. Recently, the pathophysiology of various types of cancers has been linked to epigenetic mechanisms. In this line, our group recently demonstrated the involvement of SMYD family in the development of acute lymphocytic leukemia. This association of SMYD family with a lymphoid neoplasia led us to develop this work, in which we investigated the gene expression of SMYD members in CLL samples and evaluated the influence of this finding on white blood cell count, platelet count, expression of ZAP70 protein and cytogenetic findings. For this purpose, we recruited 59 CLL samples and 10 normal B-cells. ZAP-70 protein expression was determined by flow cytometry. In addition, all samples were subjected to cytogenetic analysis and RNA extraction, in order to study the genetic profile expression of SMYD family by real time PCR. Analyzing the clinical and laboratorial characteristics of patients with CLL enrolled in the study, 66% of cases were classified as Binet A, 22% as Binet B and 12% as Binet C. Normal karyotype was detected in 25% of cases, while 75% of cases presented some type of alteration cytogenetic. SMYD1 gene expression was not detected in CLL and in normal B-cells. However, compared to the control group, patients with CLL showed higher levels of the genes SMYD2, SMYD3, SMYD4 and SMYD5. Taking into account that the expression of the genes evaluated was heterogeneous among the CLL patients, we used the median value of genes expression as the cut-off to dichotomize CLL patients in ―low‖ and ―high‖ SMYD gene expression. Interestingly, patients with residual expression of SMYD2, SMYD3 and SMYD4 possess high WBC count. More important, these samples with low expression of SMYD2 and SMYD3 expression presented complex cytogenetic alterations, in contrast to the cases where the expression of these genes is high, where the karyotype was normal. Another important aspect is that there is a strong correlation among the SMYDs genes, indicating the possible existence of a common regulatory mechanism of induction of these genes in this cancer. Additional studies are required to establish the complete mechanism by wich these methyltransferases regulate the evolution of the CLL. These results may provide an important starting point for studies aiming to develop new therapeutic strategies to prevent CLL progression.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas, 2016. / Submitted by Camila Duarte (camiladias@bce.unb.br) on 2016-10-04T15:58:08Z No. of bitstreams: 1 2016_JulianaCarvalhoRochaAlvesdaSilva.pdf: 855628 bytes, checksum: 823ea873caefea29e8d4a65f4c6465a6 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2017-02-16T17:57:35Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_JulianaCarvalhoRochaAlvesdaSilva.pdf: 855628 bytes, checksum: 823ea873caefea29e8d4a65f4c6465a6 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-02-16T17:57:35Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_JulianaCarvalhoRochaAlvesdaSilva.pdf: 855628 bytes, checksum: 823ea873caefea29e8d4a65f4c6465a6 (MD5) / A leucemia linfoide crônica (LLC) é uma doença linfoproliferativa que resulta no acúmulo de células B monoclonais na medula óssea, sangue periférico, linfonodos e baço. O diagnóstico dessa doença costuma ocorrer após os 70 anos de idade, sendo mais frequente em homens do que em mulheres. Além disso, esta é a leucemia mais prevalente nos países ocidentais. Embora a etiologia da doença seja desconhecida, alguns fatores prognósticos são bem conhecidos como a expressão da proteína ZAP-70, alta contagem de células malignas (leucocitose) associado ao tempo de duplicação linfocitária e alterações cariotípicas específicas ou aquisição de cariótipo complexo (3 ou mais alterações cariotípicas). Atualmente, a fisiopatologia de diversos tipos de neoplasias tem sido relacionada a mecanismos epigenéticos. Nesse sentido, foi demonstrado que a expressão das enzimas Histona Metiltransferases (HMTs) das famílias Euchromatic Histone-Lysine N-Methyltransferase (EHMT) e Suppressor Of Variegation (SUV) podem estar relacionadas à instabilidade genômica e ao pior prognóstico de alguns tipos de câncer. Considerando essas associações, investigamos nesse trabalho a expressão dos genes membros das famílias EHMT e SUV em pacientes com LLC e associamos esses achados a marcadores de prognóstico, como: expressão da proteína ZAP-70, cariótipo e leucometria desses pacientes. Nesse trabalho, observamos que a baixa expressão do gene SUV39H1 está associada à aquisição de anormalidades citogenéticas em pacientes com LLC. A expressão elevada de SUV39H2 está associada à baixa contagem de plaquetas e a um maior número de casos com alterações cariotípicas. A baixa expressão de SUV4-20H1 está relacionada com maior leucometria, enquanto que a baixa expressão de SUV4-20H2 está associada à expressão elevada de ZAP-70. EHMT1 se mostrou com expressão elevada nas amostras de LLC, enquanto que EHMT2, embora não tenha apresentado expressão diferencial entre LLC e pacientes saudáveis, está associado à aquisição de cariótipo complexo nessa doença. Nossos dados evidenciam que as famílias de metiltransferases SUV e EHMT estão associadas à aquisição de indicadores de mau prognóstico na LLC, como contagem de plaquetas, maior número de células malignas, expressão de ZAP-70 e aquisição de cariótipo complexo. Esses dados contribuem para a área de epigenética e câncer, podendo servir de base para o desenvolvimento de novas abordagens terapêuticas que visem controlar processos epigenéticos na LLC. / Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is a lymphoproliferative disease that results in accumulation of monoclonal B cells in bone marrow, peripheral blood, lymph nodes and spleen. The diagnosis of LLC occurs, normally, after 70 years, affects slightly more men and this disease is the most common leukemia in Western countries. Although the etiology of the CLL is unknown, some prognostic factors are well known as the expression of ZAP-70, the high quantity of malignant cells (leukocytosis) associated with lymphocyte duplicating time and karyotype changes or acquisition of complex karyotype (three or more karyotype alterations). Currently, the pathophysiology of various types of cancers has been linked to epigenetic mechanisms. In this line, it was shown that the expression of the enzymes histone methyl Transferases (HMTs) of Euchromatic Histone-Lysine N-Methyltransferase (EHMT) and Suppressor Of Variegation (SUV) families may be related to genomic instability and to bad prognosis markers of some cancers. Considering these associations, we investigated in this study the expression of EHMT and SUV members in CLL samples. Furthermore, we investigated the association of gene expression analysis and prognosis markers, like: ZAP-70 expression, karyotype and white blood cell count of these patients. In this study, we found that low expression of SUV39H1 gene is associated with the presence of cytogenetic abnormalities in patients with CLL. The high expression of SUV39H2 is associated with low platelet count and with the presence of cytogenetic abnormalities. Low SUV4-20H1 expression is related to the accumulation of leukocytes, while the low SUV4-20H2 expression influences the expression of ZAP-70. EHMT1 was high expressed in LLC, while EHMT2 was associated with the presence of complex karyotype in this disease. Our data clearly show that the methyltransferases SUV and EHMT influence generally in CLL, being associated with the presence of bad prognosis markers in this disease, including platelet count, accumulation of malignant cells, expression of ZAP-70 and abnormal karyotype. These results may provide the basis for the development of new therapeutic strategies to prevent CLL progression.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Ciências da Saúde, 2015. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2015-11-25T14:47:40Z No. of bitstreams: 1 2015_FlaviaZattarPiazera.pdf: 5140389 bytes, checksum: 90224636e1ced48a74926f8c49f65060 (MD5) / Approved for entry into archive by Patrícia Nunes da Silva(patricia@bce.unb.br) on 2016-05-27T14:32:09Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2015_FlaviaZattarPiazera.pdf: 5140389 bytes, checksum: 90224636e1ced48a74926f8c49f65060 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-05-27T14:32:09Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2015_FlaviaZattarPiazera.pdf: 5140389 bytes, checksum: 90224636e1ced48a74926f8c49f65060 (MD5) / A Leucemia Linfocítica Crônica (LLC) é a neoplasia linfoide crônica mais comum na população ocidental. Assim, várias pesquisas têm sido desenvolvidas para elucidação dos fatores genéticos envolvidos na biologia e progressão da LLC. Alterações epigenéticas têm se mostrado cada vez mais relevantes na gênese de vários tumores e em especial nas neoplasias linfóides agudas e crônicas, e tem como características básicas não causar modificações na sequência do DNA. A metilação de histonas é um dos principais e mais estudados eventos epigenéticos. A família SETD é composta por 10 genes que codificam proteínas com domínio SET. Este domínio está envolvido na metilação de resíduos de lisina em histonas e proteínas não histonas. Até o momento, desconhece-se a relação de genes da família SETD com a leucemogênese da LLC. No presente estudo, foi realizada a avaliação de expressão relativa dos genes da família SETD em 59 amostras de sangue periférico de pacientes portadores de LLC e 10 controles normais através da técnica de PCR em tempo real. O perfil de expressão comparativa dessa família de genes foi correlacionado com as informações clínicas, citogenéticas, imunofenotípicas e hematológicas de maior relevância prognóstica dos pacientes. Notamos que a hipoexpressão do geneSETD1Aapresenta-se correlacionado com instabilidade cromossômica. O gene SETD2 apresentou elevada contagem de leucócitos no grupo de alta expressão, inferindo elevada massa tumoral. A superexpressão do gene SETD5 define um marcador de progressão da doença devido a elevada contagem de leucócitos nos pacientes do grupo de baixa expressão associado a anormalidades citogenéticas. O gene SETD6 apresentou hipoexpressão nos portadores de LLC em relação aos controles. O gene SETMAR apresentou-se hiperexpresso nos portadores de LLC em relação aos controles. Entretanto, no grupo de pacientes com baixa expressão a contagem leucocitária mostrou-se elevada estando associado a predominância de anormalidades citogenéticas e baixa contagem plaquetária. Sugerimos que nos portadores de LLC, a hipoexpressão do gene SETMAR esteja associada com instabilidade cromossômica e progressão da massa tumoral (aumento da leucocitose). Concluímos que os genes da família SETD possam futuramente ser considerados marcadores evolutivos da LLC. / The Chronic lymphocytic leukemia (CLL) is the most common chronic lymphoid malignancy in the western population. Thus, several studies have been developed to elucidate the genetic factors involved in biology and progression of CLL. Epigenetic changes have been shown to be increasingly important in the genesis of various tumors and especially in acute and chronic lymphoid malignancies, and its basic features do not cause changes in the DNA sequence. The histone methylation is one of the leading and most studied epigenetic events. The SETD family consists of 10 genes encoding proteins with SET domain. This domain is involved in methylation of lysine residues on histones and non-histone proteins. So far, unknown whether the genes ratio SETD family with the leukemogenesis LLC. In the present study, we evaluatedthe expression of all SETD family genes in peripheral blood from 59 CLL patients and 10 healthy donors by real time PCR. The expression profile of this gene family was correlated with the most relevant clinical, cytogenetic, immunophenotypic and hematologic prognostic factors of CLL patients. We note that hipoexpressionofSETD1A gene correlated with chromosomal instability.SETD2 gene expression was associated with a high white blood cell count in a dicotomized group of patients with high expression this gene, implying high tumor mass formation when SETD2 is over-expressed. In addition, overexpression of the gene SETD5 sets a marker of disease progression due to higher leukocyte count in patients in the low expression group associated with cytogenetic abnormalities. In the other hand, gene SETD6 was significantely downregulated in patients with CLL compared to controls. Finally, SETMAR gene was found to be upregulated in patients with CLL compared to controls. However, in patients with low expression of SETMAR, we found an increase in leukocyte count as well as in the predominance of cytogenetic abnormalities and low platelet count. We suggest that in patients with CLL, the low expression of SETMAR is associated with chromosomal instability and progression of the tumor mass (increased leukocytosis). We conclude that SETD family genes can be considered future evolutionary markers for CLL.