ARAÚJO, Ana Jérsia. Estudo das propriedades citotóxica da nor-ß-lapachona e seu derivado nitrofenilamino em células HL-60. 2009. 95 f. Dissertação (Mestrado em Farmacologia) - Universidade Federal do Ceará. Faculdade de Medicina, Fortaleza, 2009. / Submitted by denise santos (denise.santos@ufc.br) on 2012-03-05T15:41:13Z No. of bitstreams: 1 2009_dis_ajaraújo.pdf: 1934517 bytes, checksum: 316a2f473392dc4b8e5c026431688ffa (MD5) / Approved for entry into archive by Eliene Nascimento(elienegvn@hotmail.com) on 2012-03-07T11:36:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2009_dis_ajaraújo.pdf: 1934517 bytes, checksum: 316a2f473392dc4b8e5c026431688ffa (MD5) / Made available in DSpace on 2012-03-07T11:36:52Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2009_dis_ajaraújo.pdf: 1934517 bytes, checksum: 316a2f473392dc4b8e5c026431688ffa (MD5) Previous issue date: 2009 / The quinone moiety has been identified as an important pharmacophoric group for cytotoxic activity of several compounds clinically used, constituting just one of the major classes of anticancer agents. β-lapachone is one of the most studied quinones in the last years. Its most important applications are related to its action against several cancer cells. Its derivative, nor-β-lapachone (compound 1), has similar anticancer activity. Thus, the aim of this work was to evaluate the mechanism of action involved in nor--lapachone and its nitrophenylamino derivative (compound 2) cytotoxicity in a leukemia cells model of HL-60 cell line. Initially it was investigated the effect of both the compounds on HL-60 cells viability after 24 hours of incubation, showing IC50 values of 2.92 and 0.48 μM to compounds 1 and 2, respectively. Considering the selectivity, compound 1 showed strong selectivity to cancer cells, while its derivative was only partially selective. Studies performed in HL-60 cells, after 24 hours, indicated that compound 2 induces cell death by apoptosis as showed by morphological changes, DNA fragmentation, mitochondrial membrane depolarization and phosphatidylserine externalization. Both tested compounds increased generation of reactive oxygen species (ROS). Our results suggest that a nitrophenylamino radical introduction at position 3 of the furane ring enhances the cytotoxicity of nor--lapachone in HL-60 cell line. These findings highlight the potential of these synthetic quinones as prototypes molecules to produce new compounds with anticancer properties. / O esqueleto quinona foi identificado como um importante grupo farmacofórico para atividade citotóxica de vários compostos utilizados na clínica, constituindo ainda uma das maiores classes de agentes anticâncer. A β-lapachona é uma das quinonas mais estudadas nos últimos anos. Suas aplicações mais importantes estão relacionadas às ações contra várias células tumorais. Seu derivado, nor-β-lapachona (composto 1), tem atividade anticâncer similar. Assim, o objetivo desse trabalho foi avaliar o mecanismo de ação envolvido na citotoxicidade do composto 1 e de seu derivado nitrofenilamino (composto 2) em células leucêmicas HL-60. Inicialmente foi investigado o efeito desses compostos na viabilidade de células HL-60 após 24 horas de incubação, mostrando CI50 de 2,92 e 0,48 μM para os compostos 1 e 2, respectivamente. Acerca da seletividade celular, o composto 1 mostrou forte seletividade para células tumorais, enquanto que o seu derivado foi apenas parcialmente seletivo. Estudos feitos em células HL-60 indicaram que o composto 2 induz morte celular por apoptose como mostrado pelas mudanças morfológicas, fragmentação do DNA, despolarização da membrana mitocondrial e externalização da fosfatidilserina. Ambos compostos aumentaram a geração de espécies reativas de oxigênio (EROs). Nossos resultados sugerem que a introdução do radical nitrofenilamino na posição 3 do anel furano aumenta a citotoxicidade da nor--lapachona em células HL-60. Esses achados apontam para o potencial dessas quinonas sintéticas como modelo para a produção de novos compostos com propriedades anticâncer.

Angiogênese é o termo utilizado para descrever o crescimento de novos vasos sanguíneos a partir dos já existentes. Vários estudos demonstraram a densidade microvascular (DMV) como um fator prognóstico nas leucemias, em particular, leucemia promielocítica aguda (LPA). Este subtipo de leucemia corresponde a cerca de 20 a 25% das leucemias mielóides agudas nos países latino-americanos e apresenta características clínicas, morfológicas e biológicas peculiares. A halofuginona (HF), originalmente descrita como um agente antifúngico apresenta capacidade de inibir o crescimento tumoral e formação de vasos em modelos animais de tumores sólidos. Estudos realizados por nosso grupo demonstraram que a HF inibiu a secreção do VEGF e a proliferação de linhagens celulares de LPA. Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo determinar o potencial antiproliferativo e antiangiogênico da HF em um modelo experimental in vivo da LPA e avaliar os mecanismos subjacentes a sua ação. Primeiramente, a análise do ciclo celular em células NB4 tratadas com HF apresentou significativa diminuição da proliferação celular (2,093 ± 0,304 vs. 41,21 ± 3,25), juntamente com um aumento significativo da apoptose (12,53 ± 1,53 vs. 21,95 ± 0,79; p=0,0007). Por meio da técnica de Real Time Array foi possível identificar dois grupos de genes associados a apoptose celular diferencialmente expressos em células tratadas com HF: TNF, TNFRSF9, TNFTSF10B, CD40, FAS, CASP10, CASP8 e CASP3, sugerindo que a HF induz a via extrínseca de apoptose. A análise in vivo da HF foi realizada em camundongos NOD/SCID previamente irradiados e transplantados com células leucêmicas PML-RAR murinas. Camundongos tratados com HF, por 21 dias após o transplante não apresentaram remissão molecular, determinada pela amplificação do gene PML-RARA por PCR, porém foi observada menor infiltração leucêmica em relação aos camundongos não tratados (Leucócitos: 4,2 ± 3,89 vs. 20,6 ± 21,9; p<0.0001); Hemoglobina: 12,0 ± 1,40 vs. 9,6 ± 1,67; p<0.0001; e Plaquetas: 932,0 ± 122,5 vs. 552,0 ± 83,2; p<0.001 respectivamente) e um menor peso relativo do baço (0,006 vs. 0,012, p=0,0415). Ademais, a contagem diferencial e imunofenotipagem da medula óssea evidenciaram menor porcentagem de células mielóides imaturas (16,88 ± 6,27 vs. 44,06 ± 27,06). A HF também foi capaz de inibir a fosforilação de SMAD2 e consequentemente bloquear a via do TGF- em células NB4. No entanto, animais leucêmicos apresentaram menor nível sérico de TGF- em relação aos saudáveis e tratados (475,58 vs. 1.378,45/1.146,82 pg/mL; p<0,0001), sugerindo que o blasto leucêmico produz esta citocina e a diminuição de células leucêmicas resultou em diminuição dos níveis séricos de TGF-. A HF não aumentou a sobrevida dos animais leucêmicos e a elevação das enzimas hepáticas sugeriu que o tratamento foi hepatotóxico. Por fim, com relação à angiogênese, a análise da expressão gênica mostrou que o tratamento com HF inibiu a expressão de VEGF e EGF e o estudo por imunohistoquímica de seções da medula óssea evidenciou menor expressão VEGF (30 vs. 80%, p=0,0227), porém não houve diminuição da DMV. O conjunto desses resultados mostrou que a angiogênese é um importante alvo terapêutico na LPA, e que apesar da toxicidade, a HF apresenta potencial antileucêmico, tanto por conta de seus efeitos antiproliferativos e próapoptóticos, quanto por sua capacidade de inibir a produção de fatores próangiogênicos. / Angiogenesis is the term used to describe the growth of new blood vessels from the existing ones. Several studies have demonstrated the microvascular density (MVD) as a prognostic factor in leukemia, particularly acute promyelocytic leukemia (APL). This subtype of leukemia corresponds to 20-25% of acute myeloid leukemia in Latin America and presents clinical, morphological and biological peculiar characteristics. The halofuginone (HF) originally described as an antifungal agent has ability to inhibit tumor growth and vessel formation in animal models of solid tumors. Our group demonstrated that HF inhibits the VEGF secretion and cell proliferation in APL cell lineages. Thus, this study aimed to determine the antiproliferative and antiangiogenic potential of HF in an experimental model of APL in vivo and evaluate the mechanisms underlying its action. First, the cell cycle analysis in NB4 cells treated with HF showed a significant decrease in cell proliferation (2.093 ± 0.304 vs. 41.21 ± 3.25), along with a significant increase in apoptosis (12.53 ± 1.53 vs . 21.95 ± 0.79, p = 0.0007). Through Real Time Array it was possible to identify two groups of apoptosis associated genes differentially expressed in HF treated cells: TNF, TNFRSF9, TNFTSF10B, CD40, FAS, CASP10, CASP8 and CASP3, suggesting that HF induces apoptosis by extrinsic pathway. In vivo analysis of HF was performed in irradiated NOD/SCID mice transplanted with murine PML-RAR leukemic cells. Mice treated with HF for 21 days after transplantation showed no molecular remission as determined by amplification of PML-RARA gene by PCR, however minor leukemic infiltration was observed compared to untreated mice (leukocytes: 4.2 ± 3.89 vs . 20.6 ± 21.9, p <0.0001), hemoglobin: 12.0 ± 1.40 vs. 9.6 ± 1.67, p <0.0001, and Platelets: 932.0 ± 122.5 vs. 552.0 ± 83.2, p <0.001 respectively) and a lower relative weight of spleen (0.006 vs. 0.012, p = 0.0415). Furthermore, the differential count and immunophenotyping of bone marrow showed a lower percentage of immature myeloid cells (16.88 ± 6.27 vs. 44.06 ± 27.06). The HF was also able to inhibit the SMAD2 phosphorylation and consequently block the TGF- pathway in NB4 cells. However, leukemic animals presented lower serum TGF- compared to the healthy and treated (475.58 vs. 1378.45/1146.82 pg / mL, p <0.0001), suggesting that the leukemic blasts produces this cytokines and the decrease in leukemic cells resulted in decreased serum levels of TGF-. The HF did not increase the survival of leukemic animals and elevated liver enzymes suggested that the treatment was hepatotoxic. Finally, regarding angiogenesis, gene expression analysis showed that the HF treatment inhibited the expression of VEGF and EGF and the study by immunohistochemistry of sections of bone marrow showed less VEGF expression (30 vs. 80%, p = 0 0227), but there was no decrease in the MVD. Taken together, these results showed that angiogenesis is an important therapeutic target in APL, and despite the toxicity, HF has antileukemic potential, for both the antiproliferative and proapoptotic effects, and also for its ability to inhibit the production of proangiogenic factors.

Angiogênese é o termo utilizado para descrever o crescimento de novos vasos sanguíneos a partir dos já existentes. Vários estudos demonstraram a densidade microvascular (DMV) como um fator prognóstico nas leucemias, em particular, leucemia promielocítica aguda (LPA). Este subtipo de leucemia corresponde a cerca de 20 a 25% das leucemias mielóides agudas nos países latino-americanos e apresenta características clínicas, morfológicas e biológicas peculiares. A halofuginona (HF), originalmente descrita como um agente antifúngico apresenta capacidade de inibir o crescimento tumoral e formação de vasos em modelos animais de tumores sólidos. Estudos realizados por nosso grupo demonstraram que a HF inibiu a secreção do VEGF e a proliferação de linhagens celulares de LPA. Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo determinar o potencial antiproliferativo e antiangiogênico da HF em um modelo experimental in vivo da LPA e avaliar os mecanismos subjacentes a sua ação. Primeiramente, a análise do ciclo celular em células NB4 tratadas com HF apresentou significativa diminuição da proliferação celular (2,093 ± 0,304 vs. 41,21 ± 3,25), juntamente com um aumento significativo da apoptose (12,53 ± 1,53 vs. 21,95 ± 0,79; p=0,0007). Por meio da técnica de Real Time Array foi possível identificar dois grupos de genes associados a apoptose celular diferencialmente expressos em células tratadas com HF: TNF, TNFRSF9, TNFTSF10B, CD40, FAS, CASP10, CASP8 e CASP3, sugerindo que a HF induz a via extrínseca de apoptose. A análise in vivo da HF foi realizada em camundongos NOD/SCID previamente irradiados e transplantados com células leucêmicas PML-RAR murinas. Camundongos tratados com HF, por 21 dias após o transplante não apresentaram remissão molecular, determinada pela amplificação do gene PML-RARA por PCR, porém foi observada menor infiltração leucêmica em relação aos camundongos não tratados (Leucócitos: 4,2 ± 3,89 vs. 20,6 ± 21,9; p<0.0001); Hemoglobina: 12,0 ± 1,40 vs. 9,6 ± 1,67; p<0.0001; e Plaquetas: 932,0 ± 122,5 vs. 552,0 ± 83,2; p<0.001 respectivamente) e um menor peso relativo do baço (0,006 vs. 0,012, p=0,0415). Ademais, a contagem diferencial e imunofenotipagem da medula óssea evidenciaram menor porcentagem de células mielóides imaturas (16,88 ± 6,27 vs. 44,06 ± 27,06). A HF também foi capaz de inibir a fosforilação de SMAD2 e consequentemente bloquear a via do TGF- em células NB4. No entanto, animais leucêmicos apresentaram menor nível sérico de TGF- em relação aos saudáveis e tratados (475,58 vs. 1.378,45/1.146,82 pg/mL; p<0,0001), sugerindo que o blasto leucêmico produz esta citocina e a diminuição de células leucêmicas resultou em diminuição dos níveis séricos de TGF-. A HF não aumentou a sobrevida dos animais leucêmicos e a elevação das enzimas hepáticas sugeriu que o tratamento foi hepatotóxico. Por fim, com relação à angiogênese, a análise da expressão gênica mostrou que o tratamento com HF inibiu a expressão de VEGF e EGF e o estudo por imunohistoquímica de seções da medula óssea evidenciou menor expressão VEGF (30 vs. 80%, p=0,0227), porém não houve diminuição da DMV. O conjunto desses resultados mostrou que a angiogênese é um importante alvo terapêutico na LPA, e que apesar da toxicidade, a HF apresenta potencial antileucêmico, tanto por conta de seus efeitos antiproliferativos e próapoptóticos, quanto por sua capacidade de inibir a produção de fatores próangiogênicos. / Angiogenesis is the term used to describe the growth of new blood vessels from the existing ones. Several studies have demonstrated the microvascular density (MVD) as a prognostic factor in leukemia, particularly acute promyelocytic leukemia (APL). This subtype of leukemia corresponds to 20-25% of acute myeloid leukemia in Latin America and presents clinical, morphological and biological peculiar characteristics. The halofuginone (HF) originally described as an antifungal agent has ability to inhibit tumor growth and vessel formation in animal models of solid tumors. Our group demonstrated that HF inhibits the VEGF secretion and cell proliferation in APL cell lineages. Thus, this study aimed to determine the antiproliferative and antiangiogenic potential of HF in an experimental model of APL in vivo and evaluate the mechanisms underlying its action. First, the cell cycle analysis in NB4 cells treated with HF showed a significant decrease in cell proliferation (2.093 ± 0.304 vs. 41.21 ± 3.25), along with a significant increase in apoptosis (12.53 ± 1.53 vs . 21.95 ± 0.79, p = 0.0007). Through Real Time Array it was possible to identify two groups of apoptosis associated genes differentially expressed in HF treated cells: TNF, TNFRSF9, TNFTSF10B, CD40, FAS, CASP10, CASP8 and CASP3, suggesting that HF induces apoptosis by extrinsic pathway. In vivo analysis of HF was performed in irradiated NOD/SCID mice transplanted with murine PML-RAR leukemic cells. Mice treated with HF for 21 days after transplantation showed no molecular remission as determined by amplification of PML-RARA gene by PCR, however minor leukemic infiltration was observed compared to untreated mice (leukocytes: 4.2 ± 3.89 vs . 20.6 ± 21.9, p <0.0001), hemoglobin: 12.0 ± 1.40 vs. 9.6 ± 1.67, p <0.0001, and Platelets: 932.0 ± 122.5 vs. 552.0 ± 83.2, p <0.001 respectively) and a lower relative weight of spleen (0.006 vs. 0.012, p = 0.0415). Furthermore, the differential count and immunophenotyping of bone marrow showed a lower percentage of immature myeloid cells (16.88 ± 6.27 vs. 44.06 ± 27.06). The HF was also able to inhibit the SMAD2 phosphorylation and consequently block the TGF- pathway in NB4 cells. However, leukemic animals presented lower serum TGF- compared to the healthy and treated (475.58 vs. 1378.45/1146.82 pg / mL, p <0.0001), suggesting that the leukemic blasts produces this cytokines and the decrease in leukemic cells resulted in decreased serum levels of TGF-. The HF did not increase the survival of leukemic animals and elevated liver enzymes suggested that the treatment was hepatotoxic. Finally, regarding angiogenesis, gene expression analysis showed that the HF treatment inhibited the expression of VEGF and EGF and the study by immunohistochemistry of sections of bone marrow showed less VEGF expression (30 vs. 80%, p = 0 0227), but there was no decrease in the MVD. Taken together, these results showed that angiogenesis is an important therapeutic target in APL, and despite the toxicity, HF has antileukemic potential, for both the antiproliferative and proapoptotic effects, and also for its ability to inhibit the production of proangiogenic factors.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:02:20Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3641_1.pdf: 6593022 bytes, checksum: 0f5771c7ba5a598c9b448775b9fef6c4 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2009 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A leucemia promielocítica aguda (LPA) corresponde a cerca de 20-28% das LMAs nos países latino-americanos, sendo caracterizada pelo acúmulo de células leucêmicas na medula óssea semelhantes a promielócitos e clinicamente associada à coagulopatia, que é responsável pela alta mortalidade precoce nas fases iniciais de tratamento. Apesar da LPA ser geralmente reconhecida por seus caracteres morfológicos, existem casos atípicos. A LPA é uma patologia beneficiada pelo tratamento com ATRA e, portanto, um rápido e eficiente diagnóstico é essencial. A citogenética em geral e a RT-PCR são amplamente utilizadas na detecção da fusão gênica PML-RAR&#945;. Estas técnicas fornecem informações adicionais sobre a presenca de outras anormalidades citogenéticas, porém consomem tempo e requerem laboratórios especializados. O padrão da PML provou-se útil ao diagnostico da LPA clássica através de técnicas imunológicas utilizando anticorpos monoclonais ou policlonais. Neste estudo foram analisados 15 pacientes, de ambos os sexos, idade variando de 4 a 17 anos, diagnosticados com LPA no Centro de Oncohematologia Pediátrica do HUOC ou Instituto Nacional do Câncer entre os anos de 2004 a 2008. As amostras de medula óssea dos pacientes foram tratadas de acordo com protocolos padrões sendo realizadas as técnicas de bandeamento G, RT-PCR, FISH usando sonda para o rearranjo PML-RAR&#945; e imunofluorescência com anticorpo monoclonal PG-M3. A análise por bandeamento G revelou alterações cromossômicas, com excessão de dois casos que apresentaram cariótipos normais. O estudo apresentou: um cariótipo complexo 47,XX,del(12p),add(14q),del(15q),i(19q),+mar, onde não foi detectada a fusão PML-RAR&#945; pela RT-PCR, nem pela FISH; um 48,XX,+2mar, no qual também não foi detectada a fusão PMLRAR&#945; pelas técnicas moleculares. Estes dois casos podem conter fusões variantes. Sete casos com t(15;17) foram detectados pela citogenética e confirmados pela FISH; cinco casos com t(15;17) confirmados pela FISH quando não foi possível realizar a análise citogenética. Em três casos a RT-PCR mostrou-se divergente da FISH. A imunofluorescência foi realizada em cinco casos e todos confirmaram o diagnóstico da LPA clássica. Sete pacientes estão vivos, seis em remissão, um em tratamento e oito foram a óbito. Estes dados mostram a importância da união de diversas metodologias para o aperfeiçoamento da eficiência e sensibilidade do diagnóstico e do tratamento desta doença

INTRODUÇÃO: A leucemia promielocítica aguda (LPA) é um subtipo distinto de leucemia mielóide aguda (LMA), caracterizado pela presença de um acúmulo de promielócitos anormais na medula óssea e/ou sangue periférico, riscos de coagulopatias e por alterações cromossômicas estruturais envolvendo sempre o locus gênico para o receptor alfa do ácido retinóico (RAR). Corresponde morfologicamente aos subtipos M3 e M3variante de LMA, segundo a Classificação Franco- Américo- Britânica (FAB) e ao subtipo de LMA associada à translocação recíproca e balanceada entre os cromossomos 15 e 17[t(15;17)] e variantes, segundo a classificação da Organização Mundial de Saúde. O curso clínico da LPA tem sido modificado, nos últimos anos, de uma leucemia aguda rapidamente fatal para um dos mais curáveis subtipos de LMA. A introdução de agentes terapêuticos que atuam diretamente na lesão molecular, como o ATRA e o Trióxido de Arsênico, teve grande impacto na sobrevida da LPA. A eficácia do tratamento é dependente do rearranjo genético presente nas células leucêmicas, o diagnóstico morfológico é sugestivo da alteração genética, devendo ser rapidamente confirmado por técnicas de citogenética molecular. MÉTODOS: Utilizando a citogenética convencional e molecular (FISH) com sondas de fusão para o rearranjo PML-RAR e de ruptura para o gene RAR, analisou-se 62 pacientes portadores de LPA, diagnosticados por estudo morfológico/imunofetípico no HC-FM/USP entre os anos de 1997 a 2006. RESULTADOS: Dos 62 pacientes analisados, 37 (59,7%) apresentaram a t(15;17)(q22;q21) visível no cariótipo; destes, 26 (42,0%) apresentaram a t(15;17) como anormalidade clonal isolada, 10 (16,1%) apresentaram outras alterações cromossômicas clonais em adição a t(15;17) e um paciente (1,6%) apresentou uma variante complexa da t(15;17). Dezoito pacientes (29%) tiveram a confirmação da presença da t(15;17)-rearranjo PML-RAR através da técnica de FISH-fusão e sete (11,3%) não apresentaram ruptura no RAR. Ausência de sangramento ao diagnóstico (p<0,02) e a presença de morfologia M3v (p<0,01) se associaram à ausência ruptura no RAR. A taxa de sobrevida global (SG) em dois anos, entre os 55 pacientes que apresentaram a t(15;17)-rearranjo- PML-RAR ao diagnóstico citogenético, foi de 49,28%. Duas variáveis prognósticas mostraram estar estatisticamente relacionadas à pior taxa de SG nesse estudo: idade acima de 60 anos e presença de morfologia de M3v. A taxa de Sobrevida Livre de Doença em dois anos nesses pacientes foi de 72,10%.CONCLUSÃO: Cerca de 11% dos pacientes diagnosticados para LPA, através de estudo morfológico/imunofenotípico, não apresentaram diagnóstico citogenético compatível para esta doença. Na ausência de sangramento ao diagnóstico e na presença de morfologia M3v o teste de FISH deve ser priorizado. / INTRODUCTION: Acute promyelocytic leukemia (APL) is a distinct subtype of acute myeloid leukemia (AML), characterized by clonal expansion of myeloid precursors blocked at promyelocytic stage, risks of coagulopathy and presence of chromosomal translocations involving RAR (retinoic acid receptor ) gene. Corresponds to the M3 and M3variant subtypes of AML, according to the French-American-British (FAB) classification and the subtype of AML associated with balanced reciprocal translocation between chromosomes 15 and 17 [t (15; 17)] and variants, according to the World Health Organization classification. The clinical APL course has been changed in late years, from highly fatal to highly curable subtype of AML. The introduction of therapeutic agents that act directly on the molecular lesion, such as ATRA and arsenic trioxide, had a great impact on survival of APL. The efficacy of treatment is dependent on genetic rearrangement present in the leukemia cells, the morphologic diagnosis although predictive of the specific genetic lesion genetic, should be quickly confirmed by molecular techniques. METHODS: We analysed cytogenetics findings in 62 patients diagnosed as promyelocytic leukemia by morphological and immunophenotypic studies at the Hematology Service of Clinical Hospital of Sao Paulo Medical School from 1997 to 2006. For this, we used karyotype and FISH with PML-RARA fusion translocation and RARA break-apart probes. RESULTS: Of the 62 patients studied, 59.7% showed the t(15;17)(q22;q21) visible in the karyotype [42.0% had t(15;17) as the sole clonal abnormality, 16.1% showed other additional abnormalities and 1.6% had a complex variant of t(15;17)], 29% had the confirmation of the rearrangement PML-RAR through the FISH-fusion technique and 11.3% showed no break in RAR. No bleeding at diagnosis (p<0.02) and the presence of M3v morphology (p<0.01) were associated to no RAR rearrangement. The 24months overall survival of 55 patients with t(15;17) confirmed by cytogenetics was 49.28%. Two parameters were associated to worse rate of overall survival in this study: age > 60 years and M3v morphology . The 24 months disease-free survival was 72.10%. CONCLUSION: 11,3% of patients diagnosed as promyelocytic leukemia by morphological and immunophenotypic studies, showed no consistent cytogenetic diagnosis for this disease. In the absence of bleeding at diagnosis and in the presence of the M3v morphology, FISH test should be prioritized.

INTRODUÇÃO: A leucemia promielocítica aguda (LPA) é um subtipo distinto de leucemia mielóide aguda (LMA), caracterizado pela presença de um acúmulo de promielócitos anormais na medula óssea e/ou sangue periférico, riscos de coagulopatias e por alterações cromossômicas estruturais envolvendo sempre o locus gênico para o receptor alfa do ácido retinóico (RAR). Corresponde morfologicamente aos subtipos M3 e M3variante de LMA, segundo a Classificação Franco- Américo- Britânica (FAB) e ao subtipo de LMA associada à translocação recíproca e balanceada entre os cromossomos 15 e 17[t(15;17)] e variantes, segundo a classificação da Organização Mundial de Saúde. O curso clínico da LPA tem sido modificado, nos últimos anos, de uma leucemia aguda rapidamente fatal para um dos mais curáveis subtipos de LMA. A introdução de agentes terapêuticos que atuam diretamente na lesão molecular, como o ATRA e o Trióxido de Arsênico, teve grande impacto na sobrevida da LPA. A eficácia do tratamento é dependente do rearranjo genético presente nas células leucêmicas, o diagnóstico morfológico é sugestivo da alteração genética, devendo ser rapidamente confirmado por técnicas de citogenética molecular. MÉTODOS: Utilizando a citogenética convencional e molecular (FISH) com sondas de fusão para o rearranjo PML-RAR e de ruptura para o gene RAR, analisou-se 62 pacientes portadores de LPA, diagnosticados por estudo morfológico/imunofetípico no HC-FM/USP entre os anos de 1997 a 2006. RESULTADOS: Dos 62 pacientes analisados, 37 (59,7%) apresentaram a t(15;17)(q22;q21) visível no cariótipo; destes, 26 (42,0%) apresentaram a t(15;17) como anormalidade clonal isolada, 10 (16,1%) apresentaram outras alterações cromossômicas clonais em adição a t(15;17) e um paciente (1,6%) apresentou uma variante complexa da t(15;17). Dezoito pacientes (29%) tiveram a confirmação da presença da t(15;17)-rearranjo PML-RAR através da técnica de FISH-fusão e sete (11,3%) não apresentaram ruptura no RAR. Ausência de sangramento ao diagnóstico (p<0,02) e a presença de morfologia M3v (p<0,01) se associaram à ausência ruptura no RAR. A taxa de sobrevida global (SG) em dois anos, entre os 55 pacientes que apresentaram a t(15;17)-rearranjo- PML-RAR ao diagnóstico citogenético, foi de 49,28%. Duas variáveis prognósticas mostraram estar estatisticamente relacionadas à pior taxa de SG nesse estudo: idade acima de 60 anos e presença de morfologia de M3v. A taxa de Sobrevida Livre de Doença em dois anos nesses pacientes foi de 72,10%.CONCLUSÃO: Cerca de 11% dos pacientes diagnosticados para LPA, através de estudo morfológico/imunofenotípico, não apresentaram diagnóstico citogenético compatível para esta doença. Na ausência de sangramento ao diagnóstico e na presença de morfologia M3v o teste de FISH deve ser priorizado. / INTRODUCTION: Acute promyelocytic leukemia (APL) is a distinct subtype of acute myeloid leukemia (AML), characterized by clonal expansion of myeloid precursors blocked at promyelocytic stage, risks of coagulopathy and presence of chromosomal translocations involving RAR (retinoic acid receptor ) gene. Corresponds to the M3 and M3variant subtypes of AML, according to the French-American-British (FAB) classification and the subtype of AML associated with balanced reciprocal translocation between chromosomes 15 and 17 [t (15; 17)] and variants, according to the World Health Organization classification. The clinical APL course has been changed in late years, from highly fatal to highly curable subtype of AML. The introduction of therapeutic agents that act directly on the molecular lesion, such as ATRA and arsenic trioxide, had a great impact on survival of APL. The efficacy of treatment is dependent on genetic rearrangement present in the leukemia cells, the morphologic diagnosis although predictive of the specific genetic lesion genetic, should be quickly confirmed by molecular techniques. METHODS: We analysed cytogenetics findings in 62 patients diagnosed as promyelocytic leukemia by morphological and immunophenotypic studies at the Hematology Service of Clinical Hospital of Sao Paulo Medical School from 1997 to 2006. For this, we used karyotype and FISH with PML-RARA fusion translocation and RARA break-apart probes. RESULTS: Of the 62 patients studied, 59.7% showed the t(15;17)(q22;q21) visible in the karyotype [42.0% had t(15;17) as the sole clonal abnormality, 16.1% showed other additional abnormalities and 1.6% had a complex variant of t(15;17)], 29% had the confirmation of the rearrangement PML-RAR through the FISH-fusion technique and 11.3% showed no break in RAR. No bleeding at diagnosis (p<0.02) and the presence of M3v morphology (p<0.01) were associated to no RAR rearrangement. The 24months overall survival of 55 patients with t(15;17) confirmed by cytogenetics was 49.28%. Two parameters were associated to worse rate of overall survival in this study: age > 60 years and M3v morphology . The 24 months disease-free survival was 72.10%. CONCLUSION: 11,3% of patients diagnosed as promyelocytic leukemia by morphological and immunophenotypic studies, showed no consistent cytogenetic diagnosis for this disease. In the absence of bleeding at diagnosis and in the presence of the M3v morphology, FISH test should be prioritized.

Submitted by Amanda Silva (amanda.osilva2@ufpe.br) on 2015-03-13T15:29:17Z No. of bitstreams: 2 TESE Bethânia de Araújo Amaral.pdf: 4449052 bytes, checksum: f014da1c40afd7489d798e17efed3d13 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-03-13T15:29:17Z (GMT). No. of bitstreams: 2 TESE Bethânia de Araújo Amaral.pdf: 4449052 bytes, checksum: f014da1c40afd7489d798e17efed3d13 (MD5) license_rdf: 1232 bytes, checksum: 66e71c371cc565284e70f40736c94386 (MD5) Previous issue date: 2014 / UFPE; CAPES; FACEPE / A leucemia promielocítica aguda (LPA) requer uma atenção especial dentre as leucemias mielóides agudas devido às suas implicações prognósticas e terapêuticas. A taxa de sobrevida de no mínimo cinco anos na LPA chega a 80% dos pacientes com a terapia atual e a taxa de cura excede os 70%. No entanto, a real situação dos resultados do tratamento da LPA em países em desenvolvimento, como o Brasil, é desconhecida. Este trabalho visou contribuir na investigação dos casos de LPA infantil em pacientes na nossa população objetivando a identificação de marcadores que possam redirecionar o acompanhamento e tratamento destes pacientes. A investigação da ocorrência de mutações dos genes FLT3 e NPM1 é importante na determinação prognostica das LMAs, contribuindo para a estratificação de grupos de maior ou menor risco e auxiliando o direcionamento do tratamento. Dezesseis pacientes pediátricos com LPA, representando 29,09% dos casos de LMA infantil, foram atendidos no CEONHPE/HUOC/UPE de 2004 a 2013. A idade variou de 5 a 17 anos (média de 11,81 anos). Análises citogenética e molecular por FISH e RT-PCR foram realizadas para confirmação do diagnóstico genético, na identificação do rearranjo PML-RARα decorrente da t(15;17), além da pesquisa das mutações dos genes FLT3 e NPM1. A análise cariotípica com o bandeamento G revelou alterações cromossômicas em 10 pacientes. Três apresentaram cariótipos complexos com presença de cromossomos marcadores. A técnica de FISH para a t(15;17) confirmou o rearranjo em 14 pacientes. Divergência entre as análises moleculares foram observadas em cinco pacientes, sendo positiva a detecção da t(15;17) pela FISH e negativa pela RT-PCR. A mutação do FLT3/ITD foi detectada em dois pacientes (12,5%), enquanto a mutação FLT3/TKD foi detectada em apenas um paciente (6,25%). A pesquisa para a mutação no gene NPM1 foi negativa para todos os casos. Quanto ao status oito pacientes encontramse vivos ou na fase de manutenção do tratamento e oito foram a óbito, sendo que destes sete tiveram óbitos precoces ainda na fase de indução. Os motivos primários dos óbitos foram hemorragias, septicemia e manifestação da síndrome do ATRA. Este dado é alarmante uma vez que estas mortes são difíceis de prevenir e assinalam o alto risco de ocorrência destes eventos em nossa população. Destacamos a importância do uso de técnicas citogenéticas moleculares na confirmação genética do diagnóstico da LPA e a necessidade de uma melhor adaptação do regime terapêutico aos casos de LPA na infância em nossa população.