L’obtention d’un nombre élevé de cellules souches hématopoïétiques (CSH) représente un enjeu majeur pour le développement de protocoles de thérapies cellulaires d’hémopathies ou de tumeurs solides. L’expansion ex vivo de ces cellules met en jeu différents acteurs (cytokiniques, environnementaux) et notamment les basses concentrations d’oxygène (O2), qui reflètent des conditions physiologiques retrouvées au sein de structures spécifiques de la moelle osseuse où résident les CSH et auxquelles notre équipe s’intéresse depuis plusieurs années. Les effets bénéfiques de ces basses concentrations d’O2 sur le maintien des CSH sont actuellement bien établis lors de courtes cultures de cellules de moelle osseuse, de sang placentaire ou mobilisées dans le sang. Nous avons cherché à confirmer et à étendre ces résultats à des cellules peu étudiées, les cellules souches de sang périphérique en situation d’homéostasie (CSSP-H). Ces cellules représentent en effet une source possible de CSH à usage thérapeutique, du fait de leur disponibilité et de leur facilité d’accès. Nos travaux ont permis d’établir et d’optimiser un protocole, rapide et simple, de purification de cellules CD34+ à partir de filtres de leucoréduction (LRF). La quantité et la pureté de ces cellules adaptées à la poursuite de nos travaux, ainsi que leur validation fonctionnelle, nous ont permis de les utiliser comme modèle pour l’étude des effets de cultures de 7 jours très faiblement oxygénées (0,1% d’O2). La détermination de combinaisons cytokiniques assurant le maintien et l’expansion des cellules primitives a révélé un rôle bénéfique de l’IL-3 et du SCF couplé à la TPO. Ces conditions de culture ont permis de révéler, comparativement à des cultures réalisées à 20% d’O2, le rôle majeur des faibles concentrations d’O2 dans le maintien de cellules quiescentes, indifférenciées, ne se divisant pas ou très peu et capables de reconstituer une hématopoïèse, suite à leur injection dans des souris NOG. Les mécanismes moléculaires et métaboliques intervenant dans ces processus restent, cependant, encore à établir. / Obtaining a high number of hematopoietic stem cells (HSCs) is a major challenge for developing cell therapies for blood diseases. Ex vivo expansion of HSCs involves various factors (cytokines, environment), including low oxygen (O2) concentrations, that reflect the physiological conditions found in specific structures of the bone marrow where HSCs reside. Our team is interested with the study of these low O2 levels for several years and their beneficial effects are currently well established during short-term cultures of cells from bone marrow, cord blood or mobilized in the blood. We sought to confirm and extend these results to poorly studied cells: stem cells from steady state peripheral blood (SSPB). Indeed, these cells represent a possible HSCs source devoted to the therapeutic use, because of their availability and their easy access. Our work has led to the establishment and the optimisation of a procedure, rapid and easy to set up, for CD34+ cells purification from leukoreduction filters (LRFs). The cell quantities and purities, adapted to our further work, together with their functional validation, led us to use these cells as a model for 7-days in vitro cultures performed at very low O2 concentration (0.1%). Cytokine combination assays, allowing the maintenance and the expansion of primitive cells, have revealed a beneficial influence of IL-3 or SCF + TPO additions. These cultures have revealed, comparatively to those performed at 20% O2, a major role of the very low O2 concentrations in the maintenance of quiescent and undifferentiated cells, showing an un- or low-cycling status and able to reconstitute hematopoiesis, consecutively to their injection into NOG mice. However, the molecular and metabolic mechanisms involved in these processes remain unknown.

A medicina transfusional utiliza o sangue como ferramenta terapêutica suporte para diversas doenças, e vários estudos justificam o uso de hemocomponentes em detrimento de sangue total. A estocagem e a manipulação do sangue podem acarretar alterações funcionais de seus subprodutos, e a transfusão de hemácias estocadas por longos períodos pode ocasionar danos ao receptor. Portanto, embora a manutenção do estoque de componentes eritrocitários seja necessária, o armazenamento sanguíneo pode reduzir a função das hemácias transfundidas e causar reações transfusionais indesejadas, fato que estimula o desenvolvimento de novas soluções e aditivos extras, culminando com hemocomponentes mais seguros e com maior tempo de validade. Este estudo teve o objetivo de avaliar as alterações na composição bioquímica e hemogasométrica que pudessem ser imputadas na ocorrência de lesões de armazenamento no concentrado de hemácias (CH) canino em decorrência do tipo de solução preservativa utilizada (citrato, fosfato, dextrose e adenina [CPDA-1] ou com o citrato, fosfato, dextrose com solução extra de adenina, glicose e manitol [CPD/SAG-M]). Um segundo objetivo foi avaliar se a redução de leucócitos do CH impactaria de forma decisiva a estocagem do CH. Para tanto foram comparados valores referentes à pressão de oxigênio (PO2), pressão de dióxido de carbono (PCO2), saturação de oxigênio (SO2), pH, taxa de hemólise, glicose, sódio e potássio extracelulares. As bolsas foram analisadas a cada sete dias, iniciando 12 horas após a colheita até completar 42 dias (seis semanas de estocagem). Foram estudadas 23 bolsas divididas em quatro grupos, sendo o Grupo 1 de CH colhido em CPDA-1 (6 bolsas), Grupo 2 em CPDA-1 leucorreduzido (6 bolsas), Grupo 3 em CPD/SAG-M (6 bolsas) e Grupo 4 em CPD/SAG-M leucorreduzido (5 bolsas). Dentre os resultados, não foram observadas alterações significativas na taxa de hemólise que pudessem indicar qual anticoagulante foi mais eficaz, tão pouco se a leucorredução possuiu efeito preservante dos eritrócitos. Também não houve diferenças significativas na concentração de glicose e pH entre os grupos durante as semanas de estudo. Foram observadas diferenças na concentração de potássio extracelular, com menor concentração nas bolsas leucorreduzidas. A variação da PCO2 não apresentou um comportamento padrão de aumento ou redução com diferenças significativas claras. Contudo, foram observadas mudanças marcantes no comportamento da concentração de oxigênio ao se comparar a presença ou ausência dos leucócitos, independente do anticoagulante utilizado, com aumento marcante nos valores de PO2 nos grupos leucorreduzidos a partir da segunda semana (P<0,05). A SO2 apresentou diferença significativa entre os grupos que sofreram ou não leucorredução desde a semana zero (P<0,05), com valores maiores nos grupos leucorreduzidos, independente do anticoagulante utilizado nas semanas 1 até 5. Conclui-se analisando os dados que a solução preservativa CPD/SAG-M não ofereceu melhor meio para estocagem de CH canino quando comparado ao CPDA-1 no que tange a hemólise, mas que a redução de leucócitos (leucorredução) indicou efeito protetivo indireto da estrutura eritrocitária de CH canino em estocagem, independente do anticoagulante utilizado, observado pela menor concentração de potássio a partir de 35 dias de estocagem (quinta semana). Concluiu-se, também, que a leucorredução exerceu um impacto na concentração de oxigênio mensurado pela PO2 e SO2, indicando melhor função in vitro da hemoglobina, independente do anticoagulante utilizado / The transfusional medicine use blood as a therapeutic support tool for various diseases, and many studies justify the use of blood products at the expense of whole blood. The storage and handling of blood can result in functional changes of these products, and the transfusion of long time storage erythrocytes may be harmful to the receiver. Therefore, while the maintaining the stock of red cell components is required, blood storage can reduce the function of transfused red blood cells and cause unwanted transfusion reactions, a fact that stimulates research in the field of development of new solutions and extra additives, culminating in safer blood products and with longer validity. This study aimed to evaluate variations in the biochemical and hemogasometric composition that could be changed in the event of storage lesions in canine packed red blood cells (PRBC) due to the type of used preservative solution (citrate, phosphate, dextrose and adenine [CPDA -1] or citrate, phosphate, dextrose solution with extra adenine, glucose and mannitol [CPD/SAG-M]). A second objective was to assess whether the reduction of CH leukocytes could impact decisively in the storage of PRBC. Therefore, we compared the values for oxygen pressure (PO2), carbon dioxide pressure (PCO2) and oxygen saturation SO2), pH hemolysis rate, glucose, extracellular sodium and potassium. The blood bags were analyzed every 7 days starting 12 hours after harvest and during 42 days (six weeks of storage). It were studied 23 bags divided into four study groups: Group 1 PRBC harvest in CPDA-1 (6 bags), Group 2 leukoreduced CPDA-1 (6 bags), Group 3 CPD/SAG-M (6 bags) and group 4 in CPD/SAG-M leukoreduced (5 bags). Among the results, there were no significant changes in hemolysis rate were observed which could indicate which anticoagulant was more effective, as little to leukoreduction owned preservative effect of erythrocytes. There were also no significant differences in glucose concentration and pH between the groups during the week study. Differences were observed in extracellular potassium concentration, with lower concentrations in leucorreduced bags. The variation of PCO2 was wandering without formation of an increase or decrease in behavior clear differences. However, significant changes in the behavior of oxygen concentration when comparing the presence or absence of leukocytes were observed independent of the anticoagulant was used, with marked increase in PO2 values in leukorreuced groups from the second week (P <0.05). The SO2 showed a significant difference between the groups that have suffered or not leukoreduction from week zero (P <0.05), with higher values in leukoreduced groups, independent of the anticoagulant used in weeks 1 to 5. We conclude by analyzing the data that preservative solution CPD / SAG-M offered no better way to canine CH storage when compared to the CPDA-1 with respect to hemolysis, but that leukocyte reduction (leukoreduction) indicated indirect protective effect of erythrocyte structure of CH canine in storage, independent of the anticoagulant used, observed by the lower concentration of potassium from 35 days of storage (fifth week). It was concluded also that leukoreduction exerted an impact on oxygen concentration measured by PO2 and SO2, indicating better function of hemoglobin in vitro, independent of the anticoagulant used

A medicina transfusional utiliza o sangue como ferramenta terapêutica suporte para diversas doenças, e vários estudos justificam o uso de hemocomponentes em detrimento de sangue total. A estocagem e a manipulação do sangue podem acarretar alterações funcionais de seus subprodutos, e a transfusão de hemácias estocadas por longos períodos pode ocasionar danos ao receptor. Portanto, embora a manutenção do estoque de componentes eritrocitários seja necessária, o armazenamento sanguíneo pode reduzir a função das hemácias transfundidas e causar reações transfusionais indesejadas, fato que estimula o desenvolvimento de novas soluções e aditivos extras, culminando com hemocomponentes mais seguros e com maior tempo de validade. Este estudo teve o objetivo de avaliar as alterações na composição bioquímica e hemogasométrica que pudessem ser imputadas na ocorrência de lesões de armazenamento no concentrado de hemácias (CH) canino em decorrência do tipo de solução preservativa utilizada (citrato, fosfato, dextrose e adenina [CPDA-1] ou com o citrato, fosfato, dextrose com solução extra de adenina, glicose e manitol [CPD/SAG-M]). Um segundo objetivo foi avaliar se a redução de leucócitos do CH impactaria de forma decisiva a estocagem do CH. Para tanto foram comparados valores referentes à pressão de oxigênio (PO2), pressão de dióxido de carbono (PCO2), saturação de oxigênio (SO2), pH, taxa de hemólise, glicose, sódio e potássio extracelulares. As bolsas foram analisadas a cada sete dias, iniciando 12 horas após a colheita até completar 42 dias (seis semanas de estocagem). Foram estudadas 23 bolsas divididas em quatro grupos, sendo o Grupo 1 de CH colhido em CPDA-1 (6 bolsas), Grupo 2 em CPDA-1 leucorreduzido (6 bolsas), Grupo 3 em CPD/SAG-M (6 bolsas) e Grupo 4 em CPD/SAG-M leucorreduzido (5 bolsas). Dentre os resultados, não foram observadas alterações significativas na taxa de hemólise que pudessem indicar qual anticoagulante foi mais eficaz, tão pouco se a leucorredução possuiu efeito preservante dos eritrócitos. Também não houve diferenças significativas na concentração de glicose e pH entre os grupos durante as semanas de estudo. Foram observadas diferenças na concentração de potássio extracelular, com menor concentração nas bolsas leucorreduzidas. A variação da PCO2 não apresentou um comportamento padrão de aumento ou redução com diferenças significativas claras. Contudo, foram observadas mudanças marcantes no comportamento da concentração de oxigênio ao se comparar a presença ou ausência dos leucócitos, independente do anticoagulante utilizado, com aumento marcante nos valores de PO2 nos grupos leucorreduzidos a partir da segunda semana (P<0,05). A SO2 apresentou diferença significativa entre os grupos que sofreram ou não leucorredução desde a semana zero (P<0,05), com valores maiores nos grupos leucorreduzidos, independente do anticoagulante utilizado nas semanas 1 até 5. Conclui-se analisando os dados que a solução preservativa CPD/SAG-M não ofereceu melhor meio para estocagem de CH canino quando comparado ao CPDA-1 no que tange a hemólise, mas que a redução de leucócitos (leucorredução) indicou efeito protetivo indireto da estrutura eritrocitária de CH canino em estocagem, independente do anticoagulante utilizado, observado pela menor concentração de potássio a partir de 35 dias de estocagem (quinta semana). Concluiu-se, também, que a leucorredução exerceu um impacto na concentração de oxigênio mensurado pela PO2 e SO2, indicando melhor função in vitro da hemoglobina, independente do anticoagulante utilizado / The transfusional medicine use blood as a therapeutic support tool for various diseases, and many studies justify the use of blood products at the expense of whole blood. The storage and handling of blood can result in functional changes of these products, and the transfusion of long time storage erythrocytes may be harmful to the receiver. Therefore, while the maintaining the stock of red cell components is required, blood storage can reduce the function of transfused red blood cells and cause unwanted transfusion reactions, a fact that stimulates research in the field of development of new solutions and extra additives, culminating in safer blood products and with longer validity. This study aimed to evaluate variations in the biochemical and hemogasometric composition that could be changed in the event of storage lesions in canine packed red blood cells (PRBC) due to the type of used preservative solution (citrate, phosphate, dextrose and adenine [CPDA -1] or citrate, phosphate, dextrose solution with extra adenine, glucose and mannitol [CPD/SAG-M]). A second objective was to assess whether the reduction of CH leukocytes could impact decisively in the storage of PRBC. Therefore, we compared the values for oxygen pressure (PO2), carbon dioxide pressure (PCO2) and oxygen saturation SO2), pH hemolysis rate, glucose, extracellular sodium and potassium. The blood bags were analyzed every 7 days starting 12 hours after harvest and during 42 days (six weeks of storage). It were studied 23 bags divided into four study groups: Group 1 PRBC harvest in CPDA-1 (6 bags), Group 2 leukoreduced CPDA-1 (6 bags), Group 3 CPD/SAG-M (6 bags) and group 4 in CPD/SAG-M leukoreduced (5 bags). Among the results, there were no significant changes in hemolysis rate were observed which could indicate which anticoagulant was more effective, as little to leukoreduction owned preservative effect of erythrocytes. There were also no significant differences in glucose concentration and pH between the groups during the week study. Differences were observed in extracellular potassium concentration, with lower concentrations in leucorreduced bags. The variation of PCO2 was wandering without formation of an increase or decrease in behavior clear differences. However, significant changes in the behavior of oxygen concentration when comparing the presence or absence of leukocytes were observed independent of the anticoagulant was used, with marked increase in PO2 values in leukorreuced groups from the second week (P <0.05). The SO2 showed a significant difference between the groups that have suffered or not leukoreduction from week zero (P <0.05), with higher values in leukoreduced groups, independent of the anticoagulant used in weeks 1 to 5. We conclude by analyzing the data that preservative solution CPD / SAG-M offered no better way to canine CH storage when compared to the CPDA-1 with respect to hemolysis, but that leukocyte reduction (leukoreduction) indicated indirect protective effect of erythrocyte structure of CH canine in storage, independent of the anticoagulant used, observed by the lower concentration of potassium from 35 days of storage (fifth week). It was concluded also that leukoreduction exerted an impact on oxygen concentration measured by PO2 and SO2, indicating better function of hemoglobin in vitro, independent of the anticoagulant used

A doação de plaquetas por aférese é um procedimento automatizado que permite a obtenção deste hemocomponente em grande quantidade e com ato grau de pureza; deste processo obtém-se um subproduto chamado Câmara de Leucorredução (CLR) que é descartado ao final da doação. São permitidas até 24 doações/ano; porém as possíveis consequências de doações frequentes para esses doadores são pouco investigadas. Assim, foram identificados e quantificados os leucócitos de doadores de plaquetas frequentes e de 1ª vez. Também foi avaliada a viabilidade do uso das células mononucleares da CLR para pesquisas. Observou-se mais células na CLR que no sangue e que a frequência das populações é similar. O estado de ativação e a capacidade funcional (proliferação e produção de citocinas) foram similares entre CLR e sangue, assim como a taxa de apoptose espontânea. Entre doadores frequentes e de primeira vez não houve diferença no número de leucócitos, sugerindo que doações recorrentes não alteraram as populações leucocitárias. / Plateletpheresis is an automatized procedure to obtain high purity platelet for transfusions. From this procedure its possible to obtain a byproduct: The Leukoreduction system chamber (LRSC), which is discarded at the end of donation process. This type of donation allows 24 donation/year, but the consequences of frequent donations are poorly investigated. Therefore, we identified and quantified leukocytes of frequent and first time platelet donor. Also, was evaluated the viability, for research, of mononuclear cells recovery from LRSC. The total number of mononuclear cells was higher in LRSC than in peripheral blood samples, but the frequencies were similar in all the samples. Activation state and functional capacity (measured by cell proliferation and cytokine production) were similar in both, blood and LRSC mononuclear cells, as well as spontaneous apoptosis. Among frequent (6 or more donations in 1 year) and first time donor, there was no difference in the leukocyte total number, suggesting that frequent donation do not modify these cells.

A doação de plaquetas por aférese é um procedimento automatizado que permite a obtenção deste hemocomponente em grande quantidade e com ato grau de pureza; deste processo obtém-se um subproduto chamado Câmara de Leucorredução (CLR) que é descartado ao final da doação. São permitidas até 24 doações/ano; porém as possíveis consequências de doações frequentes para esses doadores são pouco investigadas. Assim, foram identificados e quantificados os leucócitos de doadores de plaquetas frequentes e de 1ª vez. Também foi avaliada a viabilidade do uso das células mononucleares da CLR para pesquisas. Observou-se mais células na CLR que no sangue e que a frequência das populações é similar. O estado de ativação e a capacidade funcional (proliferação e produção de citocinas) foram similares entre CLR e sangue, assim como a taxa de apoptose espontânea. Entre doadores frequentes e de primeira vez não houve diferença no número de leucócitos, sugerindo que doações recorrentes não alteraram as populações leucocitárias. / Plateletpheresis is an automatized procedure to obtain high purity platelet for transfusions. From this procedure its possible to obtain a byproduct: The Leukoreduction system chamber (LRSC), which is discarded at the end of donation process. This type of donation allows 24 donation/year, but the consequences of frequent donations are poorly investigated. Therefore, we identified and quantified leukocytes of frequent and first time platelet donor. Also, was evaluated the viability, for research, of mononuclear cells recovery from LRSC. The total number of mononuclear cells was higher in LRSC than in peripheral blood samples, but the frequencies were similar in all the samples. Activation state and functional capacity (measured by cell proliferation and cytokine production) were similar in both, blood and LRSC mononuclear cells, as well as spontaneous apoptosis. Among frequent (6 or more donations in 1 year) and first time donor, there was no difference in the leukocyte total number, suggesting that frequent donation do not modify these cells.