Made available in DSpace on 2014-06-11T19:30:57Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006-03-08Bitstream added on 2014-06-13T21:01:42Z : No. of bitstreams: 1 zanelli_cf_dr_araiq.pdf: 5712697 bytes, checksum: 1977a3ae4700587d216d3af5de0d62a1 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O fator de início de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) é uma proteína altamente conservada desde arquebactérias a mamíferos e sofre uma modificação póstraducional única, necessária para sua maturação funcional, chamada de hipusinação. Apesar do grau de conservação de eIF5A, e da essencialidade de sua função nos organismos estudados, seu papel no metabolismo celular ainda se encontra indeterminado. Vários mutantes condicionais de eIF5A, sensíveis ao aumento de temperatura, têm sido isolados e caracterizados na levedura Saccharomyces cerevisiae. Utilizando um desses mutantes de eIF5A, o alelo tif51A-1, foi isolado o gene PKC1 como um supressor em alto número de cópias do fenótipo de sensibilidade a temperatura deste mutante. O entendimento de como se dá esta interação genética foi um dos enfoques deste trabalho. Foi mostrado que a via de MAP quinases que atua abaixo de Pkc1 não é responsável pela supressão deste mutante e a identificação dos novos supressores do mutante tif51A-1, GIC1 e ZDS1, levou à sugestão de uma nova via de sinalização a partir de Pkc1. Com a realização de experimentos subsequentes, foi confirmado que a nova via Pkc1-Zds1-Gic1 é responsável pela supressão do mutante tif51A-1 promovida por PKC1. Além disso, estes três supressores são importantes para a polaridade celular em S. cerevisiae, um processo essencial para a progressão no ciclo celular deste organismo, e, interessantemente, os mutantes tif51A-1 e tif51A-3 de eIF5A evidenciaram defeitos na polarização do citoesqueleto de actina na temperatura não permissiva. Esses dados evidenciam uma correlação de eIF5A com progressão no ciclo celular de S. cerevisiae. / The eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A) is a highly conserved protein from archaebacteria to mammals and undergoes hypusination, an essential unique post-translational modification. Despite the high degree of conservation of eIF5A and its essential function in the studied organisms, its cellular role remains unclear. Several temperature-sensitive eIF5A mutants have been isolated and characterized in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Using one of these mutants, the tif51A-1 allele, PKC1 was identified as a high-copy suppressor of the temperature-sensitive phenotype shown by this mutant. The understanding of this genetic interaction was one of the aims of this work. It was shown that the MAP kinase cascade downstream Pkc1 is not responsible for this phenotypic suppression and the identification of the new tif51A-1 suppressors, GIC1 and ZDS1, suggested a new signaling pathway branching from Pkc1. Further analysis confirmed that Pkc1-Zds1-Gic1 constitute a new pathway that is responsible for tif51A-1 mutant suppression promoted by PKC1. Moreover, these three suppressors are important for cell polarity in S. cerevisiae, an essential process for cell cycle progression in yeast, and, interestingly, the eIF5A mutants tif51A-1 and tif51A-3 showed defects in actin cytoskeleton polarization at the restrictive temperature. These data supported a connection between eIF5A and cell cycle progression in S. cerevisiae. As eIF5A was originally implicated in the process of translation, in order to better investigate the specific function of this factor, polysomal profiling analysis was performed and it was demonstrated that eIF5A interacts with monosomes in a tranlation dependent manner and, besides that, eIF5A mutants show altered polysomal distribution suggesting a possible defect in the elongation step of translation.

Orientador: Sandro Roberto Valentini / Banca: Maria Célia Bertolini / Banca: Gustavo Henrique Goldman / Banca: Carla Columbano de Oliveira / Banca: Nilson Ivo Tonin Zanchin / Resumo: O fator de início de tradução de eucariotos 5A (eIF5A) é uma proteína altamente conservada desde arquebactérias a mamíferos e sofre uma modificação póstraducional única, necessária para sua maturação funcional, chamada de hipusinação. Apesar do grau de conservação de eIF5A, e da essencialidade de sua função nos organismos estudados, seu papel no metabolismo celular ainda se encontra indeterminado. Vários mutantes condicionais de eIF5A, sensíveis ao aumento de temperatura, têm sido isolados e caracterizados na levedura Saccharomyces cerevisiae. Utilizando um desses mutantes de eIF5A, o alelo tif51A-1, foi isolado o gene PKC1 como um supressor em alto número de cópias do fenótipo de sensibilidade a temperatura deste mutante. O entendimento de como se dá esta interação genética foi um dos enfoques deste trabalho. Foi mostrado que a via de MAP quinases que atua abaixo de Pkc1 não é responsável pela supressão deste mutante e a identificação dos novos supressores do mutante tif51A-1, GIC1 e ZDS1, levou à sugestão de uma nova via de sinalização a partir de Pkc1. Com a realização de experimentos subsequentes, foi confirmado que a nova via Pkc1-Zds1-Gic1 é responsável pela supressão do mutante tif51A-1 promovida por PKC1. Além disso, estes três supressores são importantes para a polaridade celular em S. cerevisiae, um processo essencial para a progressão no ciclo celular deste organismo, e, interessantemente, os mutantes tif51A-1 e tif51A-3 de eIF5A evidenciaram defeitos na polarização do citoesqueleto de actina na temperatura não permissiva. Esses dados evidenciam uma correlação de eIF5A com progressão no ciclo celular de S. cerevisiae. / Abstract: The eukaryotic translation initiation factor 5A (eIF5A) is a highly conserved protein from archaebacteria to mammals and undergoes hypusination, an essential unique post-translational modification. Despite the high degree of conservation of eIF5A and its essential function in the studied organisms, its cellular role remains unclear. Several temperature-sensitive eIF5A mutants have been isolated and characterized in the yeast Saccharomyces cerevisiae. Using one of these mutants, the tif51A-1 allele, PKC1 was identified as a high-copy suppressor of the temperature-sensitive phenotype shown by this mutant. The understanding of this genetic interaction was one of the aims of this work. It was shown that the MAP kinase cascade downstream Pkc1 is not responsible for this phenotypic suppression and the identification of the new tif51A-1 suppressors, GIC1 and ZDS1, suggested a new signaling pathway branching from Pkc1. Further analysis confirmed that Pkc1-Zds1-Gic1 constitute a new pathway that is responsible for tif51A-1 mutant suppression promoted by PKC1. Moreover, these three suppressors are important for cell polarity in S. cerevisiae, an essential process for cell cycle progression in yeast, and, interestingly, the eIF5A mutants tif51A-1 and tif51A-3 showed defects in actin cytoskeleton polarization at the restrictive temperature. These data supported a connection between eIF5A and cell cycle progression in S. cerevisiae. As eIF5A was originally implicated in the process of translation, in order to better investigate the specific function of this factor, polysomal profiling analysis was performed and it was demonstrated that eIF5A interacts with monosomes in a tranlation dependent manner and, besides that, eIF5A mutants show altered polysomal distribution suggesting a possible defect in the elongation step of translation. / Doutor

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2016-09-02T16:33:25Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 818272 bytes, checksum: b93f482c5170531d886647a1db1ab445 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-02T16:33:25Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 818272 bytes, checksum: b93f482c5170531d886647a1db1ab445 (MD5) Previous issue date: 2015-10-15 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A produção de etanol combustível pode ser aumentada pelo estabelecimento de novas tecnologias que utilizam subprodutos agroindustriais como matéria-prima. O soro de queijo é um subproduto que pode ser utilizado como substrato para a produção de etanol. A levedura Kluyveromyces marxianus CCT 7735 é capaz de produzir etanol da lactose do soro de queijo, contudo concentrações de etanol superiores a 6% (v/v) afetam o crescimento dessa levedura. Apesar de esse ser o principal entrave para a utilização de Kluyveromyces marxianus em processos de produção de etanol, existem poucas informações sobre os efeitos e respostas adaptativas ao etanol nessa levedura. Recentemente, o transcriptoma dessa levedura cultivada sob estresse por etanol foi obtido, todavia os dados ainda não foram confirmados. Neste trabalho, o transcriptoma foi validado por meio da análise da expressão dos genes que codificam as enzimas transcetolase, hexoquinase, succinato desidrogenase e isocitrato lisase, respectivamente, por PCR em tempo real (qPCR). No intuito de compreender as respostas adaptativas de Kluyveromyces marxianus ao etanol, foi analisado o perfil metabólico desta levedura sob estresse por esse biocombustível. Os metabólitos intracelulares foram analisados por um sistema de cromatografia a gás (GC) acoplado a um espectrômetro de massa (MS). Posteriormente, os metabólitos identificados foram correlacionados com os dados do transcriptoma, também obtido sob estresse por etanol. A análise dos componentes principais indicou que o etanol provocou alterações no perfil metabólico da levedura. O aumento da abundância relativa dos metabólitos ácido nicotínico, alanina, valina, prolina, inositol, gentibiose, melibiose e lactulose parece estar associado às respostas adaptativas ao etanol em Kluyveromyces marxianus CCT 7735. Além disso, a análise do perfil metabólico, juntamente com as informações do transcriptoma, evidenciou que a via glicolítica é inibida pelo etanol e a via das pentoses fosfato e o ciclo do glioxilato são importantes no período de 4 h sob estresse por etanol. / The production of ethanol may be enhanced by setting up new technologies that use agroindustrial by-products as raw material. Cheese whey is a by-product that can be used as a substrate for the production of ethanol. The yeast Kluyveromyces marxianus CCT 7735 is able of producing ethanol from the lactose present in the cheese whey, concentrations higher than 6% (v/v) affect the growth of such yeast, however. Although being the main obstacle for using Kluyveromyces marxianus in ethanol production processes, there is little information on the effects and the adaptive responses to the ethanol on such yeast. Recently, the transcriptome of that yeast, cultivated under stress in the ethanol, has been obtained. Nevertheless, the data have not been confirmed yet. In this work, the transcriptome was validated by analysis of gene expression that encodes the enzym estransketolase, hexokinase, succinato desidrogenase and isocitratolisase, respectively by PCR in real time (qPCR). In order to understand the adaptive responses of Kluyveromyces marxianus to the ethanol, the metabolic profile of this yeast under ethanol stress was analysed. The intracellular metabolites were analysed by a gas chromatography system (GC) coupled with a mass spectrometer (MS). After that, the identified metabolites were correlated to data of transcriptome, which was also obtained under ethanol stress. The analysis of the principal components revealed that ethanol promoted changes in the metabolic profile of this yeast. The increase in the relative abundance of nicotinic acid, alanine, valine, proline, inositol, gentibiose, melibiose and lactulose may be associated with adaptive responses to ethanol in Kluyveromyces marxianus CCT 7735. In addition, the analysis of the metabolic profile together with information of transcriptome revealed that the glycolytic pathway is inhibited by the ethanol, and the phosphate pentose pathway and the glyoxylate pathway are important in the 4-hour period under ethanol stress.