O processo de micrencapsulação de proteínas em microesferas (MS) de PLGA [poli (ácido lactico-co-glicolico)] é fácil de fazer e é uma ferramenta útil para melhorar tanto uma formulação quanto para aumentar a atividade imunológica de vacinas de novas gerações. A MS-PLGA têm caráter adjuvante porque é um sistema particulado e, além disto, controla a liberação do antígeno. O escopo desta tese foi o de dar uma nova roupagem para um antígeno vacinal tradicional e muito bem estudado- o toxoide diftérico (Dtxd). Estudaram-se a produção de MS de tamanho desejado; os mecanismos que controlam danos nas proteínas durante o processo de micrencapsulação; a produção de microesferas com características de liberações em tempos distintos e ensaios biológicos. O tamanho de MS é um determinante fundamental para controlar a velocidade de liberação de um soluto. Para se produzir MS com tamanhos controlados usou-se um desenho fatorial experimental com três fatores distintos e três pontos centrais, para se determinar a influência das variáveis (concentração de poli álcool vinílico; velocidade de agitação e relação fase dispersa/fase contínua) na determinação do tamanho das MS. Foram obtidas MS esféricas e lisas de 4- 15 µm de diâmetro. Estes resultados abrem a possibilidade de se formular PLGA-MS com tamanhos planejados através de um mínimo de experimentos. O mecanismo de danos conformacionais nas proteínas nas várias fases do processo de produção de PLGA-MS é ainda uma questão em aberto. Usaram-se várias técnicas biofísicas (HPLC, espectroscopias no uv, fluorescência e CD) além de ELISA para se testar a interferência dos sais da série de Hofmeister sobre a solubilidade e estabilidade da proteína durante a emulsificação e do contacto com a interface água/cloreto de metileno (primeira etapa do processo de preparação de MS). Estudaram-se também a influência de oligômeros de PLGA e SDS sobre a estrutura da proteína no meio de liberação (etapa de liberação do soluto). A emulsificação de Dtxd na presença de Mg2+ induziu agregação protéica, com exposição de resíduos hidrofóbicos para o meio; variações no ângulo diédrico do S-S proteico e perda de identidade imunológica. Esta agregação foi quase abolida pelo caotrópico SCN- (toxicidade = 30 g/ homem adulto de 70 kg). A conformação \"nativa\" do Dtxd e sua atividade biológica foram protegidas pelo KSCN. Os oligômeros de PLGA e o SDS induziram uma conformação de Dtxd nova. A adição de KSCN na fase aquosa aumentou a eficiência de encapsulação de Dtxd pela PLGA-MS em 20 %. Esta foi a solução mais simples quando comparada com aquelas descritas na literatura. Produziram-se seis formulações diferentes (diferentes massas molares e carboximetilações do PLGA) com pelo menos três cinéticas de liberações distintas. Imunizaram-se camundongos com 5 µg de Dtxd encapsulado em MS-PLGA usando-se dois polímeros de 12 kDa (-COOH livre ou metilado) e um outro de 63 kDa (metilado). O padrão de resposta e a maturidade imunológicas foram medidos por titulações de IgG1 e IgG2a. Mantiveram-se os mesmos padrões de resposta humoral (desejável). Menores quantidades de antígenos foram necessárias para se obter os mesmos benefícios gerados pela vacina tradicional de Dtxd. Aumentaram-se a produção e a seletividade de anticorpos através de duas manipulações simples: a formulação e o tempo da aplicação da dose de reforço. Estes resultados colocam estas formulações na área de vacinas de sucesso uma vez que também foram obtidas memórias imunológicas. / The protein microencapsulation within microspheres (MS) of PLGA (Poly-lactide-co-glycolide) is easy to do and, it is a useful tool to enhance formulation and immunologic performances for new generation vaccines. MS-PLGA has adjuvant character because it is a particulate system and can control the antigen release. The question addressed in this thesis was to give this new dress for the traditional and well studied vaccine antigen - the diphtheria toxoid (Dtxd). The steps of MS control size production; mechanism to control protein damages; MS production with different polymers and biological assay were addressed here. MS size is a primary determinant of solute release velocity. A full factorial experimental design 23 with triplicate at the central point was used to determine the influence of variables (polyvinyl alcohol concentration, stirring velocity and the relationship between dispersed /continuous phase) on MS size. Uniformly spherical and smooth microspheres (4 - 15 µm of diameter) were obtained. These results open the possibility of formulating PLGA microspheres with custom sizes performing a minimum of experiments as required for specific applications. It stills an open question to detail the conformational mechanism of protein damages during the various steps of the PLGA microencapsulation process. Various techniques (HPLC gel filtration, ELISA, Fluorescence, UV and Circular dichroism spectroscopies) were tested on the interference of the Hofmeister ion series over protein solubility and stability during the emulsification and contact with the interface water/CH2Cl2 interface (First step on MS preparation). The interference of SDS and PLGA olygomers over protein structure in the liberation media was also studied (solute liberation step). The Dtxd emulsification in the presence of Mg2+ was followed by protein aggregation, with exposition of hydrophobic residues and changes on the dihedral S-S protein angle and loses on immunological identity. This aggregation is 95% avoided by the chaotropic and little toxic salt KSCN (30g/ adult human of 70 kg). All the \"native\" Dtxd conformation and biological properties were maintained by KSCN. MS with different liberation kinetics profile and different erosion characteristics were obtained by using six different polymers. The SDS and PLGA olygomers exerted a generation of new Dtxd molecular organization. The KSCN increased Dtxd encapsulation within PLGA-MS in more than 20 %. This was the simplest solution used to solve protein aggregation compared with others solutions used in the literature. The six different formulations produced (differing in molar mass and carboxymethylation) produced, at least, three different Dtxd liberation profiles. Mice were primed with 5 µg of Dtxd microencapsulated within MS prepared with 12 kDa (ended carboxymethylated or free PLGA) and with 63 kDa (methylated) PLGA. The response patterns and the immune maturity were measured by IgG1 and IgG2a titrations. The humoral pattern was maintained, but fewer antigens were needed to obtain the same traditional Dtxd vaccine benefits. The simple change on Dtxd-PLGA formulation and timing of the booster enhanced both, antibody production and selectivity. An immunological memory was also obtained, putting so, these formulations in the field of successful vaccine.

Submitted by Johnny Rodrigues (johnnyrodrigues@ufcg.edu.br) on 2018-04-04T20:09:37Z No. of bitstreams: 1 GLÓRIA TAMIRIS FARIAS DA SILVA FURTADO - DISSERTAÇÃO PPG-CEMat 2014..pdf: 2828132 bytes, checksum: 5e63edac512ab6bfb0b360a80afb5927 (MD5) / Made available in DSpace on 2018-04-04T20:09:37Z (GMT). No. of bitstreams: 1 GLÓRIA TAMIRIS FARIAS DA SILVA FURTADO - DISSERTAÇÃO PPG-CEMat 2014..pdf: 2828132 bytes, checksum: 5e63edac512ab6bfb0b360a80afb5927 (MD5) Previous issue date: 2014-08-28 / O câncer vem crescendo nas estatísticas da saúde pública, e o melanona é um dos tipos mais letais. Tem-se pesquisado substâncias que sejam menos tóxicas e que possam ser liberadas de forma controlada através de sistemas farmacêuticos. Para desenvolver os sistemas farmacêuticos utilizam-se materiais polímeros, os quais serão responsáveis pelo o controle de liberação da droga in situ desejado. A quitosana tem sido estudada por apresentar propriedades como atividade antimicrobiana, analgésico, pode ser modificada químicamente, fácil acesso e de baixo custo. O objetivo deste trabalho foi desenvolver e avaliar membranas de quitosana para o uso em sistemas de liberação controlada da curcumina para o tratamento de melanoma. As amostras foram preparadas pelo método de evaporação de solvente, utilizando uma solução de ácido acético (1% v/v), para obter uma solução de quitosana a 2% (m/v). As membranas de quitosana/curcumina foram obtidas a partir da dissolução da curcumina em etanol (1,2 mg/ml), vertendo-a na solução de quitosana, As membranas de quitosana com e sem curcumina, foram caracterizadas por FTIR, DRX, MEV, TG, DSC, GI, biodegradação enzimática, citotoxicidade (MCF-7), e como também realizado o desenvolvimento e validação do método analítico, e determinação do teor de curcumina na membrana desenvolvida. A partir das caracterizações ficou evidenciado que o método de processamento usado na obtenção da membrana quitosana/curcumina é adequado, tendo em vista que não houve degradação da curcumina. As membranas de quitosana/curcumina apresentaram menor intumescimento e degradação, e maior estabilidade quando comparadas às membranas de quitosana. Para o ensaio de citotoxicidade as membranas de quitosana/curcumina apresentaram potencial para o tratamento de câncer. O método analítico desenvolvido está conforme a RE Nº 899/2003 da ANVISA. Logo, o método utilizado foi adequado para identificação e quantificação da curcumina na membrana de quitosana/curcumina. Diante dos resultados obtidos, o sistema desenvolvido apresenta potencial para aplicações em liberação controlada de drogas. / The cancer is growing in public health statistics, and the melanoma is one of the most lethal types. Research has focused on substances that are less toxic and can be released in a controlled way through the developoment of pharmaceutical systems. To develop pharmaceutical systems are used polymer materials, which will be responsible for the drug release control in situ. Chitosan has been studied for having properties such as antimicrobial, analgesic, may be chemically modified, easy and inexpensive. The aim of this study was to develop and evaluate chitosan membranes for curcumin controlled release systems for treating melanoma. Samples were prepared by solvent casting, using a solution of acetic acid (1% v/v) to obtain a chitosan solution at 2% (w/v). The membranes of chitosan/curcumin was obtained from the dissolution of curcumin in ethanol (1.2 mg / ml) pouring the solution of chitosan, chitosan membranes with and without curcumin were characterized by FTIR, XRD, SEM, TG, DSC, SD, enzymatic degradation, cytotoxicity (MCF-7), and also performed as the development and validation of the analytical method, and determination of curcumin in membrane developed. From the characterizations became evident that the processing method used in obtaining the chitosan membrane/curcumin is appropriate, considering there was no degradation of curcumin. The membranes of chitosan/curcumin showed lower swelling ratio and degradation, and increased stability as compared to the chitosan membranes. For the cytotoxicity assay the membranes of chitosan/curcumin showed potential for the treatment of cancer. The developed analytical method is accordint to the ANVISA resolution No. RE 899/2003. Therefore, the method was suitable for identification and quantification of curcumin in chitosan/curcumin membranes. Based on these results, the system developed has potential for applications in controlled release of drugs.

O processo de micrencapsulação de proteínas em microesferas (MS) de PLGA [poli (ácido lactico-co-glicolico)] é fácil de fazer e é uma ferramenta útil para melhorar tanto uma formulação quanto para aumentar a atividade imunológica de vacinas de novas gerações. A MS-PLGA têm caráter adjuvante porque é um sistema particulado e, além disto, controla a liberação do antígeno. O escopo desta tese foi o de dar uma nova roupagem para um antígeno vacinal tradicional e muito bem estudado- o toxoide diftérico (Dtxd). Estudaram-se a produção de MS de tamanho desejado; os mecanismos que controlam danos nas proteínas durante o processo de micrencapsulação; a produção de microesferas com características de liberações em tempos distintos e ensaios biológicos. O tamanho de MS é um determinante fundamental para controlar a velocidade de liberação de um soluto. Para se produzir MS com tamanhos controlados usou-se um desenho fatorial experimental com três fatores distintos e três pontos centrais, para se determinar a influência das variáveis (concentração de poli álcool vinílico; velocidade de agitação e relação fase dispersa/fase contínua) na determinação do tamanho das MS. Foram obtidas MS esféricas e lisas de 4- 15 µm de diâmetro. Estes resultados abrem a possibilidade de se formular PLGA-MS com tamanhos planejados através de um mínimo de experimentos. O mecanismo de danos conformacionais nas proteínas nas várias fases do processo de produção de PLGA-MS é ainda uma questão em aberto. Usaram-se várias técnicas biofísicas (HPLC, espectroscopias no uv, fluorescência e CD) além de ELISA para se testar a interferência dos sais da série de Hofmeister sobre a solubilidade e estabilidade da proteína durante a emulsificação e do contacto com a interface água/cloreto de metileno (primeira etapa do processo de preparação de MS). Estudaram-se também a influência de oligômeros de PLGA e SDS sobre a estrutura da proteína no meio de liberação (etapa de liberação do soluto). A emulsificação de Dtxd na presença de Mg2+ induziu agregação protéica, com exposição de resíduos hidrofóbicos para o meio; variações no ângulo diédrico do S-S proteico e perda de identidade imunológica. Esta agregação foi quase abolida pelo caotrópico SCN- (toxicidade = 30 g/ homem adulto de 70 kg). A conformação \"nativa\" do Dtxd e sua atividade biológica foram protegidas pelo KSCN. Os oligômeros de PLGA e o SDS induziram uma conformação de Dtxd nova. A adição de KSCN na fase aquosa aumentou a eficiência de encapsulação de Dtxd pela PLGA-MS em 20 %. Esta foi a solução mais simples quando comparada com aquelas descritas na literatura. Produziram-se seis formulações diferentes (diferentes massas molares e carboximetilações do PLGA) com pelo menos três cinéticas de liberações distintas. Imunizaram-se camundongos com 5 µg de Dtxd encapsulado em MS-PLGA usando-se dois polímeros de 12 kDa (-COOH livre ou metilado) e um outro de 63 kDa (metilado). O padrão de resposta e a maturidade imunológicas foram medidos por titulações de IgG1 e IgG2a. Mantiveram-se os mesmos padrões de resposta humoral (desejável). Menores quantidades de antígenos foram necessárias para se obter os mesmos benefícios gerados pela vacina tradicional de Dtxd. Aumentaram-se a produção e a seletividade de anticorpos através de duas manipulações simples: a formulação e o tempo da aplicação da dose de reforço. Estes resultados colocam estas formulações na área de vacinas de sucesso uma vez que também foram obtidas memórias imunológicas. / The protein microencapsulation within microspheres (MS) of PLGA (Poly-lactide-co-glycolide) is easy to do and, it is a useful tool to enhance formulation and immunologic performances for new generation vaccines. MS-PLGA has adjuvant character because it is a particulate system and can control the antigen release. The question addressed in this thesis was to give this new dress for the traditional and well studied vaccine antigen - the diphtheria toxoid (Dtxd). The steps of MS control size production; mechanism to control protein damages; MS production with different polymers and biological assay were addressed here. MS size is a primary determinant of solute release velocity. A full factorial experimental design 23 with triplicate at the central point was used to determine the influence of variables (polyvinyl alcohol concentration, stirring velocity and the relationship between dispersed /continuous phase) on MS size. Uniformly spherical and smooth microspheres (4 - 15 µm of diameter) were obtained. These results open the possibility of formulating PLGA microspheres with custom sizes performing a minimum of experiments as required for specific applications. It stills an open question to detail the conformational mechanism of protein damages during the various steps of the PLGA microencapsulation process. Various techniques (HPLC gel filtration, ELISA, Fluorescence, UV and Circular dichroism spectroscopies) were tested on the interference of the Hofmeister ion series over protein solubility and stability during the emulsification and contact with the interface water/CH2Cl2 interface (First step on MS preparation). The interference of SDS and PLGA olygomers over protein structure in the liberation media was also studied (solute liberation step). The Dtxd emulsification in the presence of Mg2+ was followed by protein aggregation, with exposition of hydrophobic residues and changes on the dihedral S-S protein angle and loses on immunological identity. This aggregation is 95% avoided by the chaotropic and little toxic salt KSCN (30g/ adult human of 70 kg). All the \"native\" Dtxd conformation and biological properties were maintained by KSCN. MS with different liberation kinetics profile and different erosion characteristics were obtained by using six different polymers. The SDS and PLGA olygomers exerted a generation of new Dtxd molecular organization. The KSCN increased Dtxd encapsulation within PLGA-MS in more than 20 %. This was the simplest solution used to solve protein aggregation compared with others solutions used in the literature. The six different formulations produced (differing in molar mass and carboxymethylation) produced, at least, three different Dtxd liberation profiles. Mice were primed with 5 µg of Dtxd microencapsulated within MS prepared with 12 kDa (ended carboxymethylated or free PLGA) and with 63 kDa (methylated) PLGA. The response patterns and the immune maturity were measured by IgG1 and IgG2a titrations. The humoral pattern was maintained, but fewer antigens were needed to obtain the same traditional Dtxd vaccine benefits. The simple change on Dtxd-PLGA formulation and timing of the booster enhanced both, antibody production and selectivity. An immunological memory was also obtained, putting so, these formulations in the field of successful vaccine.