Culturas de células primárias diferem de acordo com as condições ambientais nas quais se encontra o doador. Recentemente demonstramos que o ciclo claro/escuro impõe um programa molecular hereditário em cultura celular. Com o intuito de investigar os mecanismos moleculares da memória celular, no presente trabalho isolamos células progenitoras CD133+ de explante de músculo cremaster e investigamos se a expressão de microRNAs (miRNAs), resulta em fenótipos diferentes de acordo com o ciclo claro/escuro. O sequenciamento global de miRNAs utilizando a plataforma SOLiD 4 e analisado pelos programas EdgeR, TargetScan e Metacore resultou na identificação de 541 miRNAs maduros, os quais apresentam dois perfis de expressão distintos de acordo com a hora de obtenção das culturas. miR-1249 e miR-129-2-3p são mais expressos em células obtidas durante o dia e favorecem a manutenção da pluri/multipotência celular. Já células obtidas à noite expressam maior conteúdo dos miR-182, miR-96-5p, miR-223-3p, miR-146a-3p e miR-146a-5p resultando na inibição da resposta inflamatória e no favorecimento da maturação celular quando comparadas às células obtidas de dia. A análise funcional da inibição da resposta inflamatória em células obtidas à noite foi confirmada por PCR array que revelou na menor expressão de genes relacionados à via de sinalização TLR/NF-κB, incluindo Traf6, um alvo do miR-146a. Além disso, a translocação nuclear de NF-κB é reduzida à noite e é inversamente proporcional ao nível de melatonina plasmática. Demonstramos ainda que a melatonina in vitro favorece o estado de pluripotência celular por aumentar a expressão de CD133, miR-1249 e miR-129-2-3p. No entanto, esse efeito depende do contexto celular visto que a expressão de receptores de melatonina também varia de acordo com a hora de obtenção da cultura. Em conjunto, nossos dados sugerem que o ciclo claro/escuro interfere no perfil de expressão de miRNAs e impõe uma variação no fenótipo de células progenitoras CD133+ / The phenotype of primary cells in culture varies according to the donor environmental condition. We have recently shown that the light/dark cycle impose a molecular program that is hereditable in culture. In order to evaluate the molecular mechanisms of cellular memory, here we isolated CD133+ progenitor cells from cremaster muscle explants and investigated whether the expression of microRNAs (miRNAs), could result in different phenotypes according the phase of ligh/dark cycle when cells were obtained. The global miRNA sequencing using SOLiD4 Platform, and analyzed by EdgeR, TargetScan and MetaCore, revealed the expression of a total of 541 mature miRNAs, and two distinct miRNAs signatures according to the hour when cells were obtained. miR-1249 and miR-129-2-3p are more expressed during daytime and favor the maintenance of cellular pluri/multipotency. Nighttime cells express higher amounts of miR-182, miR96-5p, miR-223-3p, miR-146a-3p and miR-146a-5p that inhibit the inflammatory response and favor the cellular maturation when compared to daytime cells. The functional analysis of the inflammatory response inhibition during nighttime was confirmed by PCR array and revealed lower expression level of genes related to TLR/NF-κB pathway, including Traf6, a putative target mRNA of miR-146a. Additionally, the nuclear translocation of NF-κB is reduced in nighttime cells and it is inversely correlated to the nocturnal the plasma level of melatonin. We also showed that melatonin in vitro favors the cellular pluri/multipotency, increasing CD133, miR-1249 and miR-129-2-3p expression. However, this effect depends on cellular context, as the expression of melatonin receptors also shows a daily variation. Altogether, our data suggest that the light/dark cycle interferes on miRNAs expression profile and imposes a rhythmic phenotype variation in CD133+ cells

Culturas de células primárias diferem de acordo com as condições ambientais nas quais se encontra o doador. Recentemente demonstramos que o ciclo claro/escuro impõe um programa molecular hereditário em cultura celular. Com o intuito de investigar os mecanismos moleculares da memória celular, no presente trabalho isolamos células progenitoras CD133+ de explante de músculo cremaster e investigamos se a expressão de microRNAs (miRNAs), resulta em fenótipos diferentes de acordo com o ciclo claro/escuro. O sequenciamento global de miRNAs utilizando a plataforma SOLiD 4 e analisado pelos programas EdgeR, TargetScan e Metacore resultou na identificação de 541 miRNAs maduros, os quais apresentam dois perfis de expressão distintos de acordo com a hora de obtenção das culturas. miR-1249 e miR-129-2-3p são mais expressos em células obtidas durante o dia e favorecem a manutenção da pluri/multipotência celular. Já células obtidas à noite expressam maior conteúdo dos miR-182, miR-96-5p, miR-223-3p, miR-146a-3p e miR-146a-5p resultando na inibição da resposta inflamatória e no favorecimento da maturação celular quando comparadas às células obtidas de dia. A análise funcional da inibição da resposta inflamatória em células obtidas à noite foi confirmada por PCR array que revelou na menor expressão de genes relacionados à via de sinalização TLR/NF-κB, incluindo Traf6, um alvo do miR-146a. Além disso, a translocação nuclear de NF-κB é reduzida à noite e é inversamente proporcional ao nível de melatonina plasmática. Demonstramos ainda que a melatonina in vitro favorece o estado de pluripotência celular por aumentar a expressão de CD133, miR-1249 e miR-129-2-3p. No entanto, esse efeito depende do contexto celular visto que a expressão de receptores de melatonina também varia de acordo com a hora de obtenção da cultura. Em conjunto, nossos dados sugerem que o ciclo claro/escuro interfere no perfil de expressão de miRNAs e impõe uma variação no fenótipo de células progenitoras CD133+ / The phenotype of primary cells in culture varies according to the donor environmental condition. We have recently shown that the light/dark cycle impose a molecular program that is hereditable in culture. In order to evaluate the molecular mechanisms of cellular memory, here we isolated CD133+ progenitor cells from cremaster muscle explants and investigated whether the expression of microRNAs (miRNAs), could result in different phenotypes according the phase of ligh/dark cycle when cells were obtained. The global miRNA sequencing using SOLiD4 Platform, and analyzed by EdgeR, TargetScan and MetaCore, revealed the expression of a total of 541 mature miRNAs, and two distinct miRNAs signatures according to the hour when cells were obtained. miR-1249 and miR-129-2-3p are more expressed during daytime and favor the maintenance of cellular pluri/multipotency. Nighttime cells express higher amounts of miR-182, miR96-5p, miR-223-3p, miR-146a-3p and miR-146a-5p that inhibit the inflammatory response and favor the cellular maturation when compared to daytime cells. The functional analysis of the inflammatory response inhibition during nighttime was confirmed by PCR array and revealed lower expression level of genes related to TLR/NF-κB pathway, including Traf6, a putative target mRNA of miR-146a. Additionally, the nuclear translocation of NF-κB is reduced in nighttime cells and it is inversely correlated to the nocturnal the plasma level of melatonin. We also showed that melatonin in vitro favors the cellular pluri/multipotency, increasing CD133, miR-1249 and miR-129-2-3p expression. However, this effect depends on cellular context, as the expression of melatonin receptors also shows a daily variation. Altogether, our data suggest that the light/dark cycle interferes on miRNAs expression profile and imposes a rhythmic phenotype variation in CD133+ cells

As variáveis biológicas de muitos seres vivos apresentam ritmos diários, em paralelo ao dia e à noite do ambiente. A maioria desses ritmos não é uma mera reação aos estímulos cíclicos do ambiente: eles são ritmos circadianos gerados endogenamente por um temporizador interno - o oscilador circadiano - que sustenta uma ritmicidade com período diferente de 24 horas na ausência de pistas ambientais, mas se sincroniza para um período de 24 horas quando exposto ao ambiente cíclico. Em mamíferos, o oscilador circadiano se localiza no cérebro e pode ser sincronizado pelo ciclo diário de claridade e escuridão (ciclo CE) do dia e da noite transmitido através das retinas. Animais subterrâneos passam boa parte do tempo abaixo da terra, onde as condições ambientais variam menos que na superfície. Em razão disso, questiona-se até que ponto estes animais mantêm ritmos circadianos e se seus osciladores circadianos se baseiam no ciclo CE para se sincronizar com o ambiente. Procuramos responder essas questões nos roedores subterrâneos da espécie Ctenomys cf. knighti (tuco-tucos). Em campo, realizamos observações visuais diretas para registrar o padrão temporal de exposição à luz. Em laboratório, construímos a Curva de Resposta de Fase (CRF), que consiste em medir indiretamente a resposta do oscilador circadiano a estímulos luminosos em diferentes momentos do dia. Por fim, recorremos a simulações computacionais de um modelo matemático de oscilador, para integrar os dados anteriores. Verificamos, em campo, que os tuco-tucos se expõem, diariamente, a pulsos de luz irregularmente distribuídos nas horas claras do dia levantando alguns questionamentos sobre sua capacidade como sincronizador dos ritmos em campo. Contudo, a CRF nos indicou que o sistema circadiano dos tuco-tucos responde a estímulos luminosos de forma semelhante aos animais não-subterrâneos. Nós verificamos 3 hipóteses: ou a informação da exposição à luz em campo é suficiente para sincronizar o oscilador circadiano, apesar da aparente irregularidade; ou a CRF do tuco-tuco possui alguma característica que facilita a sincronização pelo regime observado de exposição à luz; ou seu sistema circadiano se baseia em outra pista temporal do ambiente para se manter sincronizado. Nossas simulações computacionais indicaram que a primeira hipótese é a mais provável, visto que os padrões de exposição à luz simulados, como aqueles observados em campo, com o mínimo de informação temporal, ainda assim são suficientes para sincronizar os osciladores. Em conjunto, nossos dados indicam que o ciclo claro-escuro tem um papel importante na sincronização dos ritmos circadianos dos tuco-tucos na natureza. / Daily rhythms are found in the biological variables of many organisms, in parallel to the environmental day and night. Most of those rhythms are not mere reactions to the cyclic stimulus of the environment. They are actually circadian rhythms, endogenously generated by an internal timer, the circadian oscillator, which sustains a non-24-hour rhythm under constant conditions, but is synchronized to a 24-hour period when exposed do a cyclic environment. In mammals, this oscillator is located in the brain, and can be synchronized by the daily light-dark cycle (LD cycle) of day and night. Subterranean animals remain most of the time in an underground habitat, where environmental conditions vary less markedly than aboveground. Therefore, there are doubts whether these animals maintain circadian rhythms and whether their circadian oscillators rely on the LD cycle for environmental synchronization. We attempted to answer those questions in subterranean rodents of the species Ctenomys cf. knighti (tuco-tucos). In the field, we performed direct visual observations to assess their temporal pattern of light-exposure. In the lab, we build the Phase Response Curve (PRC), which consists in an indirect measurement of the circadian oscillator responses to light stimuli applied at different times of the day. Finally, computer simulations of an oscillator model were used to integrate these previous data. We verified that tuco-tucos expose themselves to light pulses that are irregularly distributed through day-light hours, raising some questions about its validity as an environmental synchronizer. However, the PRC results indicated that the tuco-tucos circadian system responds to light stimuli in a way similar to non-subterranean animals. We then verified three hypothesis: either the light-exposure temporal information was enough for the synchronization of the circadian system, despite its apparent irregularity; or the tuco-tuco\'s PRC present some feature that facilitates the synchronization by the observed light-exposure regimen; or the tuco-tuco\'s circadian system rely on another environmental temporal cue to maintain its synchronization. Our computer simulations support the first hypothesis, given that the simulated regimens, despite being little informative in the temporal sense, were still sufficient to synchronize the simulated oscillators. Together, our data indicate that the light-dark cycle plays an important role in the synchronization of the tuco-tucos\' circadian rhythms in nature.

As variáveis biológicas de muitos seres vivos apresentam ritmos diários, em paralelo ao dia e à noite do ambiente. A maioria desses ritmos não é uma mera reação aos estímulos cíclicos do ambiente: eles são ritmos circadianos gerados endogenamente por um temporizador interno - o oscilador circadiano - que sustenta uma ritmicidade com período diferente de 24 horas na ausência de pistas ambientais, mas se sincroniza para um período de 24 horas quando exposto ao ambiente cíclico. Em mamíferos, o oscilador circadiano se localiza no cérebro e pode ser sincronizado pelo ciclo diário de claridade e escuridão (ciclo CE) do dia e da noite transmitido através das retinas. Animais subterrâneos passam boa parte do tempo abaixo da terra, onde as condições ambientais variam menos que na superfície. Em razão disso, questiona-se até que ponto estes animais mantêm ritmos circadianos e se seus osciladores circadianos se baseiam no ciclo CE para se sincronizar com o ambiente. Procuramos responder essas questões nos roedores subterrâneos da espécie Ctenomys cf. knighti (tuco-tucos). Em campo, realizamos observações visuais diretas para registrar o padrão temporal de exposição à luz. Em laboratório, construímos a Curva de Resposta de Fase (CRF), que consiste em medir indiretamente a resposta do oscilador circadiano a estímulos luminosos em diferentes momentos do dia. Por fim, recorremos a simulações computacionais de um modelo matemático de oscilador, para integrar os dados anteriores. Verificamos, em campo, que os tuco-tucos se expõem, diariamente, a pulsos de luz irregularmente distribuídos nas horas claras do dia levantando alguns questionamentos sobre sua capacidade como sincronizador dos ritmos em campo. Contudo, a CRF nos indicou que o sistema circadiano dos tuco-tucos responde a estímulos luminosos de forma semelhante aos animais não-subterrâneos. Nós verificamos 3 hipóteses: ou a informação da exposição à luz em campo é suficiente para sincronizar o oscilador circadiano, apesar da aparente irregularidade; ou a CRF do tuco-tuco possui alguma característica que facilita a sincronização pelo regime observado de exposição à luz; ou seu sistema circadiano se baseia em outra pista temporal do ambiente para se manter sincronizado. Nossas simulações computacionais indicaram que a primeira hipótese é a mais provável, visto que os padrões de exposição à luz simulados, como aqueles observados em campo, com o mínimo de informação temporal, ainda assim são suficientes para sincronizar os osciladores. Em conjunto, nossos dados indicam que o ciclo claro-escuro tem um papel importante na sincronização dos ritmos circadianos dos tuco-tucos na natureza. / Daily rhythms are found in the biological variables of many organisms, in parallel to the environmental day and night. Most of those rhythms are not mere reactions to the cyclic stimulus of the environment. They are actually circadian rhythms, endogenously generated by an internal timer, the circadian oscillator, which sustains a non-24-hour rhythm under constant conditions, but is synchronized to a 24-hour period when exposed do a cyclic environment. In mammals, this oscillator is located in the brain, and can be synchronized by the daily light-dark cycle (LD cycle) of day and night. Subterranean animals remain most of the time in an underground habitat, where environmental conditions vary less markedly than aboveground. Therefore, there are doubts whether these animals maintain circadian rhythms and whether their circadian oscillators rely on the LD cycle for environmental synchronization. We attempted to answer those questions in subterranean rodents of the species Ctenomys cf. knighti (tuco-tucos). In the field, we performed direct visual observations to assess their temporal pattern of light-exposure. In the lab, we build the Phase Response Curve (PRC), which consists in an indirect measurement of the circadian oscillator responses to light stimuli applied at different times of the day. Finally, computer simulations of an oscillator model were used to integrate these previous data. We verified that tuco-tucos expose themselves to light pulses that are irregularly distributed through day-light hours, raising some questions about its validity as an environmental synchronizer. However, the PRC results indicated that the tuco-tucos circadian system responds to light stimuli in a way similar to non-subterranean animals. We then verified three hypothesis: either the light-exposure temporal information was enough for the synchronization of the circadian system, despite its apparent irregularity; or the tuco-tuco\'s PRC present some feature that facilitates the synchronization by the observed light-exposure regimen; or the tuco-tuco\'s circadian system rely on another environmental temporal cue to maintain its synchronization. Our computer simulations support the first hypothesis, given that the simulated regimens, despite being little informative in the temporal sense, were still sufficient to synchronize the simulated oscillators. Together, our data indicate that the light-dark cycle plays an important role in the synchronization of the tuco-tucos\' circadian rhythms in nature.

Os peixes são organismos plásticos em relação às alterações de ciclos ambientais como o ciclo claro/escuro e ciclo de disponibildade alimentar, zeitgebers comprovadamente fortes para outros organismos vertebrados. O objetivo geral deste estudo foi verificar se o ciclo claro /escuro (CE) e o ciclo de disponibilidade alimentar (AJ) promovem sincronização da atividade locomotora em exemplares de robalos juvenis das espécies Centropomus parallelus e C. undecimalis coletados na região do Sistema Cananéia-Iguape (SP). Foi verificada uma possível relação hierárquica entre estes ciclos ambientais, e também foram observadas diferenças inter e intraindividuais de sincronização. Depois de coletados os peixes permaneceram em aquários do Laboratório de Ritmos Biológicos do GMDRB (Grupo Multidisciplinar de Desenvolvimento e Ritmos Biológicos) com temperatura da água entre 25 e 30oC, salinidade entre 20 a 30‰ e ciclos claro/escuro de 11:13h e 13:11h. A alimentação foi administrada manualmente, a intensidade luminosa da fase clara foi de 90lux e da fase escura foi de 10lux. A atividade locomotora dos peixes foi registrada individualmente através das interrupções nos feixes de luz infra-vermelha. Os feixes foram gerados por emissores de luz e detectados por fotocélulas; os pares emissor-fotocélula foram distribuídos na superfície e fundo dos aquários. A interrupção foi convertida em pulso elétrico por uma interface digital. Os dados foram processados através do programa “El Temps"(Diez-Noguera, 1999); foram confeccionados actogramas, periodogramas de Lomb-Scargle e plexogramas. Foram calculadas as porcentagens de alocação da atividade locomotora em cada fase (claro, escuro, jejum e alimentação) baseadas no número total de horas da fase correspondente. As porcentagens foram então comparadas em todas as condições experimentais, para todos os indivíduos. As comparações foram feitas através do teste Z com correção de Yates, com o auxílio do programa estatístico “SigmaStat" versão 3.11. Diante dos resultados obtidos pôde-se concluir que somente o ciclo claro /escuro foi capaz de sincronizar alguns dos exemplares testados neste estudo. O mascaramento promovido por este ciclo ambiental possivelmente é responsável pela plasticidade temporal e reflete a complexidade do ambiente costeiro repleto de ciclos ambientais. / Fish are generally adaptable to changes in environmental cycles such as the light/dark cycle (LD) and food availability cycle (EF). These cycles are the most common and considered strong zeitgebers for vertebrates. The aim of this study was to investigate whether LD and EF cycles were able to synchronize the locomotor activity of juvenile snooks (Centropomus undecimalis and C. parallelus) collected at Cananéia estuary (São Paulo – Brazil). Juvenile fish were kept in a laboratory lightproof room (Laboratório de Ritmos Biológicos do GMDRB-Grupo Multidisciplinar de Desenvolvimento e Ritmos Biológicos), water temperature between 25 and 30oC, salinity between 20 and 30‰. Feeding was performed manually. A bulb of a blue light was located at the top of aquaria (90lx in the light phase and 10lx in the dark phase). Locomotor activity was detected by six (eight, depending on aquaria) pairs of infrared sensors distributed on the surface and at the bottom of aquaria. Data collected from the infrared sensors were analyzed through the program “El Temps". Actograms, Lomb-Scargle periodograms, and plexograms were drawn. Locomotor activity percentages were calculated for the different phases of the cycles and compared in all experimental manipulations for all indivuduals. The comparisions were calculated using the software “SigmaStat" version 3.11 through the test Z with Yates correction. We concluded that the LD cycle syncronized (probably masking) the locomotor activity in some juvenile fish studied whereas the EF cycle did not. We discuss the temporal plasticity observed in the context of the complexity of coastal environmental.

Os peixes são organismos plásticos em relação às alterações de ciclos ambientais como o ciclo claro/escuro e ciclo de disponibildade alimentar, zeitgebers comprovadamente fortes para outros organismos vertebrados. O objetivo geral deste estudo foi verificar se o ciclo claro /escuro (CE) e o ciclo de disponibilidade alimentar (AJ) promovem sincronização da atividade locomotora em exemplares de robalos juvenis das espécies Centropomus parallelus e C. undecimalis coletados na região do Sistema Cananéia-Iguape (SP). Foi verificada uma possível relação hierárquica entre estes ciclos ambientais, e também foram observadas diferenças inter e intraindividuais de sincronização. Depois de coletados os peixes permaneceram em aquários do Laboratório de Ritmos Biológicos do GMDRB (Grupo Multidisciplinar de Desenvolvimento e Ritmos Biológicos) com temperatura da água entre 25 e 30oC, salinidade entre 20 a 30‰ e ciclos claro/escuro de 11:13h e 13:11h. A alimentação foi administrada manualmente, a intensidade luminosa da fase clara foi de 90lux e da fase escura foi de 10lux. A atividade locomotora dos peixes foi registrada individualmente através das interrupções nos feixes de luz infra-vermelha. Os feixes foram gerados por emissores de luz e detectados por fotocélulas; os pares emissor-fotocélula foram distribuídos na superfície e fundo dos aquários. A interrupção foi convertida em pulso elétrico por uma interface digital. Os dados foram processados através do programa “El Temps”(Diez-Noguera, 1999); foram confeccionados actogramas, periodogramas de Lomb-Scargle e plexogramas. Foram calculadas as porcentagens de alocação da atividade locomotora em cada fase (claro, escuro, jejum e alimentação) baseadas no número total de horas da fase correspondente. As porcentagens foram então comparadas em todas as condições experimentais, para todos os indivíduos. As comparações foram feitas através do teste Z com correção de Yates, com o auxílio do programa estatístico “SigmaStat” versão 3.11. Diante dos resultados obtidos pôde-se concluir que somente o ciclo claro /escuro foi capaz de sincronizar alguns dos exemplares testados neste estudo. O mascaramento promovido por este ciclo ambiental possivelmente é responsável pela plasticidade temporal e reflete a complexidade do ambiente costeiro repleto de ciclos ambientais. / Fish are generally adaptable to changes in environmental cycles such as the light/dark cycle (LD) and food availability cycle (EF). These cycles are the most common and considered strong zeitgebers for vertebrates. The aim of this study was to investigate whether LD and EF cycles were able to synchronize the locomotor activity of juvenile snooks (Centropomus undecimalis and C. parallelus) collected at Cananéia estuary (São Paulo – Brazil). Juvenile fish were kept in a laboratory lightproof room (Laboratório de Ritmos Biológicos do GMDRB-Grupo Multidisciplinar de Desenvolvimento e Ritmos Biológicos), water temperature between 25 and 30oC, salinity between 20 and 30‰. Feeding was performed manually. A bulb of a blue light was located at the top of aquaria (90lx in the light phase and 10lx in the dark phase). Locomotor activity was detected by six (eight, depending on aquaria) pairs of infrared sensors distributed on the surface and at the bottom of aquaria. Data collected from the infrared sensors were analyzed through the program “El Temps”. Actograms, Lomb-Scargle periodograms, and plexograms were drawn. Locomotor activity percentages were calculated for the different phases of the cycles and compared in all experimental manipulations for all indivuduals. The comparisions were calculated using the software “SigmaStat” version 3.11 through the test Z with Yates correction. We concluded that the LD cycle syncronized (probably masking) the locomotor activity in some juvenile fish studied whereas the EF cycle did not. We discuss the temporal plasticity observed in the context of the complexity of coastal environmental.