Hannover, Universiẗat, Diss., 2004.

No description available.

The progress in biotechnological disciplines such as metabolic engineering or synthetic biology increased the interest of chemical and pharmaceutical industries to implement microbial processes for chemical synthesis. However, most microorganisms, e.g., Escherichia coli or Saccharomyces cerevisiae, used in biotechnological applications are not evolved by nature for the production of industrially relevant compounds, which are often hydrophobic, non-charged, volatile, or toxic to the microbial organisms. Bioprocess design relies on an integrated approach addressing pathway, cellular, reaction, and process engineering to combine the results of natural evolution with the demands of industrial applicability. In this thesis, the microbial de novo production and selective oxyfunctionalization of the highly volatile isoprenoid limonene has been investigated as a model system featuring reactants with challenging physicochemical characteristics. Key constraints that limit limonene biosynthesis and its oxyfunctionalization in recombinant E. coli, related to genetics, physiology, and reaction engineering, were identified and relieved.

Ziel des Forschungsvorhabens war die Untersuchung von Möglichkeiten zur Intensivierung des mikrobiellen Abbaus des Geruchsstoffes Limonen unter Anwendung des Biofilter-verfahrens. Limonen stellt eine wesentliche Geruchskomponente bei der Intensivrotte der Bioabfallkompostierung dar und wird bisher in biologischen Abluftreinigungsanlagen oft nur unzureichend eliminiert. Dies führt zu einer Geruchsbelästigung des Personals und an-grenzender Wohngebiete. Die Verbesserung des hygienischen Status der Bioabfallkom-postierung und eine damit verbundene Steigerung ihrer gesellschaftlichen Akzeptanz erfordert daher ein Biofilterverfahren, das hinsichtlich des Limonenabbaus optimiert wird. Die Zuverlässigkeit von Biofiltern ist neben der Einstellung und Optimierung technischer Parameter auch von der biologischen Aktivität der im Strukturmaterial vorhandenen Mikro-organismenbiozönose abhängig. Viele zum mikrobiellen Abbau von Limonen befähigte Mikroorganismen sind zwar bekannt, doch handelt es sich bei den beschriebenen Abbau-mechanismen hauptsächlich um eine unvollständige Mineralisierung dieses Geruchsstoffes, die zu einer Anreicherung wiederum geruchsbelasteter Verbindungen führt. In dieser Arbeit wurden aus Umweltproben (Fichtenzapfen, -nadeln, -rinde; Waldboden; Schalen von Zitrusfrüchten; Bioabfall) vier bakterielle Mischpopulationen, die zur Ver-wertung von Limonen als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle in der Lage sind und durch Wachstum auf diesem Substrat Biomasse bilden, in Schüttelkultur durch Metabolisierung von Limonen erfolgreich angereichert. Hinsichtlich ihrer Abbaukinetik für Limonen wiesen alle Batch-Kulturen eine starke Ähnlichkeit auf. Limonen wurde bei Anfangskonzentrationen von 536,5-889,5 mg/l nach 41-59 Stunden und mittleren Abbauraten von 48,1-51,0 mgl-1h-1 durch die Batch-Kulturen bis unter die Nachweisgrenze abgebaut. Nach erfolgter Degradation hinterließen die Proben einen neutralen Geruchseindruck. Eine Akkumulation von Metabo-liten oder Endprodukten konnte gaschromatographisch nicht nachgewiesen werden, was auf einen vollständigen Limonenabbau hindeutet. Substratkonzentrationen von > 4042 mg/l führten dagegen zu einer Inhibierung des Limonenabbaus und zu einer Stagnation des Wachstums bzw. zum Absterben der Bakterien in den Schüttelkulturen. Die mikrobiologische Grobcharakterisierung führte zur Isolierung von insgesamt 44 Reinkulturen, die einzeln auf Limonenabbau getestet wurden. Es gelang, sechs Bakterien-stämme zu isolieren, die in der Lage waren, Limonen ohne Akkumulation geruchsintensiver Intermediärverbindungen abzubauen. Mittels physiologisch-biochemischer sowie chemotaxo-nomischer Untersuchungen wurden die Bakterienisolate vorbehaltlich der Nachfolgeunter-suchungen der Gattung Pseudomonas zugeordnet. Die molekularbiologische Untersuchung mittels Proteingel-Elektrophorese ergab durch Vergleich einzelner Proteinbanden im Gesamt-zellproteinmuster der Isolate untereinander sowie mit Referenzstämmen die Identität der Isolate L1,2, L2,4 und L4,10. Isolat L2,6 wies deutliche Unterschiede im Proteinbandenprofil gegenüber den übrigen Isolaten und Referenzstämmen auf und wurde zum Vergleich der Isolate L3,6 und L3,8 zu einer 16S rRNA Teilsequenzanalyse herangezogen. Die vollständige Sequenzanalyse des Isolates L3,6 führte zu einer Identität von 97 % mit P. alcaligenes. Hier muß davon ausgegangen werden, daß es sich um eine neue bisher nicht beschriebene Spezies der Gattung Pseudomonas handelt. Isolat L2,6 zeigte in der Teilsequenzanalyse eine Über-einstimmung von 96 % mit P. mendocina, was für die Zugehörigkeit zu einem neuen Genus spricht. Der Vergleich der Teilsequenzen von Isolat L3,8 mit denen bekannter Spezies ergab eine Identität von 98 % mit Pseudomonas sp. B13. Die endgültige taxonomische Einordnung ist allerdings erst nach einem Sequenzvergleich durch DNA-DNA-Hybridisierungen mit bisher sequenzierten Spezies möglich. Die Limonen-abbauenden Bakterienstämme L2,6, L3,6 und L3,8 repräsentieren daher eindeutig verschiedene Spezies, die vorläufig dem Genus Pseudomonas zugeordnet wurden. Die Wirksamkeit der Strategie, den Limonenabbau im Biofilter durch den Einsatz einer leistungsfähigen Anreicherungskultur (Mix der vier Anreicherungskulturen) zu verbessern, wurde im Überführungsversuch in zwei parallel laufenden Modellbiofiltern gaschromato-graphisch untersucht. Aus dem inokulierten Biofilter wurden Wirkungsgrade bis zu 100 % nach 67 Tagen Laufzeit bei kaum geänderter Gesamtkeimzahl ermittelt. Auch nach Einstellung der Beimpfung betrug die Konzentrationsminderung für Limonen bis zu 89 %. Die Einlaufphase des inokulierten Biofilters konnte gegenüber einem konventionellen Biofilter um 46 Tage auf 35 Tage wirksam verkürzt werden. Eine mikrobiologische Charakterisierung der aus zwei Biofiltern isolierten Bakterienkulturen ergab nicht die erwar-teten Unterschiede hinsichtlich der mikrobiologischen Besiedelung des Filtermaterials beider Biofilter. Die Wirksamkeit der Inokulationskulturen im Biofilter ließ sich gaschroma-tographisch und olfaktometrisch anhand der eliminierten Limonen- oder Geruchsstoffkon-zentrationen eindeutig nachweisen. Die Unterschiede in den Abbauleistungen beider Biofilter widerspiegeln sich folglich nicht deutlich in den taxonomischen Merkmalen der Bakterien-biozönosen. Vielmehr ist die mit der Ausbildung spezieller Enzymsysteme verbundene physiologische Adaptation verschiedenster Bakterienspezies entscheidend, um eine Opti-mierung des mikrobiellen Abbaus von Limonen in Biofiltern zu erreichen. / This study aimed to investigate the opportunities for the intensification of the microbial biodegradation of the odourous compound limonene by biofiltration as a biological waste gas treatment technology. Limonen represents a considerable odourous component during the intensive composting process of organic waste materials and its elemination capacity by using the biological waste gas treatment facilities is so far insufficient. This results to a molestation of the staff of composting facilities and adjacent residential areas by odours. The improvement of the hygienic status of the composting process connected with the increase of their social acceptance requires a biofilter system which is to be optimized regarding the biodegradation of limonene. The reliability of such biological deodorizing methods depends on the adjustment and optimisation of technological parameter as well as on the biological activity of limonene metabolizing microorganism microbiota in the carrier material. Though a wide range of limonene utilizing microorganisms are known, but the described bioconversion processes deal with mainly incomplete mineralization of these odourous compound resulting again in an accumulation of further volatile odourous substances. In this study four mixed bacterial population were successfully obtained from organic material samples (fir cone, fir needles, fir bark; coniferous forest soil; parings from citrus fruits; bio waste) by a simple enrichment technique (semicontinuous fed-batch principle) using limonene as the sole carbon and energy source, accompanied by microbial growth and mineralization. In consideration of the degradation kinetics of limonene all of the batch-cultures have shown high similarity. By initial concentrations of 536,5-889,5 mg/l after 41-59 hours and middle degradation rates of 48,1-51,0 mgl-1h-1limonene was degraded by bacterial cultures under the detection limit and samples have had a more neutral odourous impression. An accumulation of metabolites and other final products couldn't be detected by gaschromatography and this indicates a complete limonene bioconversion. Substrate concentrations greater than 4042 mg/l inhibited outright the biodegradation of this odourous compound as well as the growth of these bacteria and entailed finally to a toxic effect of the cells. Through microbial characterization 44 aerobic pure strains were isolated which were individually tested on limonene degradation. The isolation of six bacteria strains that were capable of limonene degradation without accumulation of other intermediate odourous compounds were achieved. Physiological, biochemical as well as chemotaxonomic characterization tests assigned the bacterial isolates subject to additional tests to the genus Pseudomonas. Phylogenetic investigation by using polyacrylamid gel electrophoresis revealed through comparison of the several protein bands in the whole protein pattern of the isolates with each other as well as with reference strains the identity of the isolates L1,2, L2,4 and L4,10. The isolate L2,6 showed clear differences in the protein pattern to the other isolates and reference strains and was taken with regard to a comparison of the isolates L3,6 and L3,8 to a partial 16S rRNA sequence analysis. The complete 16S rRNA analysis of the isolate L3,6 led to an identity of 97 % with P. alcaligenes. It has to be assumed here that the isolate is different from species previously described and represents a new species of the genus Pseudomonas. Partial 16S rRNA analysis of the isolate L2,6 showed a similarity of 96 % between the isolate and P. mendocina and indicate that this isolate is a member of a new genus. Partial 16S rRNA sequence comparison of the isolate L3,8 with corresponding fragments from reference strains listed in the data bank of nucleotides resulted in a similarity of 97 % with Pseudomonas sp. B13. For the definitive taxonomic arrangement of these isolates DNA-DNA hybridization with related species are required. The limonene degrading isolates represent clearly different species provisionaly allocated to the genus Pseudomonas. The effectiveness of the strategy to enhance the removal capacity for limonene with an efficient enrichment culture (mix of the four batch cultures) was tested in two parallel running biofilters (one inoculated and one biofilter without inoculation) and the degradation of limonene was followed. Chemical analysis was carried out by gas chromatography mass spectrometry. From the inoculated biofilter an efficiency up to 100 % was determined after 67 days running time and the total cell count altered scarcely. Also after a discontinue of the inoculation the elimination capacity for limonene amounted up to 89 %. The adaption time of the inoculated biofilter was successfully reduced from 81 to 35 days compared to a conventional biofilter. A microbial characterization of the isolated bacterial cultures from biofilters did'nt show the expected differences concerning the microbial composition of the carrier material of both biofilters. The activity of the enrichment cultures could be clearly proved by gaschromatography and olfactometry by means of the eliminated limonene concentrations. Therefore the differences of the elimination capacity of both biofilters didn't clearly appear in the taxonomic characteristics of the bacterial microbiota. Decisive is rather the physiological adaption of various bacterial species by formation of special enzyme systems to achieve an optimisation of the microbial degradation of limonene in biofilters.

The aim of the thesis was to prove the variability of the essence content by 36 evaluated samples (tribes) from the chosen new selection of caraway (Carum carvi L.). Caraway, its morphology, origin and spread was described in the literary part. It is followed by the summary of its most important use, its cultivating technology and the state of health was also described shortly. Next chapter devoted to the selection of apiaceae species with a view to caraway. Last two chapters describe plant essences and the content matters of caraway. The practical part gives an idea of individual samples (tribes), then the distillation with steam for finding of essence content and gas chromatography, which the analysis of limonene and carvone content was done, was described. The samples (tribes) number 25, 27, 34, 35 and 3 were evaluated as the best for the next selection from the standpoint of essence content and they had the right proportion of carvone to limonene.

Zugl.: Bonn, Univ., Diss.

The progress in biotechnological disciplines such as metabolic engineering or synthetic biology increased the interest of chemical and pharmaceutical industries to implement microbial processes for chemical synthesis. However, most microorganisms, e.g., Escherichia coli or Saccharomyces cerevisiae, used in biotechnological applications are not evolved by nature for the production of industrially relevant compounds, which are often hydrophobic, non-charged, volatile, or toxic to the microbial organisms. Bioprocess design relies on an integrated approach addressing pathway, cellular, reaction, and process engineering to combine the results of natural evolution with the demands of industrial applicability. In this thesis, the microbial de novo production and selective oxyfunctionalization of the highly volatile isoprenoid limonene has been investigated as a model system featuring reactants with challenging physicochemical characteristics. Key constraints that limit limonene biosynthesis and its oxyfunctionalization in recombinant E. coli, related to genetics, physiology, and reaction engineering, were identified and relieved.

Ziel des Forschungsvorhabens war die Untersuchung von Möglichkeiten zur Intensivierung des mikrobiellen Abbaus des Geruchsstoffes Limonen unter Anwendung des Biofilter-verfahrens. Limonen stellt eine wesentliche Geruchskomponente bei der Intensivrotte der Bioabfallkompostierung dar und wird bisher in biologischen Abluftreinigungsanlagen oft nur unzureichend eliminiert. Dies führt zu einer Geruchsbelästigung des Personals und an-grenzender Wohngebiete. Die Verbesserung des hygienischen Status der Bioabfallkom-postierung und eine damit verbundene Steigerung ihrer gesellschaftlichen Akzeptanz erfordert daher ein Biofilterverfahren, das hinsichtlich des Limonenabbaus optimiert wird. Die Zuverlässigkeit von Biofiltern ist neben der Einstellung und Optimierung technischer Parameter auch von der biologischen Aktivität der im Strukturmaterial vorhandenen Mikro-organismenbiozönose abhängig. Viele zum mikrobiellen Abbau von Limonen befähigte Mikroorganismen sind zwar bekannt, doch handelt es sich bei den beschriebenen Abbau-mechanismen hauptsächlich um eine unvollständige Mineralisierung dieses Geruchsstoffes, die zu einer Anreicherung wiederum geruchsbelasteter Verbindungen führt. In dieser Arbeit wurden aus Umweltproben (Fichtenzapfen, -nadeln, -rinde; Waldboden; Schalen von Zitrusfrüchten; Bioabfall) vier bakterielle Mischpopulationen, die zur Ver-wertung von Limonen als einzige Energie- und Kohlenstoffquelle in der Lage sind und durch Wachstum auf diesem Substrat Biomasse bilden, in Schüttelkultur durch Metabolisierung von Limonen erfolgreich angereichert. Hinsichtlich ihrer Abbaukinetik für Limonen wiesen alle Batch-Kulturen eine starke Ähnlichkeit auf. Limonen wurde bei Anfangskonzentrationen von 536,5-889,5 mg/l nach 41-59 Stunden und mittleren Abbauraten von 48,1-51,0 mgl-1h-1 durch die Batch-Kulturen bis unter die Nachweisgrenze abgebaut. Nach erfolgter Degradation hinterließen die Proben einen neutralen Geruchseindruck. Eine Akkumulation von Metabo-liten oder Endprodukten konnte gaschromatographisch nicht nachgewiesen werden, was auf einen vollständigen Limonenabbau hindeutet. Substratkonzentrationen von > 4042 mg/l führten dagegen zu einer Inhibierung des Limonenabbaus und zu einer Stagnation des Wachstums bzw. zum Absterben der Bakterien in den Schüttelkulturen. Die mikrobiologische Grobcharakterisierung führte zur Isolierung von insgesamt 44 Reinkulturen, die einzeln auf Limonenabbau getestet wurden. Es gelang, sechs Bakterien-stämme zu isolieren, die in der Lage waren, Limonen ohne Akkumulation geruchsintensiver Intermediärverbindungen abzubauen. Mittels physiologisch-biochemischer sowie chemotaxo-nomischer Untersuchungen wurden die Bakterienisolate vorbehaltlich der Nachfolgeunter-suchungen der Gattung Pseudomonas zugeordnet. Die molekularbiologische Untersuchung mittels Proteingel-Elektrophorese ergab durch Vergleich einzelner Proteinbanden im Gesamt-zellproteinmuster der Isolate untereinander sowie mit Referenzstämmen die Identität der Isolate L1,2, L2,4 und L4,10. Isolat L2,6 wies deutliche Unterschiede im Proteinbandenprofil gegenüber den übrigen Isolaten und Referenzstämmen auf und wurde zum Vergleich der Isolate L3,6 und L3,8 zu einer 16S rRNA Teilsequenzanalyse herangezogen. Die vollständige Sequenzanalyse des Isolates L3,6 führte zu einer Identität von 97 % mit P. alcaligenes. Hier muß davon ausgegangen werden, daß es sich um eine neue bisher nicht beschriebene Spezies der Gattung Pseudomonas handelt. Isolat L2,6 zeigte in der Teilsequenzanalyse eine Über-einstimmung von 96 % mit P. mendocina, was für die Zugehörigkeit zu einem neuen Genus spricht. Der Vergleich der Teilsequenzen von Isolat L3,8 mit denen bekannter Spezies ergab eine Identität von 98 % mit Pseudomonas sp. B13. Die endgültige taxonomische Einordnung ist allerdings erst nach einem Sequenzvergleich durch DNA-DNA-Hybridisierungen mit bisher sequenzierten Spezies möglich. Die Limonen-abbauenden Bakterienstämme L2,6, L3,6 und L3,8 repräsentieren daher eindeutig verschiedene Spezies, die vorläufig dem Genus Pseudomonas zugeordnet wurden. Die Wirksamkeit der Strategie, den Limonenabbau im Biofilter durch den Einsatz einer leistungsfähigen Anreicherungskultur (Mix der vier Anreicherungskulturen) zu verbessern, wurde im Überführungsversuch in zwei parallel laufenden Modellbiofiltern gaschromato-graphisch untersucht. Aus dem inokulierten Biofilter wurden Wirkungsgrade bis zu 100 % nach 67 Tagen Laufzeit bei kaum geänderter Gesamtkeimzahl ermittelt. Auch nach Einstellung der Beimpfung betrug die Konzentrationsminderung für Limonen bis zu 89 %. Die Einlaufphase des inokulierten Biofilters konnte gegenüber einem konventionellen Biofilter um 46 Tage auf 35 Tage wirksam verkürzt werden. Eine mikrobiologische Charakterisierung der aus zwei Biofiltern isolierten Bakterienkulturen ergab nicht die erwar-teten Unterschiede hinsichtlich der mikrobiologischen Besiedelung des Filtermaterials beider Biofilter. Die Wirksamkeit der Inokulationskulturen im Biofilter ließ sich gaschroma-tographisch und olfaktometrisch anhand der eliminierten Limonen- oder Geruchsstoffkon-zentrationen eindeutig nachweisen. Die Unterschiede in den Abbauleistungen beider Biofilter widerspiegeln sich folglich nicht deutlich in den taxonomischen Merkmalen der Bakterien-biozönosen. Vielmehr ist die mit der Ausbildung spezieller Enzymsysteme verbundene physiologische Adaptation verschiedenster Bakterienspezies entscheidend, um eine Opti-mierung des mikrobiellen Abbaus von Limonen in Biofiltern zu erreichen. / This study aimed to investigate the opportunities for the intensification of the microbial biodegradation of the odourous compound limonene by biofiltration as a biological waste gas treatment technology. Limonen represents a considerable odourous component during the intensive composting process of organic waste materials and its elemination capacity by using the biological waste gas treatment facilities is so far insufficient. This results to a molestation of the staff of composting facilities and adjacent residential areas by odours. The improvement of the hygienic status of the composting process connected with the increase of their social acceptance requires a biofilter system which is to be optimized regarding the biodegradation of limonene. The reliability of such biological deodorizing methods depends on the adjustment and optimisation of technological parameter as well as on the biological activity of limonene metabolizing microorganism microbiota in the carrier material. Though a wide range of limonene utilizing microorganisms are known, but the described bioconversion processes deal with mainly incomplete mineralization of these odourous compound resulting again in an accumulation of further volatile odourous substances. In this study four mixed bacterial population were successfully obtained from organic material samples (fir cone, fir needles, fir bark; coniferous forest soil; parings from citrus fruits; bio waste) by a simple enrichment technique (semicontinuous fed-batch principle) using limonene as the sole carbon and energy source, accompanied by microbial growth and mineralization. In consideration of the degradation kinetics of limonene all of the batch-cultures have shown high similarity. By initial concentrations of 536,5-889,5 mg/l after 41-59 hours and middle degradation rates of 48,1-51,0 mgl-1h-1limonene was degraded by bacterial cultures under the detection limit and samples have had a more neutral odourous impression. An accumulation of metabolites and other final products couldn''t be detected by gaschromatography and this indicates a complete limonene bioconversion. Substrate concentrations greater than 4042 mg/l inhibited outright the biodegradation of this odourous compound as well as the growth of these bacteria and entailed finally to a toxic effect of the cells. Through microbial characterization 44 aerobic pure strains were isolated which were individually tested on limonene degradation. The isolation of six bacteria strains that were capable of limonene degradation without accumulation of other intermediate odourous compounds were achieved. Physiological, biochemical as well as chemotaxonomic characterization tests assigned the bacterial isolates subject to additional tests to the genus Pseudomonas. Phylogenetic investigation by using polyacrylamid gel electrophoresis revealed through comparison of the several protein bands in the whole protein pattern of the isolates with each other as well as with reference strains the identity of the isolates L1,2, L2,4 and L4,10. The isolate L2,6 showed clear differences in the protein pattern to the other isolates and reference strains and was taken with regard to a comparison of the isolates L3,6 and L3,8 to a partial 16S rRNA sequence analysis. The complete 16S rRNA analysis of the isolate L3,6 led to an identity of 97 % with P. alcaligenes. It has to be assumed here that the isolate is different from species previously described and represents a new species of the genus Pseudomonas. Partial 16S rRNA analysis of the isolate L2,6 showed a similarity of 96 % between the isolate and P. mendocina and indicate that this isolate is a member of a new genus. Partial 16S rRNA sequence comparison of the isolate L3,8 with corresponding fragments from reference strains listed in the data bank of nucleotides resulted in a similarity of 97 % with Pseudomonas sp. B13. For the definitive taxonomic arrangement of these isolates DNA-DNA hybridization with related species are required. The limonene degrading isolates represent clearly different species provisionaly allocated to the genus Pseudomonas. The effectiveness of the strategy to enhance the removal capacity for limonene with an efficient enrichment culture (mix of the four batch cultures) was tested in two parallel running biofilters (one inoculated and one biofilter without inoculation) and the degradation of limonene was followed. Chemical analysis was carried out by gas chromatography mass spectrometry. From the inoculated biofilter an efficiency up to 100 % was determined after 67 days running time and the total cell count altered scarcely. Also after a discontinue of the inoculation the elimination capacity for limonene amounted up to 89 %. The adaption time of the inoculated biofilter was successfully reduced from 81 to 35 days compared to a conventional biofilter. A microbial characterization of the isolated bacterial cultures from biofilters did''nt show the expected differences concerning the microbial composition of the carrier material of both biofilters. The activity of the enrichment cultures could be clearly proved by gaschromatography and olfactometry by means of the eliminated limonene concentrations. Therefore the differences of the elimination capacity of both biofilters didn''t clearly appear in the taxonomic characteristics of the bacterial microbiota. Decisive is rather the physiological adaption of various bacterial species by formation of special enzyme systems to achieve an optimisation of the microbial degradation of limonene in biofilters.