Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-01-26T13:56:45Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_AvaliacaoPotencialBiotecnologico.pdf: 1386641 bytes, checksum: 94f8b0196b1a33ca4a9d5eec8af30944 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-01-27T13:26:30Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_AvaliacaoPotencialBiotecnologico.pdf: 1386641 bytes, checksum: 94f8b0196b1a33ca4a9d5eec8af30944 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-27T13:26:30Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_AvaliacaoPotencialBiotecnologico.pdf: 1386641 bytes, checksum: 94f8b0196b1a33ca4a9d5eec8af30944 (MD5) Previous issue date: 2015-11-30 / CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Swietenia macrophylla (mogno) é uma espécie de planta amplamente conhecida pelo seu potencial terapêutico. Os principais constituintes de extratos isolados de partes dessa planta são estruturas conhecidas como limonoides. Os limonoides também apresentam várias atividades biológicas, dentre elas, ação antitumoral. O objetivo desse trabalho foi avaliar o potencial antitumoral do extrato e de limonoide obtido de folhas de S. macrophylla em linhagens tumorais. A avaliação da citotoxicidade frente a 5 linhagens tumorais e uma normal, revelou que o extrato teve ação citotóxica em linhagens de câncer coloretal (HCT-116 e HT-29), já os limonoides foram citotóxicos para câncer colorretal (HCT-116) e melanoma (SKMEL-19). Diante desses resultados, foram selecionados o limonoide L3 e a linhagem HCT-116 para avaliação do mecanismo de ação, assim como a linhagem HT-29, que possui o gene TP53 mutado para comparação do possível mecanismo de ação do composto, haja vista que foi menos sensível a L3. Além disso, L3 se mostrou mais seletiva para células tumorais. Nenhum dos compostos causou hemólise em eritrócitos de camundongos. Para avaliação da ação antiproliferativa de L3, foi realizado o ensaio clonogênico, onde nas duas linhagens houve significativa redução de colônias, no entanto essa redução foi mais expressiva em HCT-116. O composto L3 também causou morte por apoptose de maneira dose-dependente nas linhagens, onde o número de células em processo de apoptose foi maior na HCT-116. Para avaliação de dano ao DNA, foi realizado o ensaio do cometa, o qual demonstrou que L3 causa dano no DNA das duas linhagens, com índice de dano maior na HCT-116. A avaliação da distribuição de células pelo ciclo celular após tratamento com L3 mostrou que houve bloqueio do ciclo na fase G2/M, principalmente na HCT-116 (45% das células). A partir desses dados, foi realizado um estudo de genes implicados nessa fase do ciclo, a partir da análise de suas expressões por PCR-RT. O gene ATM, o qual é ativado mediante a danos no DNA, ativa o CHK-2 que por sua vez fosforila p53. p53 pode ativar a transcrição de p21, o qual desencadeia parado ciclo celular, ou ativar vias de morte celular. Neste trabalho, foi verificado aumento da expressão dos genes ATM, CHK-2, TP53, ARF de maneira dose dependente nas duas linhagens, sendo essa expressão foi maior em células da linhagem HCT-116. A expressão de p21 foi aumentada em HCT-116, ao passo que em HT-29 diminuiu, isso se deve ao fato que HT-29 possuir o gene TP53 mutante, logo sua proteína não funciona corretamente. Quanto a via da apoptose, foi avaliado o gene da caspase-3 e o gene antiapoptótico BCL-2. Houve aumento na expressão de caspase-3, principalmente em HCT-116, e diminuição de BCL-2. Esses resultados sugerem que L3 possa estar causando danos ao DNA das células, desencadeando uma via de sinalização celular dependente de p53. Para avaliação da toxicidade do extrato de S. macrophylla, foi realizado o teste de toxicologia aguda em camundongos, onde o extrato não causou nenhuma alteração nos parâmetros fisiológicos dos animais. Assim como, o teste de claustogenicidade (micronúcleo) também mostrou que o extrato não é mutagênico em células da medula óssea de camundongos. / Swietenia macrophylla (mahogany) is a species of plant widely known for its therapeutic potential. The main constituents isolated extracts of this plant are structures known as limonoids. The limonoids also have several biological activities, among them, antitumor activity. The aim of this study was to evaluate the antitumor potential of the extract and limonoid obtained from leaves of S. macrophylla in cancer cell lines. Cytotoxicity to 5 cancer cell lines and normal revealed that the extract had cytotoxic effect in colorectal cancer cell lines (HCT-116 and HT-29), as the limonoids were cytotoxic for colorectal cancer (HCT-116) and melanoma (SKMEL-19). Given these results, we selected the limonoid L3 and HCT-116 cell line to evaluate the mechanism of action, as well as the HT-29 lineage, which has the TP53 gene mutated for comparison as possible of the compound mechanism of action, once it was less sensitive to L3. Moreover, L3 showed more selective for tumor cells. None of the compounds caused hemolysis of erythrocytes in mice. To evaluate the antiproliferative action of L3, the clonogenic assay was performed, where the two lines there was a significant reduction of colonies, however this reduction was more significant in HCT-116. The L3 compound also has caused death by apoptosis in a dose-dependent manner in the lines, where the number of cells in apoptosis was higher in HCT-116. To evaluate DNA damage, it was held the comet assay, which showed that L3 cause damage to the DNA of the two cancer cell lines, with greater damage index in HCT-116. The assessment of cell cycle distribution of cells after treatment with L3 showed that there was blocking the cycle at the G2 / M phase, mainly in HCT-116 (45% of the cells). From these data, it conducted a study of genes involved in this phase of the cycle, from analysis of their expression by RT-PCR. The ATM gene, which is activated by DNA damage activates the CHK-2 which in turn phosphorylates p53 protein. p53 protein can activate the transcription of p21 gene, which triggers cell cycle stopped, or activate cell death pathways. In this study, we found increased expression of genes ATM, CHK-2, TP53, ARF in a dose dependent in both cacer cell lines, and this expression was higher in HCT-116 cell line. The expression of p21 was increased in HCT-116, while in HT-29 decreased, this is due to the fact that HT-29 possess the mutant TP53 gene, then your protein does not work properly. As the path of apoptosis was evaluated caspase-3 gene and the anti-apoptotic gene BCL-2. There was increase in the expression of caspase-3 mainly in HCT-116 and decrease of BCL-2. These results suggest that L3 may be causing damage to the DNA of cells, triggering a cellular signaling pathway dependent on p53. To evaluate the toxicity of S. macrophylla extract, it was held the acute toxicology testing in mice, where the extract did not cause any changes in the physiological parameters of animals. As the claustogenicidade test (micronucleus) also showed that the extract is not mutagenic in the mouse bone marrow cells.