Seminario de Título entregado a la Universidad de Chile en cumplimiento parcial de los requisitos para optar al Grado de Magister en Ciencias Biológicas. / El sistema nervioso y el sistema inmune se encuentran íntimamente relacionados comunicándose bidireccionalmente mediante citoquinas, neuropéptidos y neurotransmisores, como la dopamina. Este neurotransmisor ejerce su efecto a través de cinco receptores dopaminérgicos que poseen diferentes grados de afinidad, contando con la mayor afinidad el receptor 3 (D3R). Su presencia se ha reportado en diferentes células del sistema inmune. La estimulación del D3R promueve la producción de IFN-γ en linfocitos T CD4+, favoreciendo su diferenciación a un perfil Th1. Sin embargo, el rol de este receptor en los linfocitos T CD8+ aún no se ha estudiado a cabalidad. En esta tesis se estudió la incidencia del D3R en la formación del perfil citotóxico en linfocitos T CD8+, que poseen un TCR transgénico específico para el péptido OVA(257-264) alojado sobre el MHC de clase I H2-Kb (linfocitos OT-I). La diferenciación in vitro muestra que la carencia del D3R en linfocitos OT-I (OT-I D3RKO) resulta en una reducción significativa en la producción de IFN-γ, TNF-α, IL-2 y en la expresión de CD25 (cadena α del receptor de IL-2) en respuesta a la estimulación con péptido OVA(257-264). Estas deficiencias se revierten al añadir IL-2 exógena a los cultivos, sugiriendo que el mecanismo de acción por el cual el D3R favorece la diferenciación hacia un fenotipo efector productor de IFN-γ y TNF- α ocurre a través de la producción de IL-2. Concordante con lo anterior, se observó que la expresión del D3R en linfocitos OT-I promueve la expansión clonal y la protección antitumoral frente a melanoma. En conjunto los resultados obtenidos en linfocitos T CD8+ sugieren que el D3R promueve la formación de un perfil citotóxico, induciendo la producción de IFN-γ y favoreciendo una alta tasa de expansión clonal, lo que conlleva a una mayor sobrevida frente a un desafío tumoral. / The nervous system and the immune system are intimately related, communicating bi-directionally through cytokines, neuropeptides and neurotransmitters. Dopamine is a neurotransmitter that exerts its effect through five dopaminergic receptors which display different degrees of affinity. The D3R, which display the highest affinity for dopamine, has been found expressed in CD4+ T cells, where its stimulation promotes high production of IFN-γ, favoring the acquisition of the Th1 profile. However, the role of this receptor in CD8+ T lymphocytes has not yet been fully studied. In this thesis the role of D3R in the acquisition of the cytotoxic profile by CD8+ T lymphocytes was studied. For this purpose, in this thesis CD8+ T-cells bearing a transgenic TCR specific for the recognition of the OVA peptide(257-264) over the class I MHC H2-Kb (OT-I lymphocytes) were used. In vitro differentiation experiments show that lack of D3R in OT-I lymphocytes (OT-I D3RKO) results in a significant reduction in the production of IFN-γ, TNF-α and on the expression of CD25 (α chain of the IL-2 receptor) in response to the stimulation with OVA peptide(257-264). These effects were reversed by adding exogenous IL-2 into the cultures, suggesting a mechanism by which D3R favors the differentiation towards an effector phenotype through the production of IL-2. In vivo experiments show that D3R expressed on OT-I lymphocytes favors a higher clonal expansion and thereby an stronger protection against melanoma tumors. The results obtained suggest that D3R promotes the formation of a more efficient cytotoxic profile capable of producing higher percentages of IFN-γ and higher rates of clonal expansion, which leads to greater survival in the face of a tumor challenge. / Junio 2020

Título de Ingeniero en Biotecnología Molecular / Las Gap Junctions (GJs) son clústers de canales intercelulares localizados en la membrana plasmática que permiten la comunicación directa entre células adyacentes. Cada canal GJ está compuesto por 2 hemicanales hexaméricos conocidos como conexones, los cuales a su vez están compuestos por seis proteínas de transmembrana llamadas conexinas (Cxs), siendo Cx43 la más representada en el sistema inmune. Se ha vinculado la variación de los niveles normales de expresión de las Cxs con la patogénesis de distintas enfermedades, incluyendo sordera congénita, arritmias cardiacas y cáncer. Dentro de esta última nuestro laboratorio ha desarrollado proyectos de investigación que permitan determinar el papel de las GJs en la respuesta inmune antitumoral. Por ejemplo, publicaciones previas de nuestro laboratorio han demostrado que Cx43 participa en la transferencia directa de antígenos tumorales entre células dendríticas (DCs). Así mismo, Cx43 polariza hacia la sinapsis entre DC y linfocitos T (LT) CD4+, formando canales funcionales que permiten una comunicación bidireccional requerida para la activación de LT mediada por APC. Además, se ha encontrado que Cx43 juega un rol en la activación de células natural killer (NK) por parte de DCs y en la regulación de la citotoxicidad de las células NK contra células tumorales. Así mismo, resultados no publicados indican que Cx43 polariza hacia el sitio de contacto entre LT CD8+ citotóxicos (CTLs) y células de melanoma, sugiriendo que Cx43 participaría en la citotoxicidad de CTLs en contra de éstas. Estos antecedentes sugieren que las GJs podría participar en el transporte de moléculas o señales que se encuentren involucradas en el proceso de activación de LT CD8+ mediada por DCs, tema que aún no ha sido estudiado por las investigaciones actuales. En estudios 2 anteriores nuestro laboratorio ha trabajado con modelos celulares humanos, sin embargo, dado que la obtención de LT vírgenes específicos contra el tumor a partir de donantes sanos es improbable y engorroso, en este trabajo decidimos utilizar el modelo murino específico para melanoma pMEL-1 y validar y optimizar su utilización para estudios de la participación de las GJs en la activación de LT CD8+ por parte de DCs. Nuestros resultados indican que el modelo pMEL-1 no representa alteraciones en la expresión de Cx43 respecto a su contraparte silvestre (wild type (WT)), y que es un modelo muy sensible, encontrando expresión del marcador de activación CD69 incluso desde 1 hora post co-cultivo. Además, se determinó que existe transferencia de calceína entre moDC y LT CD8+ pMEL-1 en un contexto estrictamente antígeno específico. Sin embargo, no pudimos dilucidar si las GJs participan del proceso de activación ya que el método de inhibición utilizado, el cual es un péptido mimético de Cx43, presentó problemas técnicos de funcionamiento, fenómeno que fue comprobado en modelos donde anteriormente se había determinado la comunicación mediada por GJs. Proponemos en el futuro utilizar otros métodos de inhibición, como el uso de siRNA contra Cx43, para determinar si estos canales juegan un rol en este proceso. / Gap Junctions are clusters of intercellular channels located in the plasma membrane that allow direct communication between adjacent cells. Each GJ channel is composed of 2 hexameric hemichannels known as connexions, which are composed by six transmembrane proteins called conexins (Cxs), being Cx43 the most represented one in the inmmune system. Variation in normal expression levels on Cxs have been linked to the development of different diseases, including congenital deafness, cardiac arrhythmias and cancer, being the last the one where our laboratory has developed investigation lines that allow to determine the role of GJs in the antitumoral response. In example, previous publications of our group have demonstrated that Cx43 participates in the direct transfer of tumoral antigens between dendritic cells (DCs) and that polarizes to the synapsis between DCs and CD4+ T lymphocytes, forming functional channels that allow bidirectional communication required for the DCs mediated activation of LT. Besides this, we have found that Cx43 plays a role in the activation of natural killer (NK) cells mediated by DCs, and in the regulation of the cytotoxicity of NK cells against tumor cells. Likewise, unpublished data indicate that Cx43 polarizes to the contact site between cytotoxic CD8+ T cells (CTLs) and melanoma cells, suggesting that Cx43 participates in the cytotoxicity of these cells. These backgrounds suggest that GJs may participate in the transport of molecules or signals that may be involved in the process of DC mediated activation of CD8+ T cells, subject that hasn’t been studied by the actual investigations. In previous studies our group has worked with human cellular models, however, given that obtaining naïve T cells from healthy donors is unlikely and difficult, in this work we decided to use the melanoma specific murine model pMEL-1 and valid and optimize it’s use for studies of the participation of GJs in the DCs 4 activation of T cells. Our results indicate that the pMEL-1 model doesn’t have alterations in the Cx43 expression levels compared with the wild type background and that it is a very sensible model, in which we can evaluate the activation of T cells even an hour after co-culture. Besides, it was determined the existence of calcein transfer between moDCs and CD8+ pMEL-1 T cells in a strictly antigen specific context. However, we could not elucidate if the GJs participate or not in the CD8+ T cell activation process, as our inhibition method, which is a Cx43 mimetic peptide, presented technical problems, phenomenon that was proven in models where GJ mediated communication has previously been determinate. We propose in the future to use a different inhibition method, as the use of anti-Cx43 siRNA, in order to determine if these channels play a role in this process.