Submitted by Luciana Sebin (lusebin@ufscar.br) on 2016-09-20T11:53:52Z No. of bitstreams: 1 DissFAS.pdf: 3866365 bytes, checksum: 2c638e6b8615d87227d6b4cf320ff76c (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-21T12:43:13Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissFAS.pdf: 3866365 bytes, checksum: 2c638e6b8615d87227d6b4cf320ff76c (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-09-21T12:43:21Z (GMT) No. of bitstreams: 1 DissFAS.pdf: 3866365 bytes, checksum: 2c638e6b8615d87227d6b4cf320ff76c (MD5) / Made available in DSpace on 2016-09-21T12:43:30Z (GMT). No. of bitstreams: 1 DissFAS.pdf: 3866365 bytes, checksum: 2c638e6b8615d87227d6b4cf320ff76c (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Biodiesel, a fuel produced from renewable sources, is a sustainable substitute to meet the growing global energy demand. The transesterification (alcoholysis) of oils and fats is the route most used in biodiesel synthesis, resulting in high yields in a reduced reaction period. An alternative route for the synthesis of biodiesel is the hydroesterification process that consists of the hydrolysis of vegetable oil (triglyceride), purification of the formed free fatty acids (FFA), followed by esterification with ethanol, resulting in high quality products and co-products. This dissertation aimed to study the synthesis of biodiesel by transesterification and hydroesterification of soybean and macaw palm kern oils with ethanol, catalyzed by lipase of dormant seeds of castor bean crude extract (CBCE) in solvent-free media. It was studied and defined as the best protocol for preparing CBCE the incubation in acetone 4 °C for 4 hours with no subsequent washings with acetone. The CBCE showed a high catalytic activity of the enzyme extract in hydrolysis reactions in acid medium (pH 4.5). However, no activities were bserved in esterification and transesterification reactions, possibly due to the low stability in the presence of organic solvents and alcohols. The CBCE showed low stability at temperatures higher than ambient temperatures. The complete conversion of soybean oil in the hydrolysis was reached after 6 h of reaction, in the absence of salt, 37 °C, 1,000 rpm, 4% w/v CBCE. Under the same conditions, it reached up to 90% conversion of macaw palm oil. Subsequently, the kinetic study of soybean oil hydrolysis catalyzed by CBCE was carried, studying the influence of the catalyst and substrate concentration on the initial rates of the reaction; and temperature influence throughout the reaction. Using 1% w/v CBCE, the highest initial reaction rate was obtained for the oil concentration of 147 mM (128.2 g/L oil). For higher substrate concentrations, a decrease of reaction speed was observed, indicating a decrease in enzyme activity under these conditions. The kinetic model of Michaelis-Menten with the substrate inhibition adequately fitted the experimental data (R² = 0.96). The estimated values for the kinetic parameters were: Vmax (2.85 ± 0.75 mM / min), KM (182.95 ± 65.80 mM) and KI (217.23 ± 95.34 mM). These results reveal a promising application of CBCE as robust biocatalyst in the hydrolysis of oils for the production of concentrated FFA. Since CBCE does not catalyze esterification reaction, the FFA obtained in the hydrolysis were purified and used for the synthesis of ethyl esters in solvent-free media, using the lipase of Thermomyces lanuginosus (TLL) covalently immobilized in epoxy resin as biocatalyst. The maximum ester conversion reached (85%) was obtained after 2 hours of reaction when soybean FFA was used as substrate; and 71% for macaw palm FFA after 6 hours of reaction. The low thermal stability of the CBCE motivated the castor bean lipase purification, aiming subsequent enzyme immobilization. Immobilization allows reuse of enzymes and an increase in its stability, depending on the strategy used. The lipase extraction assays at different pHs showed a maximum selectivity for the 50 mM sodium citrate buffer, pH 4.0 and a maximum yield for the 50 mM sodium phosphate buffer, pH 7.0. Adsorption experiments on hydrophobic and ionic supports were performed. Preliminary results showed that the castor bean lipase was strongly adsorbed on supports activated with amino groups (83%), where hydrolytic activity was observed both in derivatives as well in the supernatants containing the desorbed lipase. / O biodiesel representa uma alternativa sustentável para suprir a crescente demanda energética mundial. A síntese desse combustível vem utilizando principalmente a reação de transesterificação (alcoólise) de óleos e gorduras, que resulta em elevados rendimentos, em curto período reacional. Uma rota alternativa que vem sendo estudada é a hidroesterificação, que consiste na hidrólise do óleo vegetal (triglicerídeo), purificação dos ácidos graxos formados (AGL), seguida pela esterificação destes com etanol, resultando em produtos e coprodutos de alta qualidade. Este trabalho teve como objetivo estudar a síntese de biodiesel pelas rotas de transesterificação e hidroesterificação do óleo de soja e de castanha de macaúba com etanol, catalisadas por lipases de sementes dormentes de mamona (ESM) em meio isento de solventes. Foi estudado e definido como melhor protocolo para preparação do ESM a incubação em acetona 4°C por 4h sem lavagens posteriores com acetona. O ESM apresentou uma elevada atividade catalítica do extrato enzimático em reações de hidrólise em meio ácido (pH 4,5). Entretanto, não houve atividade em reações de transesterificação e esterificação, devido possivelmente à sua baixa estabilidade na presença de solventes orgânicos e álcoois. ESM mostrou baixa estabilidade em temperaturas muito acima da ambiente. Verificou-se a completa conversão nas hidrólises do óleo de soja após 6 h de reação, na ausência de sais, 37 °C, 1.000 rpm, 4% m/v de ESM. Nestas mesmas condições, atingiu-se 90% para o óleo de macaúba. Foi a seguir realizado estudo cinético da hidrólise do óleo de soja catalisado por ESM, estudando-se influência da concentração de catalisador e de substrato nas velocidades iniciais; e da temperatura ao longo da reação. Usando-se 1% m/V de ESM, a máxima velocidade inicial de reação foi obtida para a concentração de óleo de 147 mM (128,2 g/L de óleo), observando-se redução da velocidade para concentrações mais altas de óleo, indicando a queda na atividade da enzima nessas condições. O modelo cinético de Michaelis-Menten com inibição incompetitiva pelo substrato conseguiu representar bem o comportamento dos dados experimentais (R2=0,96). Os valores estimados para os parâmetros cinéticos foram: VMáx (2,85 ± 0,75 mM/min), KM (182,95 ± 65,80 mM) e KI (217,23 ± 95,34 mM). Esses resultados revelam aplicação promissora de ESM como biocatalisador robusto na hidrólise de óleos visando à produção de concentrado de AGL. Uma vez que lipase de ESM não catalisa reação de esterificação, os ácidos graxos livres produzidos na hidrólise foram purificados e empregados na síntese de ésteres etílicos em meio isento de solventes, utilizandose como biocatalisador lipase de Thermomyces lanuginosus (LTL) imobilizada covalentemente em resina epóxi. A máxima conversão em ésteres, de 85%, foi obtida após 2 horas de reação empregando AGL do óleo de soja; e conversão de 71% dos AGL de macaúba após 6 horas de reação. A baixa estabilidade térmica da lipase de mamona motivou a realização de estudo preliminar de purificação da enzima presente no ESM, visando posterior imobilização da enzima. A imobilização de enzimas permite sua reutilização e aumento de estabilidade, dependendo da estratégia utilizada. Os ensaios de extração da enzima em diferentes pHs mostraram máxima seletividade em tampão citrato de sódio 50 mM, pH 4,0 e máximo rendimento em tampão fosfato de sódio 50 mM, pH 7,0. Foram realizados testes de adsorção física em suportes hidrofóbicos e iônicos. Os resultados preliminares obtidos mostraram que a lipase de mamona foi altamente adsorvida em suportes ativados com grupos amino (83%), sendo possível verificar a atividade hidrolítica tanto nos derivados como nos sobrenadantes contendo a lipase dessorvida.