Regensburg, Univ., Diss., 2009.

Eidgen. Techn. Hochschule, Diss.--Zürich, 2006.

Thesis (Ph. D.)--Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universitat Bonn, 2000.

Zugl.: Zürich, Techn. Hochsch., Diss., 2006

Thesis (doctoral)--Bonn, 1965.

Tierärztl. Hochsch., Diss., 2004--Hannover.

Diss. Naturwiss. Bern, 1993 (kein Austausch). / Literaturverz.

Regensburg, Univ., Diss., 2009.

Freiburg (Breisgau), University, Diss., 2003.

Accumulation of lipid droplets (LD) and ceramides (Cer) is associated with the pathogenesis of metabolic dysfunction-associated steatotic liver disease (MASLD) a condition frequently co-occurring with type 2 diabetes and diminished immune functionality. Chronic inflammation and increased disease severity during viral infections characterize obesity-associated immunopathology. Upregulation of neutral sphingomyelinase-2 (NSM2) expression has been implicated in obesity-associated tissue pathology. NSM2 is a neutral sphingomyelinase associated with the inner leaflet of the plasma membrane (PM) where it hydrolyzes sphingomyelin into Cer and phosphocholine. The enzymatic activity of NSM2 therefore affects Cer and its associated protein content and the organization within the distinct PM nanodomains. Furthermore, NSM2 is crucial in the maintenance of cholesterol homeostasis and mitochondrial energy metabolism in T cells, indicating the crosstalk between NSM2-regulated sphingolipids and general lipid homeostasis. However, the molecular mechanisms of the NSM2 communication with sterol and lipid biosynthetic pathways are poorly understood. Especially, the role of sphingolipids, and particularly of NSM2, in modulating the immune cell responses in environments rich in fatty acids (FA) remains unexplored. In parallel to this doctoral study, the lipid droplet residing protein perilipin 3 (PLIN3) was identified within the intracellular nano-environment of NSM2 in Jurkat cells by employing the ascorbate peroxidase APEX2-catalyzed proximity-dependent biotin labeling method. Super-resolution structured illumination microscopy (SIM) performed in this study confirmed the co-localization of NSM2 and PLIN3 within LD organelles which were induced by elevated extracellular concentrations of oleic acid (OA) in Jurkat cells. Moreover, the lipid analysis of the isolated LDs containing enzymatically active NSM2 revealed augmented Cer levels in these lipid storage organelles. Notably, NSM2 enzymatic activity was dispensable for its association with LDs but exerted a negative impact on LD numbers and overall cellular content of the neutral lipids triacylglycerols (TAGs) which are stored within LDs. The most negatively affected was the long-chain unsaturated TAG species. These findings correlated with the significantly reduced activity of enzymes producing diacylglycerol (DAG) and phosphatidic acid (PA) within the TAG biosynthesis pathway in Jurkat cells overexpressing enzymatically active NSM2. Concurrently, NSM2 activity stimulated mitochondrial respiration and FA β-oxidation (FAO) in response to increased OA levels, thereby inducing a shift toward a highly energetic state of the cells. The pharmacological inhibition of endogenous NSM2 activity in primary human CD4+ T cells confirmed the regulatory role of NSM2 in LD accumulation of T cell receptor (TCR) stimulated cells in FA-rich environment. Importantly, NSM2 activity was crucial for the proliferation and survival of activated T cells at high levels of OA in cell culture. Taken together, this study shows a novel intracellular localization of NSM2 within LDs and underscores the role of enzymatically active NSM2 and Cer in lipid storage organelles in shifting the cellular lipid metabolism from storage towards energy producing mitochondrial FAO thereby supporting T cell survival and proliferation in OA-rich environment. / Die Anhäufung von Lipidtröpfchen (LD) und Ceramiden (Cer) steht im Zusammenhang mit der Pathogenese der metabolischen Dysfunktion-assoziierten steatotischen Lebererkrankung (MASLD), einer Erkrankung, die häufig mit Typ-2-Diabetes und einer verminderten Immunfunktion einhergeht. Chronische Entzündungen und eine erhöhte Krankheitsschwere bei Virusinfektionen kennzeichnen die mit Fettleibigkeit verbundene Immunpathologie. Eine Hochregulierung der Expression von neutraler Sphingomyelinase-2 (NSM2) wurde mit der fettleibigkeitsbedingten Gewebepathologie in Verbindung gebracht. NSM2 ist eine neutrale Sphingomyelinase, die mit der inneren Lipidschicht der Plasmamembran (PM) assoziiert ist, wo sie Sphingomyelin in Cer und Phosphocholin hydrolysiert. Die enzymatische Aktivität von NSM2 beeinflusst daher den Gehalt an Cer und den damit verbundenen Proteinen sowie die Organisation innerhalb der verschiedenen Nanodomänen der PM. Darüber hinaus ist NSM2 von entscheidender Bedeutung für die Aufrechterhaltung der Cholesterinhomöostase und des mitochondrialen Energiestoffwechsels in T-Zellen, was auf eine Wechselwirkung zwischen den durch NSM2 regulierten Sphingolipiden und der allgemeinen Lipidhomöostase hinweist. Die molekularen Mechanismen der NSM2-Kommunikation mit den Sterol- und Lipidbiosynthesewegen sind jedoch nur unzureichend bekannt. Vor allem die Rolle der Sphingolipide und insbesondere von NSM2 bei der Modulation der Immunzellreaktionen in fettsäurereichen Umgebungen ist noch unerforscht. Parallel zu dieser Doktorarbeit wurde das Lipidtröpfchen-assoziierte Protein Perilipin 3 (PLIN3) identifiziert. Dafür wurde die Ascorbatperoxidase APEX2 katalysierte Methode der näherungsabhängigen Biotin-Markierung verwendet. Die in dieser Studie durchgeführte superauflösende strukturierte Beleuchtungsmikroskopie (SIM) bestätigte die Ko-Lokalisierung von NSM2 und PLIN3 in LD-Organellen, die durch erhöhte extrazelluläre Konzentrationen von Ölsäure (OA) in Jurkat-Zellen induziert wurden. Darüber hinaus ergab die Lipidanalyse der isolierten LDs, die enzymatisch aktive NSM2 enthielten, einen erhöhten Cer-Gehalt in diesen Lipidspeicherorganellen. Des Weiteren wurde gezeigt, dass die enzymatische Aktivität von NSM2 für die Assoziation mit den LDs entbehrlich war, aber einen negativen Einfluss auf die Anzahl der LDs und den Gesamtgehalt an neutralen Lipiden, den Triacylglycerinen (TAGs), die in den LDs gespeichert werden, hatte. Am stärksten betroffen waren die langkettigen, ungesättigten TAGs. Diese Ergebnisse korrelierten mit der deutlich verringerten Aktivität der Enzyme, die Diacylglycerin (DAG) und Phosphatidsäure (PA) innerhalb des TAG-Biosynthesewegs in Jurkat-Zellen produzieren, die enzymatisch aktives NSM2 überexprimieren. Gleichzeitig stimulierte die NSM2-Aktivität die mitochondriale Atmung und die FA-β-Oxidation (FAO) als Reaktion auf erhöhte OA-Konzentrationen, wodurch eine Verschiebung hin zu einem hohen energetischen Zustand der Zellen induziert wurde. Die pharmakologische Hemmung der endogenen NSM2-Aktivität in primären humanen CD4+ T-Zellen bestätigte die regulierende Rolle von NSM2 bei der LD-Akkumulation von T-Zell-Rezeptor (TCR)-stimulierten Zellen in FA-reicher Umgebung. Darüber hinaus wurde festgestellt, dass die NSM2-Aktivität für die Proliferation und das Überleben aktivierter T-Zellen bei hohen OA-Konzentrationen in der Zellkultur entscheidend war. Insgesamt zeigt diese Studie eine neuartige intrazelluläre Lokalisierung von NSM2 innerhalb von LDs und unterstreicht die Rolle von enzymatisch aktiver NSM2 und Cer in Lipidspeicherorganellen bei der Verlagerung des zellulären Lipidstoffwechsels von der Speicherung hin zu energieproduzierender mitochondrialer FAO, wodurch das Überleben und die Vermehrung von T-Zellen in einer OA-reichen Umgebung unterstützt wird.