Les pathologies cardiovasculaires sont la première cause de mortalité dans le monde. Parmi les mécanismes participant à ces pathologies figurent l'activation de la voie de signalisation minéralocorticoïde. Notre laboratoire a précédemment identifié la Lipocaline 2 (Lcn2) comme cible directe du complexe aldostérone/récepteur minéralocorticoïde (RM) dans le système cardiovasculaire. Lcn2, aussi appelée Neutrophil Gelatinase Associated Lipocalin (NGAL), est une protéine circulante, membre de la famille des lipocalines. Elle est décrite comme participant à l'inflammation ou comme régulant l'activité et la stabilité de la métalloprotéinase matricielle 9. L'objectif de ce travail de thèse est d'étudier l'implication possible de Lcn2 dans les effets pathologiques pro-fibrosants et pro-inflammatoires du complexe aldostérone/RM dans le système cardiovasculaire. Pour ce faire, des souris présentant une inactivation globale et constitutive de Lcn2 (KO Lcn2), ainsi que leurs contrôles, ont été soumises à un traitement mimant une sur-activation de la voie minéralocorticoïde (traitement néphrectomie-aldostérone-sel) durant 4 semaines. Ce travail a mis en évidence le rôle de Lcn2 dans le développement de la fibrose périvasculaire et l'inflammation induite par le complexe aldo/RM ainsi que dans l'augmentation de pression artérielle. En revanche, Lcn2 n'intervient pas dans la fibrose interstitielle ni dans la dysfonction vasculaire. Les mécanismes d'action de la Lipocaline 2 dans ces différents phénomènes pathologiques restent à élucider. En conclusion, les résultats obtenus montrent l’implication directe de Lcn2 dans les effets pro-fibrosants du complexe aldo/RM au niveau cardiovasculaire, suggérant une potentielle cible thérapeutique dans la fibrose cardiovasculaire. / Cardiovascular diseases are the leading cause of death worldwide. Among the mechanisms involved in these pathologies, there is the activation of the mineralocorticoid signaling pathway. Our laboratory has previously identified Lipocalin 2 (Lcn2) as a direct target of the aldosterone/mineralocorticoid receptor (MR) complex in the cardiovascular system. Lcn2, also called Neutrophil Gelatinase Associated Lipocalin (NGAL), is a circulating protein, a member of the lipocalin family. It is described as being involved in inflammation or as regulating the activity and stability of matrix metallopeptidase 9. The aim of this work is to investigate the possible involvement of Lcn2 in pro-fibrotic and pro-inflammatory pathological effects of aldosterone/MR complex in the cardiovascular system. For this purpose, mice with constitutive and overall Lcn2 inactivation (Lcn2 KO) and their littermates were subjected to a treatment mimicking overactivation of the mineralocorticoid pathway (nephrectomy-aldosterone-salt treatment) during 4 weeks. This work has highlighted the role of Lcn2 in the development of perivascular fibrosis and inflammation induced by the complex aldo/MR and in the blood pressure increase. However, Lcn2 is not involved in interstitial fibrosis or vascular dysfunction. The action of Lipocalin 2 in these pathological phenomena mechanisms remains to be elucidated. In conclusion, the results show the direct involvement of Lcn2 in the pro-fibrotic effects of aldo/MR complex in the cardiovascular system, suggesting a potential therapeutic target in cardiovascular fibrosis.

Le fer, un métal de transition, est requis pour la survie de presque tout les organismes vivant à cause de son habilité à accepter ou donner un électron et donc à catalyser plusieurs réactions biochimique fondamentales. Cependant, la même propriété permet aussi au fer ionique d’accélérer la formation de radicaux libres et donc le fer peut potentiellement avoir des effets néfastes. Conséquemment, l’homéostasie du fer doit être étroitement régulé, tant au niveau cellulaire que systémique. Notre étude met l’emphase sur deux molécules importante pour régulation du métabolisme du fer : la lipocaline 2 (Lcn2) et l’hepcidine. Lcn2, une protéine de phase aiguë, est impliquée dans le transport du fer par les sidérophores. Lcn2 est un candidat potentiel comme transporteur du fer qui pourrait être responsable de l’accumulation excessive du fer non lié à la transferrine dans le foie des patients atteints d’hémochromatose héréditaire (HH). Nous avons généré des souris double-déficiente HfeLcn2 pour évaluer l’importance de Lcn2 dans la pathogenèse de surcharge en fer hépatique dans les souris knock-out Hfe (Hfe -/-). Notre étude révèle que la délétion de Lcn2 dans les souris Hfe-/- n’influence pas leur accumulation de fer hépatique ou leur réponse à une surcharge en fer. Le phénotype des souries HfeLcn2-/- demeure indiscernable de celui des souris Hfe-/-. Nos données impliquent que Lcn2 n’est pas essentiel pour la livraison du fer aux hépatocytes dans l’HH. L’hepcidine, un régulateur clé du métabolisme du fer, est un petit peptide antimicrobien produit par le foie et qui régule l’absorption intestinale du fer et son recyclage par les macrophages. L’expression de l’hepcidine est induite par la surcharge en fer et l’inflammation, tandis que, à l'inverse, elle est inhibée par l'anémie et l'hypoxie. Dans certaine situations pathologique, l’hepcidine est régulée dans des directions opposées par plus d’un régulateur. Nous avons, en outre, analysé comment les différents facteurs influencent l’expression de l’hepcidine in vivo en utilisant un modèle de souris avec un métabolisme du fer altéré. Nous avons examiné la régulation de l’hepcidine en présence de stimuli opposés, ainsi que la contribution des médiateurs et des voix de signalisation en aval de l’expression de l’hepcidine. Nous avons démontré que l'érythropoïèse, lorsque stimulé par l’érythropoïétine, mais pas par l’hypoxie, diminue l’expression de l’hepcidine d’une façon dépendante de la dose, même en présence de lipopolysaccharides ou de surcharge de fer alimentaire, qui peuvent agir de manière additive. De plus, l’entraînement érythropoïétique inhibe tant la voix inflammatoire que celle de détection du fer, du moins en partie, par la suppression du signal IL-6/STAT3 et BMP/SMAD4 in vivo. Au total, nos données suggèrent que le niveau d’expression de l’hepcidine en présence de signaux opposés est déterminé par la force du stimulus individuel plutôt que par une hiérarchie absolue. Ces découvertes sont pertinentes pour le traitement de l’anémie des maladies chronique et les désordres de surcharge en fer. / Iron, a transition metal, is required for survival by almost all living organisms due to its ability to accept or donate electrons and thus to catalyze many fundamental biochemical reactions. However, the same properties also allow ionic iron to accelerate the formation of free radicals and as such iron has the potential for deleterious effects. Consequently, iron homeostasis must be tightly regulated at both cellular and systemic levels. Our studies focused on two important molecules in the regulation of iron metabolism, namely, lipocalin 2 (Lcn2) and hepcidin. Lcn2, an acute phase protein, is involved in iron trafficking via siderophores. Lcn2 has emerged as a candidate iron-transporter that may be responsible for excessive non-transferrin-bound iron (NTBI) accumulation in the liver of hereditary hemochromatosis (HH) patients. We generated HfeLcn2 double-deficient mice to evaluate the importance of Lcn2 in the pathogenesis of hepatic iron loading in Hfe knockout mice. Our studies revealed that deletion of Lcn2 in Hfe-knockout mice does not influence hepatic iron accumulation in Hfe-/- mice, or their response to iron loading, as the phenotype of HfeLcn2-/- mice remained indistinguishable from that of Hfe-/- mice. Our data imply that Lcn2 is not essential for iron delivery to hepatocytes in HH. Hepcidin, a key regulator of iron metabolism, is a small antimicrobial peptide produced by the liver that regulates intestinal iron absorption and iron recycling by macrophages. Hepcidin expression is induced by iron-loading and inflammation while, conversely, being inhibited by anemia and hypoxia. Under certain pathologic situations, hepcidin is regulated in opposite directions by more than one regulator. We further investigated how different factors influence hepcidin expression in vivo using mouse models of altered iron metabolism. We examined hepcidin regulation in the presence of opposing stimuli as well as the contributions of mediators and downstream signaling pathways of hepcidin expression. We show that erythropoiesis drive, when stimulated by erythropoietin but not by hypoxia, down-regulates hepcidin in a dose-dependent manner, even in the presence of lipopolysaccharide or dietary iron-loading, which may act additively. Moreover, erythropoietic drive inhibited both the inflammatory and iron-sensing pathways, at least in part, via the suppression of IL-6/STAT3 and BMP/SMAD4 signaling in vivo. Altogether, our data suggest that hepcidin expression levels in the presence of opposing signaling are determined by the strength of the individual stimuli rather than by an absolute hierarchy. These findings are pertinent for the treatment of the anemia of chronic disease and iron-loading disorders.

Les maladies rénales chroniques sont devenues un enjeu majeur de santé publique. Qu’elle qu’en soit la cause initiale, la MRC est caractérisée par une réduction néphronique progressive, aboutissant au remplacement des néphrons sains par un tissu fibreux et au déclin de la fonction rénale. Les mécanismes de progression de la MRC sont encore mal compris, mais il a été suggéré que le développement des lésions tubulo-interstitielles joue un rôle essentiel dans le déclin de la fonction rénale. Deux éléments physiopathologiques cruciaux dans le développement de ces lésions sont représentés par (i) l’activation de la voie du récepteur à l’EGF (epidermal growth factor) (EGFR), et (ii) la protéinurie et ses conséquences pour les cellules tubulaires. Les médiateurs communs à ces deux phénomènes ne sont pas connus. Mon travail de thèse a consisté à caractériser une protéine commune à ces deux voies d’activation, ie la lipocaline2 (Lcn2), petite protéine de transport de fer, en étudiant ses voies d'activation et ses conséquences physiopathologiques. Nous montrons que le rôle pathologique de la voie de l’EGFR est gouverné par la surexpression de Lcn2. En effet, dans le contexte de réduction néphronique chirurgicale, (i) les animaux invalidés pour Lcn2 sont protégés du développement des lésions, et (ii) les souris exprimant un dominant négatif de l’EGFR dans le tubule rénal présentent une diminution de l’expression de Lcn2. Nous montrons également que l’invalidation de Lcn2 permet de ralentir la progression de la MRC dans un modèle de polykystose rénale dépendante de l’EGFR, les souris jck (juvenile cystic kidney). Parallèlement, nous montrons que la protéinurie induit également l’expression de Lcn2 dans les cellules tubulaires rénales dans différents modèles expérimentaux. De plus, nous montrons le rôle majeur de Lcn2 dans la progression de la MRC protéinurique, l’invalidation de Lcn2 limitant le développement des lésions rénales et la mortalité des animaux protéinuriques. Si le rôle délétère de Lcn2 est démontré dans différents modèles de néphropathie chronique, nous montrons que les voies moléculaires impliquées dans l’activation de Lcn2 et le rôle de cette protéine dépendent du contexte cellulaire. Nous prouvons que Lcn2 est un médiateur de l'effet mitogénique de l'EGFR, phénomène essentiel de la progression de la MRC, et nous montrons que l’activation de Lcn2 via l’EGFR est dépendante du facteur HIF1α. Cependant, nous démontrons également que l'expression de Lcn2 dans le contexte de protéinurie est dépendante du facteur ATF4 activé par le stress du reticulum endoplasmique (ER), et que Lcn2 est un médiateur de l'apoptose dépendante du stress de l'ER. Enfin, nous prouvons que l’inhibition pharmacologique du stress de l'ER permet une réduction de l’expression de Lcn2 dans les cellules tubulaires, et surtout, un ralentissement du déclin de la fonction rénale des animaux protéinuriques. Nous démontrons également l’importance de ces résultats chez les patients atteints de MRC. Nous identifions NGAL, l'analogue humain de Lcn2, comme un biomarqueur de progression dans la polykystose rénale dominante, et nous montrons qu’elle est fortement surexprimée dans le tissu rénal de patients protéinuriques. L’ensemble de ce travail permet de montrer que Lcn2 est un nouveau médiateur essentiel de multiples néphropathies chroniques. Lcn2 est impliquée dans l’effet mitogénique de l’EGFR ou la réponse apoptotique associée à la protéinurie durant la MRC. Nous ouvrons également de nouvelles perspectives thérapeutiques avec l'utilisation d'inhibiteurs du stress de l'ER dans les néphropathies protéinuriques humaines / Chronic kidney disease (CKD) is now a major public health concern. Whatever the initial kidney injury, CKD is characterized by progressive nephron reduction and kidney function decline. Tubulointerstitial lesions are an essential component of CKD progression, and are mediated by two crucial pathophysiologic elements: epidermal growth factor receptor (EGFR) activation, and proteinuria responsible of tubular cell damage. The aim of this study was to describe a common mediator of both these pathways, ie lipocalin2, an iron carrier protein, by identifying its activation pathways and its pathophysiologic consequences. We show the deleterious effects of the EGFR pathway during nephron reduction is mediated by the activation of Lcn2, which controls the mitogenic effect of EGFR. In fact, after nephron reduction, animals invalidated for Lcn2 are protected from lesions developpement. Moreover, a similar protective effect is seen in jck (juvenile cytic kidney) mice invalidated for Lcn2, a model of polycystic kidney disease EGFR-dependant. Otherwise, we show proteinuria induces Lcn2 expression in tubular cells of different experimental models, and Lcn2 invalidation slows lesion developpement and reduces mortality of proteinuric mice. We demonstrate that the Lcn2 role and activation pathways are dependant of these different models. We show Lcn2 is a mediator of the mitogenic effect of the EGFR, and Lcn2 activation is dependant of HIF1α stabilisation. However, we also show ATF4 is an activator of Lcn2 during endoplasmic reticulum (ER) stress induced by proteinuria in tubular cells. In this context, Lcn2 controls ER stress-induced apoptosis. Pharmacologic inhibition of ER stress in proteinuric animals decreases Lcn2 overexpression, and slows renal function decline. In patients suffering from CKD, we demonstrated NGAL (neutrophil gelatinase-associated lipocalin), the human analog of Lcn2, appears as a critical biomarker of autosomal dominant polycystic kidney disease progression. NGAL is also highly overexpressed in tubular cells in kidney biopsies of proteinuric patients. This work demonstrates Lcn2 is an essential mediator of multiple pathophysiologic components of CKD progression. Moreover, we open new therapeutic perspectives with the use ER stress modulators in proteinuric CKD