L’endocytose dépendante de la clathrine (EDC) est la principale voie d’internalisation des récepteurs de surface et de leurs ligands. L’internalisation se fait suite à l’invagination de la membrane plasmique vers l’intérieur de la cellule suite à la formation, dans un premier temps, de puits recouverts de clathrine (PRCs) qui bourgeonnent ensuite en vésicules recouvertes de clathrine dans le cytosol. L’EDC est un processus très dynamique qui a lieu en l’espace de 30 sec-1mn. Elle est impliquée dans de multiples fonctions et permet ainsi à la cellule de réguler l’expression de ses protéines en surface, de répondre aux signaux de prolifération ou migration envoyés par l’environnement immédiat via l’activation de voies de signalisation spécifiques ou encore de réguler le renouvellement des composants de la membrane plasmique. De par son importance, des dérégulations de l’endocytose dépendante de la clathrine ont déjà été observées dans les cancers. Ces modifications peuvent impliquer directement l’EDC en modifiant ses composants ou indirectement lors d’altérations de récepteurs régulés par celle-ci. La progression tumorale est elle-même régulée par de multiples facteurs, notamment l’accumulation de mutations qui ont des conséquences sur les cellules cancéreuses elle-même ou bien sur l’environnement immédiat, formant ainsi la « niche tumorale ». Ces changements agissent réciproquement sur la progression tumorale afin de l’amplifier. Lors de la croissance tumorale, les cellules cancéreuses recrutent des fibroblastes qui vont participer au remodelage et à l’augmentation de la rigidité autour de la tumeur. La rigidité de la matrice extracellulaire est détectée par les cellules ce qui envoie des signaux déclencheurs de prolifération et de migration en conséquence. Cette détection passe essentiellement par les intégrines à la surface membranaire qui vont s’agréger et induire des cascades de signalisation impliquées dans ces réponses. Ces intégrines peuvent se regrouper dans deux types de structures, les adhésions focales et les structures recouvertes de clathrine. En ce qui concerne ces dernières, il a été démontré précédemment que la rigidité du substrat augmente sa force d’interaction avec les intégrines, et empêche ainsi l’internalisation des vésicules recouvertes de clathrine, on parle alors d’ « endocytose frustrée ». Cette rétention des structures recouvertes de clathrine à la surface provoque une signalisation soutenue à la surface au lieu de l’arrêter par dégradation ultérieure des récepteurs dans les lysosomes. Le laboratoire a démontré que les structures de clathrine frustrées capturent ainsi différent récepteurs conduisant à une signalisation accrue dans la voie de la MAP Kinase Erk. Mon projet de thèse repose sur ces observations en s’intéressant plus particulièrement au rôle d’une autre modification induite par la croissance tumorale, le confinement. En effet, en se multipliant de manière incontrôlée dans un environnement spatialement restreint, les cellules tumorales se retrouvent soumises à des forces de compression. Les résultats mis en évidence au cours de ma thèse ont montré que le confinement provoque, comme la rigidité, une frustration des structures de clathrine qui ne sont donc plus capables de soutenir l’endocytose des récepteurs. De plus, la compression cellulaire induit le clivage d’un pro-ligand de l’EGFR, le HB-EGF, ce qui conduit à l’activation paracrine de l’EGFR et à l’activation de la voie Erk. En effet, l’absence de facteurs de croissance dans le milieu ainsi que l’inhibition de ce clivage démontrent la nécessité de la mise en place de ce mécanisme. En résumé, le confinement induit le clivage du pro-ligand HB-EGF, qui à son tour va activer le récepteur à l’EGF. En parallèle, l’endocytose est ralentie et provoque une signalisation accrue à la membrane. Ces deux évènements coopèrent pour mener à une très forte activation de la voie Erk. / Clathrin-mediated endocytosis (CME) is the major route of endocytosis for many cargos in eukaryotic cells. Endocytosis takes place at clathrin-coated pits (CCPs), small assemblies of clathrin and clathrin adaptors randomly distributed at the plasma membrane. Clathrin polymerization induces the progressive bending of the plasma membrane resulting in the formation of a vesicle budding off into the cytosol. CME is a highly dynamic process with an average lifetime of CCPs in the order of 30 seconds. In this manner, CME fulfills a range of different functions and enables cells to regulate the surface expression of proteins, to sample the cell’s environment for growth and guidance cues, to control the activation of signaling pathways and to turn over membrane components by sending these components for degradation in the endo-lysosomal pathway. A deregulation of the endocytic pathways was previously shown to be involve in cancer. These modifications can affect CME directly by modifying its actors, or indirectly with mutations on receptors or cargoes undertaken by CME. Tumor progression is dependent of several factors, the first one involving the accumulation of mutations which results in modifications in the cells themselves or on their surrounding environment by changing its biochemical and physical properties, leading to the formation of the tumor niche. These changes reciprocally foster cancer progression. During tumor growth, fibroblasts will be recruited around tumor cells, leading to the remodeling of the microenvironment and to an increase of rigidity nearby the tumor. This stiffness is sensed by the cells and send signals for proliferation and migration as a result. Stiffness sensing engages mainly integrins at the cell surface which will aggregate and initiate signaling cascades accountable for these responses. Integrins are capable of clustering into two types of structures: focal adhesions and clathrin-coated structures (CCSs). Regarding CCSs, it was shown previously that high stiffness strengthen the interaction between integrins and the substrate, hence preventing the budding off of the vesicle, and this is referred to as “frustrated endocytosis”. This holding of CCSs at the cell surface promotes a sustained signaling at the plasma membrane instead of a signal termination after internalization and further degradation in lysosomes. My PhD project relied on these previous findings, with a particular focus on another mechanical alteration observed in tumors, the confinement. Indeed, during the uncontrolled proliferation of cancer cells in a spatially restricted area, cells become subjected to compressive forces. The results I obtained indicate that confinement leads to frustrated endocytosis and hence to sustained signaling from the plasma membrane. In addition, compression also leads to HB-EGF shedding at the cell surface, and the resulting EGF product activate the EGFR in a paracrine manner, thus leading to the activation of the MAP kinase Erk signaling pathway. Indeed, both the absence of EGFR ligands in the medium and the inhibition of the shedding demonstrate the necessity of this mechanism in EGFR activation. To sum up, confinement induces the shedding of the EGFR pro-ligand HB-EGF necessary to EGFR activation in these conditions. Simultaneously, endocytosis is delayed and frustrated endocytosis leads to sustained signaling at the cell surface. Together, these events cooperate to strongly activate the Erk pathway. These findings highlight the interplay between the physical feature of the tumor environment and signaling pathways known to govern tumor growth.

Thèse numérisée par la Direction des bibliothèques de l'Université de Montréal.

Le développement et l'homéostasie cellulaire de la prostate impliquent le contrôle strict des voies de signalisation induites par les androgènes et les facteurs de croissance. Ces diverses voies sont profondément altérées dans le cancer de la prostate, notamment lors des stades les plus avancés. Dans ce travail, une lignée immortalisée à partir de l'épithélium de prostate humaine, la lignée RWPE-1, a été utilisée pour étudier certains signaux régulant la prolifération cellulaire, ainsi que les connexions entre les voies de signalisation correspondantes. La prolifération des cellules RWPE-1 est sous la dépendance de l'EGF (Epidermal Growth Factor) qui intervient physiologiquement dans le développement épithélial. Les récepteurs apparentés à l'EGF-R sont également impliqués dans la prolifération au cours de la progression tumorale. La prolifération des cellules RWPE-1 en réponse à l'EGF est strictement dépendante de la voie ERK1/2, qui est donc considérée comme un point d'intégration des signaux. L'utilisation d'inhibiteurs du récepteur aux androgènes a permis de montrer le rôle essentiel qu'il joue dans l'activation d'ERK1/2 en réponse à l'EGF. Le récepteur aux androgènes s'associe avec plusieurs molécules de signalisation dans les cellules RWPE-1. Je démontre ici pour la première fois une association entre le récepteur aux androgènes et la kinase Raf-1, activatrice de la voie ERK1/2. Ainsi, le récepteur aux androgènes contrôlerait directement un processus essentiel à la prolifération épithéliale selon un mode d'action non-génomique. Par ailleurs, j'ai montré que la réponse proliférative des cellules RWPE-1 à l'IL-6 requiert l'activation de la voie ERK1/2, et l'activité kinase de l'EGF-R, suggérant la transactivation de ce récepteur par l'IL-6. L'utilisation de divers inhibiteurs chimiques a permis de démontrer que les métalloprotéases de la famille ADAM (a disintegrin and metalloprotease), notamment ADAM17, sont impliquées dans ce processus. Ainsi, l'activation de protéines ADAM par l'IL-6 conduirait au clivage d'un ligand membranaire de l'EGF-R, aboutissant à l'activation de la voie ERK1/2. Ce nouveau mécanisme pourrait être impliqué dans les situations inflammatoires conduisant à une prolifération excessive de l'épithélium prostatique, prélude à la transformation tumorale. En conclusion, les voies de signalisation étudiées sont fortement connectées dans les cellules épithéliales normales. Les deux nouveaux mécanismes décrits ici aboutissent à l'activation des kinases ERK1/2, point d'intégration et de convergence des voies de signalisation dans les cellules épithéliales de prostate normale.

Le virus de l'hépatite C (HCV) est une cause majeure de maladie chronique du foie et de carcinome hépatocellulaire. Les options thérapeutiques pour traiter l'hépatite chronique sont limitées par des coûts élevés, des effets secondaires et une résistance virale. L'entrée du HCV est la première étape d'interaction entre le virus et la cellule hôte. Elle est requise pour l'initiation, la propagation et le maintien de l'infection, ce qui en fait une cible prometteuse pour les traitements antiviraux. L'entrée du HCV nécessite l'interaction coopérative de plusieurs facteurs cellulaires, y compris CD81 et claudine-1 (CLDN1). Nous avons récemment identifié un rôle pour le récepteur à l'EGF (EGFR) et le récepteur à l'ephrine A2 (EphA2) dans l'entrée du HCV par la régulation de la formation du complexe de co-récepteurs CD81-CLDN1, ce qui suggère que la signalisation de ces récepteurs joue un rôle dans l'entrée du virus. Nous avons voulu identifier les mécanismes moléculaires de signalisation de l'EGFR requis pour l'entrée du HCV et avons identifié HRas comme un transducteur de signalisation clé de l'hôte. Des études d'imagerie ont révélées que la signalisation de HRas peut moduler la diffusion et le trafic membranaire de CD81, ce qui permet l'assemblage du complexe de récepteurs. De plus, HRas s'associe avec les récepteurs de l'hôte CD81 et CLDN1 et des facteurs d'entrée du HCV inconnus jusque là: l'intégrine beta1 et Rap2B. Le HCV profite donc de la signalisation de HRas pour l'entrée cellulaire. Ces données améliorent notre compréhension des mécanismes moléculaires de l'entrée du HCV induite par l'EGFR et ouvrent de nouvelles perspectives pour le développement d'antiviraux.

Le virus de l'hépatite C (HCV) est une cause majeure de maladie chronique du foie et de carcinome hépatocellulaire. Les options thérapeutiques pour traiter l'hépatite chronique sont limitées par des coûts élevés, des effets secondaires et une résistance virale. L'entrée du HCV est la première étape d'interaction entre le virus et la cellule hôte. Elle est requise pour l'initiation, la propagation et le maintien de l'infection, ce qui en fait une cible prometteuse pour les traitements antiviraux. L’entrée du HCV nécessite l'interaction coopérative de plusieurs facteurs cellulaires, y compris CD81 et claudine-1 (CLDN1). Nous avons récemment identifié un rôle pour le récepteur à l’EGF (EGFR) et le récepteur à l’ephrine A2 (EphA2) dans l'entrée du HCV par la régulation de la formation du complexe de co-récepteurs CD81-CLDN1, ce qui suggère que la signalisation de ces récepteurs joue un rôle dans l'entrée du virus. Nous avons voulu identifier les mécanismes moléculaires de signalisation de l’EGFR requis pour l'entrée du HCV et avons identifié HRas comme un transducteur de signalisation clé de l'hôte. Des études d'imagerie ont révélées que la signalisation de HRas peut moduler la diffusion et le trafic membranaire de CD81, ce qui permet l’assemblage du complexe de récepteurs. De plus, HRas s’associe avec les récepteurs de l'hôte CD81 et CLDN1 et des facteurs d’entrée du HCV inconnus jusque là: l’intégrine beta1 et Rap2B. Le HCV profite donc de la signalisation de HRas pour l'entrée cellulaire. Ces données améliorent notre compréhension des mécanismes moléculaires de l'entrée du HCV induite par l’EGFR et ouvrent de nouvelles perspectives pour le développement d'antiviraux. / Hepatitis C virus (HCV) is a major cause of chronic liver disease and hepatocellular carcinoma worldwide. Therapeutic options to treat chronic viral hepatitis are limited by high costs, side effects and viral resistance in most patients. HCV entry is the first step of interaction between the virus and the host cell. It is required for the initiation, propagation and maintenance of infection, making it a promising target for antiviral therapy. HCV entry requires the cooperative interaction of several cellular factors, including CD81 and claudin-1 (CLDN1). We have recently identified a role for EGF receptor (EGFR) and ephrin receptor A2 (EphA2) in HCV entry by regulating the formation of the co-receptor complex CD81-CLDN1, suggesting that the signaling of these receptors might play a role in viral entry. However, the precise mechanisms of regulation are unknown. We wanted to identify the molecular mechanisms of EGFR signaling required for the HCV entry process. We identify HRas as key host signaling transducer for HCV entry. Advanced imaging studies have revealed that HRas signaling can modulate the lateral diffusion and membrane trafficking of CD81. A modified diffusion of CD81 allows the assembly of the receptors complex. In addition, HRas associates with tetraspanin microdomains containing the host receptors CD81 and CLDN1 and HCV entry factors previously unknown: the integrin beta1 and Rap2B. HCV therefore exploits HRas signaling for cellular entry. These data improve our understanding of the molecular mechanisms of HCV entry induced by EGFR and open new perspectives for the development of antivirals targeting signaling pathways.

Les maladies rénales chroniques sont devenues un enjeu majeur de santé publique. Qu’elle qu’en soit la cause initiale, la MRC est caractérisée par une réduction néphronique progressive, aboutissant au remplacement des néphrons sains par un tissu fibreux et au déclin de la fonction rénale. Les mécanismes de progression de la MRC sont encore mal compris, mais il a été suggéré que le développement des lésions tubulo-interstitielles joue un rôle essentiel dans le déclin de la fonction rénale. Deux éléments physiopathologiques cruciaux dans le développement de ces lésions sont représentés par (i) l’activation de la voie du récepteur à l’EGF (epidermal growth factor) (EGFR), et (ii) la protéinurie et ses conséquences pour les cellules tubulaires. Les médiateurs communs à ces deux phénomènes ne sont pas connus. Mon travail de thèse a consisté à caractériser une protéine commune à ces deux voies d’activation, ie la lipocaline2 (Lcn2), petite protéine de transport de fer, en étudiant ses voies d'activation et ses conséquences physiopathologiques. Nous montrons que le rôle pathologique de la voie de l’EGFR est gouverné par la surexpression de Lcn2. En effet, dans le contexte de réduction néphronique chirurgicale, (i) les animaux invalidés pour Lcn2 sont protégés du développement des lésions, et (ii) les souris exprimant un dominant négatif de l’EGFR dans le tubule rénal présentent une diminution de l’expression de Lcn2. Nous montrons également que l’invalidation de Lcn2 permet de ralentir la progression de la MRC dans un modèle de polykystose rénale dépendante de l’EGFR, les souris jck (juvenile cystic kidney). Parallèlement, nous montrons que la protéinurie induit également l’expression de Lcn2 dans les cellules tubulaires rénales dans différents modèles expérimentaux. De plus, nous montrons le rôle majeur de Lcn2 dans la progression de la MRC protéinurique, l’invalidation de Lcn2 limitant le développement des lésions rénales et la mortalité des animaux protéinuriques. Si le rôle délétère de Lcn2 est démontré dans différents modèles de néphropathie chronique, nous montrons que les voies moléculaires impliquées dans l’activation de Lcn2 et le rôle de cette protéine dépendent du contexte cellulaire. Nous prouvons que Lcn2 est un médiateur de l'effet mitogénique de l'EGFR, phénomène essentiel de la progression de la MRC, et nous montrons que l’activation de Lcn2 via l’EGFR est dépendante du facteur HIF1α. Cependant, nous démontrons également que l'expression de Lcn2 dans le contexte de protéinurie est dépendante du facteur ATF4 activé par le stress du reticulum endoplasmique (ER), et que Lcn2 est un médiateur de l'apoptose dépendante du stress de l'ER. Enfin, nous prouvons que l’inhibition pharmacologique du stress de l'ER permet une réduction de l’expression de Lcn2 dans les cellules tubulaires, et surtout, un ralentissement du déclin de la fonction rénale des animaux protéinuriques. Nous démontrons également l’importance de ces résultats chez les patients atteints de MRC. Nous identifions NGAL, l'analogue humain de Lcn2, comme un biomarqueur de progression dans la polykystose rénale dominante, et nous montrons qu’elle est fortement surexprimée dans le tissu rénal de patients protéinuriques. L’ensemble de ce travail permet de montrer que Lcn2 est un nouveau médiateur essentiel de multiples néphropathies chroniques. Lcn2 est impliquée dans l’effet mitogénique de l’EGFR ou la réponse apoptotique associée à la protéinurie durant la MRC. Nous ouvrons également de nouvelles perspectives thérapeutiques avec l'utilisation d'inhibiteurs du stress de l'ER dans les néphropathies protéinuriques humaines / Chronic kidney disease (CKD) is now a major public health concern. Whatever the initial kidney injury, CKD is characterized by progressive nephron reduction and kidney function decline. Tubulointerstitial lesions are an essential component of CKD progression, and are mediated by two crucial pathophysiologic elements: epidermal growth factor receptor (EGFR) activation, and proteinuria responsible of tubular cell damage. The aim of this study was to describe a common mediator of both these pathways, ie lipocalin2, an iron carrier protein, by identifying its activation pathways and its pathophysiologic consequences. We show the deleterious effects of the EGFR pathway during nephron reduction is mediated by the activation of Lcn2, which controls the mitogenic effect of EGFR. In fact, after nephron reduction, animals invalidated for Lcn2 are protected from lesions developpement. Moreover, a similar protective effect is seen in jck (juvenile cytic kidney) mice invalidated for Lcn2, a model of polycystic kidney disease EGFR-dependant. Otherwise, we show proteinuria induces Lcn2 expression in tubular cells of different experimental models, and Lcn2 invalidation slows lesion developpement and reduces mortality of proteinuric mice. We demonstrate that the Lcn2 role and activation pathways are dependant of these different models. We show Lcn2 is a mediator of the mitogenic effect of the EGFR, and Lcn2 activation is dependant of HIF1α stabilisation. However, we also show ATF4 is an activator of Lcn2 during endoplasmic reticulum (ER) stress induced by proteinuria in tubular cells. In this context, Lcn2 controls ER stress-induced apoptosis. Pharmacologic inhibition of ER stress in proteinuric animals decreases Lcn2 overexpression, and slows renal function decline. In patients suffering from CKD, we demonstrated NGAL (neutrophil gelatinase-associated lipocalin), the human analog of Lcn2, appears as a critical biomarker of autosomal dominant polycystic kidney disease progression. NGAL is also highly overexpressed in tubular cells in kidney biopsies of proteinuric patients. This work demonstrates Lcn2 is an essential mediator of multiple pathophysiologic components of CKD progression. Moreover, we open new therapeutic perspectives with the use ER stress modulators in proteinuric CKD