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Cuantificación de Listeria monocytogenes en choritos (Mytilus chilensis) vivos y cocidos congelados para exportación, provenientes de Chiloé, X Región de los Lagos, ChileGonzález Pérez, Pía Loreto January 2011 (has links)
Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Con el propósito de cuantificar la presencia de Listeria monocytogenes en choritos vivos (Mytilus chilensis) y choritos cocidos congelados procesados en una planta procesadora que los comercializan para exportación, se analizaron 40 unidades de muestra de choritos vivos y 40 unidades de muestra de choritos cocidos congelados obtenidas en una planta procesadora ubicada en la Isla Grande de Chiloé, X Región de Chile. La toma de muestras se realizó en ocho oportunidades, entre los meses de Abril y Julio del año 2010. Los planes de muestreos y los criterios microbiológicos se realizaron según el Reglamento Sanitario de Alimentos y el Reglamento Europeo de Criterios Microbiológicos en Productos Alimenticios, debido a que ése es el mercado de destino del producto final.
El total de unidades de muestras analizadas mostraron valores inferiores a 10 ufc/g de L. monocytogenes, lo que las hace aptas para el consumo humano según los estándares establecidos. De lo anteriormente expuesto se evidencia la baja presencia de L. monocytogenes en los choritos vivos y cocidos congelados examinados, lo que puede interpretarse como un bajo riesgo para la población consumidora. Hubo una colonia de Listeria spp. en una unidad de muestra de chorito cocido congelado, obtenida del sexto muestreo. Según los resultados obtenidos de las pruebas bioquímicas de identificación de especies del género Listeria, la colonia corresponde a L. welshimeri, considerada una listeria apatógena.
Las principales conclusiones de este estudio son que los niveles de L. monocytogenes encontrados en choritos vivos y cocidos congelados analizados cumplen con la normativa nacional y la establecida en la Unión Europea para este producto. La detección de una colonia Listeria spp. en alimentos o elementos relacionados con su manufactura puede indicar la presencia de L. monocytogenes, debido a que pueden coexistir bajo las mismas condiciones. A pesar de los pocos casos documentados de infecciones humanas por otras especies del género Listeria, éstos podrían ser resultado de una baja patogenicidad para los humanos, o que no se han descubierto aún los mecanismos con los que estas especies apatógenas están provocando casos de listeriosis no notificados o identificados erróneamente debido a la falta de investigación al respecto / Programa Domeyko Alimentos de la Vicerrectoría de Investigación y Desarrollo de la Universidad de Chile 2008- 2010
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Posttranskriptionale Regulation der Internalinexpression und alternative Internalin-unabhängige Aufnahme von Listeria monocytogenes in Animalzellen / Posttranscriptional regulation of the Internalin Expression and Alternative Internalin Independent Uptake of Listeria monocytogenes in Animal CellsFrentzen, Alexa January 2007 (has links) (PDF)
Listeria monocytogenes ist ein weit verbreitetes, Gram-positives humanpatho-genes Bakterium, welches in immunsupprimierten Personen das Krankheitsbild der Listeriose auslösen kann. Der Infektionszyklus der Listerien im Wirt ist im Hinblick auf die Pathogenese dieses Erregers intensiv untersucht worden. Die Regulation der verschiedenen beteiligten Virulenzfaktoren unterliegt in L. monocytogenes einer starken Kontrolle, die einerseits durch regulatorische Proteine aber auch durch Umweltfaktoren beeinflusst wird. Die Mechanismen, die auf transkriptionaler wie auch auf translationaler Ebene die Expression verschiedener listerieller Virulenzgene regulieren, wurden kürzlich näher charakterisiert. Es wurden für verschiedene listerielle Virulenzgene Riboswitch-mechanismen zur Expressionskontrolle in Listerien neu beschrieben. Durch Vorarbeiten wurde auch für das inlAB-Operon ein posttranskriptionaler Regu-lationsmechanismus postuliert. Dabei wurde der anaerobe Stoffwechsel der Listerien als möglicher Auslöser für die beobachtete Translationssteigerung des inlA- und inlB-Gens diskutiert. Innerhalb der vorliegenden Arbeit sollte nun weitergehend untersucht werden, in welchem Bereich der Sequenz des inlAB-Operons sich regulatorische Strukturen zur posttranskriptionalen Regulation unter anaeroben Wachstumsbedingungen befinden. Dazu wurden verschiedene Mutanten mit unterschiedlichen Deletionen im inlAB-Operon konstruiert und die Transkription und Translation sowohl des inlA-, als auch des inlB-Gens betrachtet. Eine Deletion im aroA-Gen bewirkt das Wachstum der Bakterien bei anaerobem Stoffwechsel. Diese Deletion wurde in die konstruierten Stämme eingefügt, um die Expression der Gene unter den verschiedenen Wachstumsbedingungen vergleichen zu können. Außerdem wurden verschiedene gus-Reportergen-Fusionsmutanten und Promotor-austauschmutanten konstruiert, um quantitativ aussagekräftigere Daten zu erheben. Die Charakterisierung der Mutanten ließ erkennen, dass keiner der deletierten Bereiche des inlAB-Operons von L. monocytogenes für die beobachtete Translationssteigerung im inlA-Gen bei anaerobem Stoffwechsel verantwortlich zu sein scheint. Das inlB-Gen war innerhalb der hier gezeigten Experimente nicht posttranskriptional reguliert, wie im Vorfeld postuliert. Nach plasmidkodierter Expression verschiedener Bereiche des inlAB-Operons konnte, verglichen mit genomischer Expression, keine Veränderung in der inlA-Expression beobachtet werden. Die mögliche Beteiligung eines potentiellen Regulatorproteins konnte innerhalb dieser Arbeit daher nicht näher eingegrenzt werden. Auch ein Einfluss der regulatorischen Faktoren Hfq und CcpA auf die Expression des InlA Proteins in der L. monocytogenes ΔaroA-Mutante konnte nicht gefunden werden. Es zeigte sich interessanterweise außerdem, dass weitere Virulenzgene wie actA und hly unter den anaeroben Bedingungen ebenfalls eine Translations-steigerung zeigten. Somit stellt sich abschließend die Frage, ob es sich bei der beobachteten Translationssteigerung des inlA-Gens wirklich um einen durch bestimmte Strukturen in der inlAB-mRNA ausgelösten Mechanismus handelt. L. monocytogenes ist als intrazellulär replizierendes, Gram-positives Bakterium interessant für den Einsatz in immun- und tumortherapeutischen Anwendungen. Attenuierte L. monocytogenes-Stämme wurden dazu bereits erfolgreich im Mausmodell als Trägerbakterien für Impfstoffstrategien eingesetzt. Die gezielte Infektion von Geweben ist jedoch aufgrund des wenig ausgeprägten Zelltropismus der Listerien im Wirt bisher ein Problem für einen Einsatz in bakterienbasierten Anwendungen, wie z.B. der Tumor- oder Gentherapie. Innerhalb dieser Arbeit wurden L. monocytogenes-Stämme konstruiert, bei denen chromosomal das für die Integrase codierende Gen gegen das Gen für das Staphylokokken Protein A (SPA) unter der Kontrolle listerieller Promotoren ausgetauscht wurde. Die erfolgreiche Oberflächenlokalisation von Protein A in der Zellwand von Listerien konnte im Western Blot oder in funktionellen Immunfluoreszenzfärbungen in Mikroskop- und FACS-Analysen nachgewiesen werden. Diese Stämme sollen im Cell Targeting zur gezielten Infektion von Geweben eingesetzt werden. Dazu konnten die Bakterien über Herceptin®-HER2/neu-vermittelte Adhäsion an SK-BR-3-Zellen erfolgreich in diese aufgenommen werden und innerhalb dieser replizieren. Die neu konstruierten Listeria-Stämme zeigten im Mausmodell keine Veränderung in ihrer Virulenz verglichen mit nicht-SPA-exprimierenden Stämmen. Die in dieser Arbeit vorgestellte Antikörper-Rezeptor-vermittlelte Aufnahme der Listerien in Zellen stellt einen neuen, bisher nicht beschriebenen Mechanismus dar, der in vielen therapeutischen Anwendungen zur Infektion spezifischer Gewebe durch Listerien genutzt werden kann. / Listeria monocytogenes is a widely distributed gram-positive pathogenic bacterium, that causes the disease listeriosis in immunocompromised persons. The infectious cycle of this pathogen has been well investigated concerning the mechanisms of pathogenesis. The regulation of the involved virulence factors underlie strong control mechanisms both by regulatory proteins and environmental conditions. The mechanisms that control the expression of listerial virulence genes on the transcriptional and translational level have recently been characterized more closely. For some of these virulence factors, regulatory posttranscriptional riboswitch control mechanisms have recently been newly described in Listeria. In studies prior to this work, a posttranscriptional regulation mechanism has been postulated for the inlAB-Operon, also. As a trigger for the enhanced translation of the inlA and inlB gene the anaerobic metabolism of Listeria has been discussed. In the here presented work, it should be further investigated which part of the inlAB operon comprises regulatory structures for the posttranscriptional regulation at anaerobic growth conditions. To this purpose, different mutants with varying deletions in the inlAB operon have been constructed and transcription and translation of both the inlA and inlB genes observed. A deletion in the aroA gene provokes growth of the bacteria at anaerobic metabolism. This deletion was introduced in the newly constructed strains to be able to compare the different growth conditions. Additionally, gus-reportergene fusion as well as promoter exchange mutants were constructed to be able to raise quantitatively significant data. The characterization of the deletion mutants showed that none of the introduced deletions in the inlAB operon seems to be responsible for the enhanced expression of inlA in anaerobically growing Listeriae. In the here presented experiments, the inlB-gene was not found to be posttranscriptionally regulated, in accordance with a previous report. The plasmid encoded expression of different parts of the inlAB operon did not lead to an alteration in the inlA expression compared to genomically encoded inlA. The possible interaction of a potential regulator protein could thus not be further elucidated. Also, the engagement of the regulators like Hfq or CcpA could not be found. Interestingly, also the virulence genes actA and hly showed an enhanced translational efficiency under the given conditions. Thus, in the herein presented work, the question is raised, whether the observed translation enhancement of the inlA gene is really due to regulatory structures within the inlAB-mRNA. As an intracellularly replicating, Gram positive bacterium, L. monocytogenes is a very interesting means to be used in immuno- or tumortherapeutic applications. Attenuated L. monocytogenes strains have already been successfully applied as carrier strains in vaccine strategies in the mouse model. Due to the distinct cell tropism of Listeriae in the host, the targeted infection of tissue has so far been a problem regarding the use in bacteria-based applications like tumor or gene therapy. In this work, L. monocytogenes strains have been constructed, that contain the chromosomal integrase gene exchanged for the staphylococcal Protein A (SPA) gene under the control of different listerial promoters. The successful translocation and anchoring of SPA in the cell wall was confirmed by either western blot or functionally by immunofluorescence staining using microscopic and FACS analysis. These strains should be used to specifically infect tissues via cell targeting. Through Herceptin®-HER2/neu-mediated adhesion to SK-BR-3 cells the bacteria could be successfully taken up and replicate in these cells. The newly constructed Listeria strains did not show any alteration in virulence in the mouse model when compared to non-SPA-expressing strains. The herein presented antibody-receptor-mediated uptake of the Listeriae in cells demonstrates a new, so far not described mechanism, that can be used in many therapeutic applications involving the infection of specific tissues by Listerae.
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Einfluss des Kohlenstoff-Metabolismus auf die Aktivität des Virulenzfaktors PrfA von Listeria monocytogenes / Effect of the carbon metabolism on the PrfA activity in Listeria monocytogenesMertins, Sonja January 2008 (has links) (PDF)
Listeria monocytogenes gehört zu den Gram-positiven fakultativ intrazellulären Bakterien, ist aber auch zu einem saprophytischen Leben in freier Natur fähig. Zahlreiche, umfassend charakterisierte Virulenzfaktoren sind für die verschiedenen Schritte im Infektionszyklus von L. monocytogenes erforderlich: InlA und InlB induzieren die Aufnahme von L. monocytogenes in nicht-phagozytische Zellen, LLO und PlcA sind für die Freisetzung aus dem primären Phagosom, ActA für die Zell-zu-Zell-Ausbreitung und LLO zusammen mit PlcA und vor allem PlcB für die Freisetzung der Listerien aus dem sekundären Phagosom erforderlich. Der Hexose-Phosphat-Transporter UhpT ist teilweise für die Vermehrung von L. monocytogenes im Zytosol der infizierten Wirtszelle verantwortlich. Die Gene, die für diese Virulenzfaktoren kodieren, sind größtenteils in dem 9,6 kb-großen Virulenzgencluster LIPI-1 zusammengefasst oder liegen verteilt auf dem Chromosom. Alle diese Virulenzgene werden durch den positiven Regulationsfaktor PrfA (PrfA = positive regulatory factor A) in ihrer Transkription kontrolliert. Das prfA-Gen, kodierend für PrfA, ist benfalls Bestandteil des Virulenzgenclusters (LIPI-1). In bisherigen Studien konnte gezeigt werden, dass die Verwertung der Kohlenstoffquellen Glukose, Mannose und Cellobiose zur Hemmung der PrfA-Aktivität in L. monocytogenes führt. Basierend auf Literaturdaten und eigenen Ergebnissen wurde die Hypothese aufgestellt, dass Komponenten der globalen Kohlenstoff-Katabolitrepression (KKR) oder des PTS (Phosphoenolpyruvat-Phosphotransferase-System)-abhängigen Zuckertransports an der Modulation der PrfA-Aktivität beteiligt sind. Um zu überprüfen, ob über die KKR die Aktivität von PrfA gesteuert wird und dadurch auch die Regulation der PrfA-abhängigen Virulenzgenexpression, wurden in dieser Arbeit pLSV101-Insertionsmutanten für die Gene ccpA (kodierend für CcpA = catabolite control protein A), hprK (kodierend für die HPr-Kinase/Phosphorylase, die HPr am Ser46 phophoryliert) und ptsH (kodierend für das hitzestabile HPr) charakterisiert. Die Insertionsmutanten ::ccpA und ::hprK zeigten sowohl in BHI (undefiniertes nährstoffreiches Medium) als auch in definiertem Minimalmedium (MM) mit 50 mM Glukose ein verlangsamtes Wachstum und eine verringerte [14C]-Glukose-Aufnahme im Vergleich zum Wildtyp (WT). Die ::ptsH-Insertionsmutante war nur zu einem Wachstum in BHI fähig und zeigte erwartungsgemäß (fehlendes HPr) kein Wachstum in definiertem MM mit Glukose als einziger Kohlenstoffquelle. Die ::hprK- und (unter bestimmten Wachstumsbedingungen) auch die ::ptsH–Mutante wiesen sowohl auf Transkriptions- als auch auf Translationsebene eine gesteigerte Expression PrfA-abhängiger Virulenzgene auf. Cellobiose-Verwertung führte auch in der ::hprK-Insertionsmutante zu einer Hemmung der PrfA-Aktivität. Dagegen wurde in der ::ccpA-Insertionsmutante eine geringere Expression aller PrfA-abhängigen Virulenzgene im Vergleich zum WT festgestellt. Die Revertanten RccpA, RhprK und RptsH wiesen im Wachstumsverhalten und in der PrfA-abhängigen Virulenzgenexpression wieder einen wildtypischen Phänotyp auf. Trotz der etwas gesteigerten Virulenzgenexpression zeigte die ::ptsH-Mutante eine deutlich verringerte Replikationsrate in J744 Makrophagen gegenüber dem WT. Die Transkriptomprofile der ::ccpA- und ::hprK-Insertionsmutanten zeigten im Vergleich zum WT viele hochregulierte Gene. Diese umfassen Gene, die v.a. für den PTS-abhängigen Zuckertransport, ABC-Transporter und Enzyme des C- und N-Metabolismus kodieren und im WT wahrscheinlich unter den gegebenen Wachstumsbedingungen unter KKR-Kontrolle stehen. Die erhöhte PrfA-abhängige Virulenzgenexpression in der ::hprK-Mutante korreliert mit der Herunterregulation einiger Gene, die in ihrer Transkription durch einen aktiven PTSvermittelten Glukose-Transport kontrolliert werden. Die gesteigerte PrfA-Aktivität und die Abwesenheit von HPr-Ser46~P (neben CcpA eine wichtige Komponente der KKR) in den ::hprK- und ::ptsH-Insertionsmutanten führten zu der Annahme, dass eine Korrelation zwischen der Menge an HPr-Ser46~P und der PrfA-Aktivität bestehen könnte. Die Untersuchung der PrfA-Aktivität und parallel dazu die Mengenbestimmung von HPr-Ser46~P in MM mit Glukose, Cellobiose und Glyzerin zeigte jedoch, dass weder HPr-Ser46~P noch HPr-His15~P direkte Modulatoren der PrfA-Aktivität sind. Eine direkte Interaktion zwischen HPr-Ser46~P und PrfA konnte mittels Biacor-Analyse ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Auch in vitro Transkriptions-Studien zeigten keinen inhibitorischen Effekt von HPr-Ser46~P auf die Initiation der Transkription bei PrfA-abhängigen Promotoren (S. Müller-Altrock, persönliche Mitteilung). Interessanterweise war bei einem aktiven Glukose-Transport, bei Bedingungen also, wo die EIIA-Komponenten aller aktiven Glukose-spezifischen PTS im unphosphoryliertem Zustand vorliegen (EIIA-Komponenten übertragen über EIIB das aktive Phosphat auf die über EIIC in die Bakterienzelle transportierte Glukose), die PrfA-Aktivität gering. Erst in der spätlogarithmischen bis stationären Wachstumsphasen, wenn Glukose nur noch in geringem Umfang von der Bakterienzelle aufgenommen wird und die Glukose-spezifischen EIIA-Komponenten in phosphorylierter Form vorliegen, steigt die PrfA-Aktivität. Die Verwertung der PTS-unabhängigen Kohlenstoffquelle Glyzerin zeigte gegenüber den PTS Zuckern Glukose und Cellobiose schon in der frühen Wachstumsphase eine erhöhte PrfA-Aktivität. Demnach scheint sich die Expression spezifischer PTS und der Phosphorylierungszustand von EIIA dieser PTS regulatorisch auf die PrfA-Aktivität auszuwirken. Die Glukose-Aufnahme in L. monocytogenes ist noch nicht vollständig aufgeklärt (R. Stoll, unveröffentlichte Ergebnisse). Doch kann aufgrund des Wachstumsverlustes der ::ptsH-Insertionsmutante in Glukose-haltigem MM davon ausgegangen werden, dass die Glukose-Aufnahme in L. monocytogenes ausschließlich PTS-abhängig erfolgt. Ein Glukose-spezifisches PtsG, das in B. subtilis und anderen Bakterien als wichtiger Glukose-Transporter beschrieben wurde, existiert in L. monocytogenes nicht. Hier konnte nur eine PtsG-spezifische EIIA-Komponente (kodiert von lmo1017) identifiziert werden. Wachstumsuntersuchungen in definiertem MM mit den Kohlenstoffquellen Glukose, Mannose, Cellobiose und Glyzerin ergaben keinen Wachstumsunterschied zwischen der in dieser Komponente defekten ΔeIIAGlc-Mutante und dem WT. Die PrfA-Aktivität dieser Mutante war leicht erhöht, was sich in einer etwas gesteigerten ActA- bzw. PrfA-Expression und einer höheren LLO-Aktivität gegenüber dem WT ausprägte. Es konnte jedoch keine eindeutige Interaktion zwischen dieser gereinigten EIIAGlc-Komponente und dem PrfA-Protein mittels Biacor-Analyse nachgewiesen werden (S. Müller-Altrock und G. Seidel, persönliche Mitteilung). Welche EIIA-Komponenten spezifischer PTS an der Modulation der PrfA-Aktivität beteiligt sind, konnte in dieser Arbeit damit nicht abschließend geklärt werden. Der Transport von phosphorylierten Zuckern, wie Glukose-1-, Glukose-6- oder Mannose-6- Phosphat, erfolgt in L. monocytogenes über den Hexose-Phosphat-Transporter UhpT, der von dem strikt PrfA-abhängig uhpT-Gen kodiert wird. Durch die Zugabe von Amberlite XAD-4 zu LB-Medium oder durch vorherigen Anzucht in Glyzerin-haltigem MM, Bedingungen, die sich stimulierend auf die PrfA-Aktivität auswirken, konnte ein effizientes Wachstum von L. monocytogenes in Glukose-6-Phosphat-haltigem Medium erreicht werden. Obwohl die Kohlenstoff-Verbindungen (Glukose, Cellobiose und Glukose-6-Phosphat) in die Glykolyse eingeschleust werden, führte die Verwertung von Glukose-6-Phosphat zur Aufhebung der KKR. Dies konnte durch vergleichende Gesamtgenom-Transkriptom-Analysen und an der Bestimmung der HPr-Ser46~P Meng gezeigt werden. Die PTS-unabhängige Glukose-6-Phosphat-Aufnahme führt, ähnlich wie die von Glyzerin, zu einer erhöhten Aktivität von PrfA. Neben Glyzerin können auch Dihydroxyaceton (Dha) und Pyruvat (letztere allerdings mit niedriger Wachstumseffizienz), nicht aber Glyzerin-3-Phosphat in vitro als C3-Quellen dienen. Da die ::ptsH-Insertionsmutante kein Wachstum in Glyzerin- oder Dha-haltigem Medium zeigte, lässt sich vermuten, dass die listeriellen Glyzerin-Kinase(n) (GlpK), ähnlich wie die von B. subtilis, durch HPr-His15~P aktiviert werden muss und die Dha-Kinase(n) (DhaK) von L. monocytogenes ebenfalls HPr-His15~P als Kofaktor für die Phosphorylierung von Dha verwendet. Der Glyzerin-Metabolismus in L. monocytogenes wurde vor allem über Gesamtgenom-Transkriptom-Analysen und Real-time RT-PCR Untersuchungen näher charakterisiert. Es konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes mehrere Gene besitzt, die in Glyzerin-haltigem Medium verstärkt exprimiert werden und vermutlich am Glyzerin- bzw. Dha-Metabolismus beteiligt sind. L. monocytogenes besitzt zwei Dha-Kinasen (kodiert von lmo0347-48 und lmo2695-96), die beide eine hohe Homologie zur DhaK aus E. coli besitzen. Eine Deletion beider Dha-Kinasen (ΔdhaK = Δlmo0347-48/lmo2695-96) führte zu einer starken Wachstumshemmung in Glyzerin-haltigem MM und zur weitgehenden Inaktivierung von PrfA. Die ΔdhaK- und die ΔglpD/dhaK-Mutante wiesen in J744 Makrophagen eine verringerte Replikationsrate im Vergleich zum WT auf, was für eine Verwertung von Glyzerin und/oder Dha durch L. monocytogenes im Zytoplasma von Wirtszellen spricht. Da diese Mutanten aber noch –wenn auch mit verringerter Effizienz – in diesem Zellkompartiment der Makrophagen wachsen können, muss L. monocytogenes wohl auch in der Lage sein, weitere Kohlenstoffquellen dieser Wirtszelle verwerten zu können. / Listeria monocytogenes is a Gram-positive facultative intracellular bacterium of mammals naturally inhabiting decayed plant matter in the soil. Several well-characterised virulence factors are necessary for the different steps in the infection cycle of L. monocytogenes: InlA and InlB for active internalization of L. monocytogenes into nonprofessional phagocytic cells, LLO and PlcA for the release of the primary phagosome, ActA for cell-to-cell spreading, LLO together with PlcA and mainly PlcB are responsible for the escape from the secondary phagosome. The hexose-phosphate-transpoter (UhpT) is partially involved in intracellular replication in the cytosol of the host. The genes that encode these virulence factors are clustered mainly in a single 9,6 kb region of the chromosome (LIPI-1) or dispersed elsewhere on the listerial chromosome. The transcriptions of these genes are regulated by the positive regulatory factor A ( PrfA), encoded by prfA, which is itself a member of the same gene cluster (LIPI-1). Previous studies have indicated that the utilization fermentable sugars like glucose, mannose, and cellobiose repressed the PrfA-controlled virulence gene expression in L. monocytogenens. Based on the published results and the results obtained in this study, it is tempting to hypothesise that components of the carbon catabolite repression (CCR) or of the PTS- (Phosphoenolpyruvate Phosphotransferase System) dependent sugar transport are involved in modulation of PrfA activity. To show that components of CCR could be involved in modulation of PrfA activity and therfore in regulation of PrfA-dependent virulence gene expression in L. monocytogenes, insertion mutants of ccpA (coding for CcpA = catabolite control protein A), hprK (coding for HPr kinase/phosphatase which phosphorylates HPr at Ser46) and ptsH (coding for HPr) were characterised. The ::ccpA and ::hprK mutants showed reduced growth in BHI (undefined nutrient rich medium) as well as in defined minimal medium (MM) with 50 mM glucose and decreased [14C]-glucose uptake compared to wild-type. The ::ptsH mutant could only grow in a rich culture medium and as expected was unable to grow in MM with glucose as sole carbon source because of its inability to produce HPr. ::hprK and ::ptsH mutant (under certain growth conditions) too showed increased expression of PrfA-controlled genes both at the transcriptional and translational level. Cellobiose utilisation in the ::hprK mutant led to inhibition of PrfA activity. In contrast, the ::ccpA mutant showed decreased expression of the PrfA-dependent virulence genes in comparison to wild-type. Revertants, RccpA RhprK and RptsH again showed a wild type phenotype with respect to growth and expression of the PrfA regulated genes. In spite of slight increased virulence gene expression, the ::ptsH mutant showed reduced replication in J744 macrophages compared to wild-type. The transcript profiles of the::ccpA and ::hprK mutants revealed in comparison to the wildtype several upregulated genes. Amongst others, genes coding for PTS-dependent sugar transport, ABC-transporter and enzyms of the C- and N-metabolism were upregulated, suggesting that they were repressed in wild-type under those growth conditions. Upregulation of the PrfA-dependent virulence genes in the ::hprK mutant correlates with the down-regulation of genes which are controlled by the efficiency of PTS-mediated glucose transport. The increased PrfA activity and the absence of the HPr-Ser46~P (beside CcpA a main key player of CCR) in ::hprK and ::ptsH mutants led to assumption that there is an inverse correlation between the level of HPr-Ser46~P and PrfA activity. However, the determination of the PrfA activity and quantification of the amount of HPr-Ser46~P in the medium with glucose cellobiose and glycerol respectively showed that neither HPr-Ser46~P nor HPr-His15~P could act as direct negative modulators of PrfA activity. Recent studies aimed at demonstrating direct binding of purified HPr-Ser46~P and PrfA using Biacore assays also failed. In addition in vitro transcription showed no inhibition effect by HPr-Ser46~P to initiated transcription from several PrfA-dependent promoters (S. Müller-Altrock, personal communication). Interestingly, during active glucose transport, conditions where EIIA components of active glucose-specific PTS are unphosphorylated (EIIA components transfer the phosphate via EIIB to the glucose being tranported by EIIC into the bacterial cell) the PrfA activity is low. In the late log phase and the early stationary phase where less glucose is taken up by the bacteria and glucose-specific EIIA components are phosphorylated, the PrfA activity increased. L. monocytogenes grown in the presence of the non-PTS carbon source glycerol showed already in the early growth phase a higher PrfA activity in comparison to growth with PTS-dependent sugars like glucose or cellobiose. Based on these results, the expression of specific PTS and the phosphorylation state of EIIA componentes of these PTS seams to affect the regulation of PrfA activity. The exact mechanism of glucose uptake in L. monocytogenes is still unclear (R. Stoll; unpublished data). Due to the growth deficiency of the ::ptsH mutant in glucose-containing MM glucose uptake must be PTS-dependent. The glucose-specific PtsG described for B. subtilis and other bacteria as important glucose transporter is not present in L. monocytogenes. Only a PtsG-specific EIIA component (encoded by lmo1017) has been identified. Growth analysis in defined MM supplemented with glucose, mannose, cellobiose and glycerol respectively showed no differences in growth between eIIAGlc mutant and wildtype. The PrfA activity in that mutant was slightly increased, shown in a slight increased expression of ActA and PrfA and a higher LLO activity compared to wild-type. However, studies aimed at demonstrating direct binding of purified EIIAGlc and PrfA with in Biacore assays failed (S. Müller-Altrock and G. Seidel, personal communication). Which of the EIIA components of specific PTS are involved in modulation of PrfA activity needs further clarification. Transport of phosphate sugars like glucose-1-, glucose-6- or mannose-6-phosphate is mediated by the hexose-phosphate-transporter UhpT encoded by the strictly PrfA-dependent gene uhpT. Addition of Amberlite XAD-4 to LB-Medium or preincubation in glycerolcontaining MM conditions which induce PrfA activity led to efficient growth of L. monocytogenes in glucose-6-phosphate containing medium. Even though, glucose, cellobiose and glucose-6-phosphate are catabolised via glycolyis, glucose-6-phosphate utilisation led to deregulation of the CCR. This deregulation was shown on the basis of wholegenome-transcriptom analysis and quantification of the amount of HPr-Ser46~P. The non-PTS-dependent transport of glucose-6-phosphate resulted similar to that of glycerol to a higher activation of PrfA. Besides glycerol, dihydroxyacetone (dha) and pyruvate (with lower growth efficiencies) but not glycerol-3-phosphate seem to be suitable C3 sources for L. monocytogenes. The ::ptsH mutant was unable to grow in glycerol- or dha-containing medium which suggests that the listerial glycerol kinase(s) (GlpK) similar to that of B. subtilis is activated by HPr-His15~P and that the dha kinase(s) (DhaK) also use HPr-His15~P as a cofactor for dha phosphorylation. The glycerol metabolism of L. monocytogenes was mainly characteriezed by wholegenome transcriptome analysis and Real-time RT-PCR. It was shown that L. monocytogenes exhibits many genes highly upregulated in glycerol-containing MM indicating an involvement in glycerol and dha metabolism, respectively. L. monocytogenes possesses two dha kinases (encoded by lmo0347-48 and lmo2695-96) with high sequence homology to the dha kinase of E. coli. Deletion of both dha kinases (ΔdhaK = Δlmo0347-48/lmo2695-96) led to high growth inhibition and to almost complete PrfA inactivation. The dhaK and glpD/dhaK mutants exhibited a reduction in intracellular replication in J744 macrophages compared to wild-type, suggesting an utilisation of glycerol and/or dha in the host cytosol by L. monocytogenes. The fact that these mutants could still grow in this cell compartment of macrophages (however with lower efficiencies) indicates that L. monocytogenes must be able to utilise additional carbon sources in the host cell.
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Einfluss der Phosphoenolpyruvat-Phosphotransferasesysteme auf die Aktivität des Virulenzgenregulators PrfA von Listeria monocytogenes / Impact of the phosphoenolpyruvate phosphotransferasesystems on the activity of the virulence gene regulator PrfA of Listeria monocytogenesStoll, Regina January 2008 (has links) (PDF)
Die PrfA-Aktivität im L. monocytogenes Stamm EGD sowie dessen prfA Deletionsmutante mit dem prfA- bzw. prfA*-Gen unter Kontrolle des prfA-Promotors auf dem High-Copy Plasmid pERL3 wurde nach Wachstum in BHI, LB (Luria-Bertani Medium) und definiertem MM untersucht. Die Medien waren versetzt mit 50 mM der PTS-Kohlenstoffquellen Glucose, Mannose oder Cellobiose oder mit der Nicht-PTS-Kohlenstoffquelle Glycerin. Mit dem Wildtyp EGD konnte in BHI und LB mit allen genannten Kohlenstoffquellen nur eine geringe PrfA-Aktivität beobachtet werden. In MM dagegen war die PrfA-Aktivität in Anwesenheit von Glycerin stark erhöht und mit Cellobiose als einziger Kohlenstoffquelle stark reprimiert. Mit dem PrfA*-überexprimierenden Stamm wurden unter allen Bedingungen hohe PrfA-Aktivität gefunden. EGDΔprfApPrfA zeigte dagegen trotz gleicher PrfA-Menge wie EGDΔprfApPrfA* nur in BHI eine hohe PrfA-Aktivität. Die Zugabe des Amberlites XAD4 in LB erhöht die reduzierte PrfA-Aktivität in EGDΔprfApPrfA und in MM verstärkt XAD4-Zugabe die PrfA-Aktivität des Wildtyps. Eine ptsH-Mutante ist in LB und MM unabhängig von der Zugabe einer der vier Kohlenstoffquellen nicht in der Lage zu wachsen (Stoll et al., 2008), was darauf hin deutet, dass die Aufnahme der verwendeten Kohlenstoffquelle und auch der Glycerinstoffwechsel von einem intakten PTS-Weg abhängig sind. In BHI stehen dagegen offensichtlich noch PTS-unabhängige Kohlenstoffquellen zur Verfügung, da die ptsH-Mutante in BHI noch wachsen kann. Dies unterstützt auch die Beobachtung, dass die Generationszeiten von L. monocytogenes in LB und vor allem MM im Vergleich zu BHI wesentlich länger sind. Expressionsdaten der PTS-Gene wurden von allen drei Stämmen unter verschiedenen Wachstumsbedingungen erstellt. Die Daten deuten darauf hin, dass die PrfA-Aktivität mit der Expressionsstärke und dem Phosphorylierungsstatus bestimmter PTS-Permeasen zusammenhängt. PTS-Permeasen bestehen immer aus mindestens drei Domänen, der Membran überspannenden Zucker transportierenden Domäne EIIC (und EIID im Falle von Mannose spezifischen PTS) und den zwei im Zytosol löslichen Komponenten EIIA und EIIB. EIIA wird direkt von HPr-His-P phosphoryliert, welches sein Phosphat von dem von PEP phosphorylierten EI empfängt. Das PTS spielt neben der Zuckeraufnahme eine Rolle in vielen regulatorischen Vorgängen in der Bakterienzelle, unter anderem in der Pathogenese (Barabote and Saier, 2005; Deutscher et al., 2006; Postma et al., 1993). Listerien codieren für alle sieben bekannten PTS-Familien, 86 Gene codieren für 29 komplette und einige unvollständige PTS. Trotz der großen Anzahl an PTS-Genen besitzt L. monocytogenes kein vollständiges PtsG, welches homolog zu E. coli oder B. subtilis ist, sondern nur ein EIIAGlc. Um die an der Glucoseaufnahme involvierten PTS-Permeasen zu identifizieren und einen möglichen Zusammenhang zwischen diesen PTS-Permeasen und der PrfA-Aktivität zu untersuchen, wurden in dieser Arbeit systematisch PTS-Permeasen deletiert, welche für putative Beta-Glucosid-PTS (PTSGlc), Mannose-PTS (PTSMan) und Cellobiose-PTS (PTSLac) codieren. Diese Deletionsmutanten wurden bezüglich ihres Wachstumes in Gegenwart der entsprechenden PTS-Zucker und die PrfA-Aktivität untersucht. Deletionen von in L. monocytogenes EGD-e nur schwach exprimierten PTSGlc haben keinen Einfluss auf das Wachstum in MM mit 10 mM Glucose oder Cellobiose. Von den vier exprimierten PTSMan sind zumindest zwei eindeutig in der Lage, Glucose zu transportieren, und die Deletion dieser PTS-Permeasen, codiert von lmo0096-0098 und lmo0781-0784, erhöht sehr deutlich die Expression des im Wildtyp wenig exprimierten Gens für die PTS-Permease PTSGlc(lmo0027). Für den Cellobiose-Transport scheint von den sechs vollständigen PTSLac-Permeasen vor allem PTSLac(lmo2683-2685) und nach Deletion dieses Operons, ebenfalls die PTSGlc(lmo0027)-Permease wichtig zu sein. Obwohl die multiple Deletion dieser für die Glucose/Mannose- bzw. Cellobiose-Aufnahme in L. monocytogenes wichtigen PTS-Permeasen das Wachstum in definiertem MM drastisch reduziert, haben diese Deletionen offensichtlich keine Auswirkung auf das intrazelluläre Wachstum, da die Infektionsrate so effizient ist wie die des Wildtyps. Auf PrfA hat die schrittweise Deletion der Glucose/Mannose-spezifischen PTS-Permeasen nach Wachstum in MM mit Glucose als einziger Kohlenstoffquelle eine aktivierende Wirkung, jedoch keine Auswirkung nach Wachstum in Cellobiose-haltigem MM. Umgekehrt verhält es sich mit den PTSLac-Deletionsmutanten. In vitro Transkriptionsstudien mit (teilweise phosphoryliert) aufgereinigten Lmo0096 (EIIABMan) und Lmo1017 (EIIAGlc) -Proteinen deuten auf eine direkte Interaktion zwischen PrfA und bestimmten EII-Proteinen hin. Dies konnte für Lmo0096 auch in Immunpräzipitationsassays gezeigt werden. Eine Überexpression von Lmo0096 führte zudem zu einer sehr deutlichen Reduktion der PrfA-Aktivität nach Wachstum in MM mit Glucose. / In this study the PrfA activity was assessed in L. monocytogenes strain EGD and its isogenic deletion mutant (EGDΔprfA) with the prfA or prfA* gene under the control of the prfA promoter located on the high copy plasmid pERL3 (strains EGDΔprfApPrfA and EGDΔprfApPrfA*) after growth in BHI, LB (Luria-Bertani broth) and defined minimal medium. Media were supplemented with 50 mM of the PTS carbon sources glucose, mannose or cellobiose or with the non-PTS carbon source glycerol. In the wild type EGD grown in BHI and LB a low PrfA activity was observed with all of the above carbon sources. In MM PrfA activity was strongly increased in the presence of glycerol and strongly decreased with cellobiose as sole carbon source. In the PrfA* overexpressing strain EGDΔprfApPrfA* high PrfA activity was detected under all conditions. EGDΔprfApPrfA exhibited a high activity only in BHI, though PrfA amounts were equally high as in EGDΔprfApPrfA*. Addition of the amberlite XAD4 to LB increases the reduced PrfA activity in EGDΔprfApPrfA and the activity of the wildtype in MM. A ptsH mutant is unable to grow in LB and MM irrespective of the supplementation with the four carbon sources (Stoll et al., 2008), indicating that the uptake of the carbon source used as well as the glycerol metabolism are dependent on an intact PTS pathway. In contrast, BHI obviously possesses PTS independent carbon sources, as the ptsH mutant is still able to grow in BHI. This is also confirmed by the fact that L. monocytogenes generation times are significantly longer in LB and even more in MM as compared to BHI. Expression of the PTS genes was assessed in all three strains upon different growth conditions. The data suggest that PrfA activity is correlated with the expression level and the phosphorylation state of specific PTS permeases. PTS permeases always consist of at least three domains, the membrane crossing sugar transporting domain EIIC (and EIID in mannose specific PTS) and the two cytosolic components EIIA and EIIB. EIIA is directly phosphorylated by HPr-His-P which receives its phosphate group from EI which is phosphorylated by PEP. Aside from sugar transport PT Systems are involved in a variety of regulatory processes in the bacterial cell, e.g. in pathogenesis (Barabote and Saier, 2005; Deutscher et al., 2006; Postma et al., 1993). Listeria code for all of the seven known PTS families with 86 genes coding for 29 complete and several incomplete PTS. Despite the large number of PTS genes L. monocytogenes does not possess a complete PtsG homologue to E. coli or B. subtilis but only an orphan EIIAGlc. To identify the PTS permeases involved in glucose uptake and to investigate a possible role in PrfA regulation, mutants with deletions of beta glucoside PTS (PTSGlc), mannose PTS (PTSMan) and cellobiose PTS (PTSLac) permeases have been analyzed systematically in this study. These deletion mutants were analyzed in respect to their growth upon the respective PTS sugars and to their PrfA activity. Deletion of the five PTSGlc permeases only weakly expressed in L. monocytogenes EGD-e had no impact on growth in MM with 10 mM glucose or cellobiose. At least two out of the four expressed PTSMan permeases are able to transport glucose and the deletion of these PTS (encoded by lmo0096-0098 and lmo0781-0784) causes a significant increase in expression of the PTSGlc(lmo0027) permease, which is expressed at a low level in the wildtype. For transport of cellobiose, only PTSLac(lmo2683-2685) out of the six complete PTSLac permeases and, after deletion of this operon, PTSGlc(lmo0027) seem to be of importance. Although multiple deletions of the PTS important for glucose/mannose and cellobiose uptake have severe consequences on growth in defined MM, obviously intracellular life is not affected, as infection rates resemble those of the wild type. PrfA is activated by the stepwise deletion of the glucose/mannose specific PTS upon growth in MM supplemented with glucose, but no effect is seen upon growth in cellobiose supplemented MM. The behavior of the PTSLac deletion mutants is conversely. In vitro transcription studies with (partially phosphorylated) purified Lmo0096 (EIIABMan) and Lmo1017 (EIIAGlc) proteins suggest a direct interaction between PrfA and specific EII proteins. This could be confirmed for Lmo0096 in immuno precipitation assays. An overexpression of lmo0096 lead to a significant reduction of PrfA activity upon growth in MM supplemented with glucose.
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Der Thiol:Disulfid-Redox Metabolismus und der Blaulichtrezeptor Lmo0799 von Listeria monocytogenes / The Thiol:Disulfide-Redox Metabolism and the Bluelight-Photoreceptor Lmo0799 of Listeria monocytogenesOndrusch, Nicolai January 2010 (has links) (PDF)
Der Thiol-Redox-Metabolismus, der in allen lebenden Zellen zu finden ist, wirkt oxidativem Stress entgegen. Des Weiteren dient er auch der Aufrechterhaltung der intrazellulären Thiol:Disulfid-Balance, die wiederum für die Funktion vieler Proteine essentiell ist. Auch stellt er Reduktionsäquivalente für die Produktion von Desoxyribonucleotiden für die DNA-Synthese bereit und hilft oxidierte Proteine zu reparieren. Der Thiol:Disulfid-Redox-Metabolismus (TDRM) unterscheidet sich von anderen metabolischen Netzwerken dadurch, dass keine Kohlenstoff- oder Stickstoffbindungen verändert werden. In vielen Fällen beinhaltet er die reversible Oxidation zweier benachbarter Cysteinreste im entsprechenden Protein, was zur Ausbildung von Disulfidbrücken führt. Da ein totaler Ausfall der GSH-Synthese einen geringeren Effekt zu haben schien als ein teilweiser, wurden DNA-Microarray-Transkriptomanalysen der ΔgshF-Mutante durchgeführt. Es wurden rund 750 Gene als signifikant reguliert (p < 0,05, Fold-change <0,5 bzw. >2) identifiziert. Da die am stärksten regulierten Gene von besonderem Interesse waren, wurden die Ausschlussgrenzen auf <0,2 bzw. >5 –fach reguliert heraufgesetzt. Diese Parameter trafen auf 92 Gene zu, davon 41 durch GSH-Mangel herauf-regulierte (d.h. die mRNA-Menge war in der Mutante höher als im Wildtyp) und 51 herunter-regulierte. Auffällig war, dass die Expression vieler Gene, welche durch den Stress-Sigmafaktor SigB reguliert werden, bei Fehlen von GSH verändert war. Zu den am stärksten (sechs- bis elffach) herauf-regulierten Genen zählen lmo0135-7, sie codieren für einen putativen Oligopeptidtransporter. Die Vermutung lag nahe, dass dieser evtl. GSH aus dem Medium in die Zellen transportieren könnte. Man kann also davon ausgehen, dass GSH von Listeria aktiv aus dem Medium aufgenommen wird und dass die Effekte, die im Versuch ohne zusätzliches GSH auftreten, direkt auf das Fehlen von GSH zurückzuführen sind. Zusammengefasst zeigte sich, dass ein Ausfall der GSH-Synthese in Listeria keinen auffälligen Phänotyp zeigt. Es wurden jedoch sehr umfangreiche Veränderungen des Transkriptionsprofils beobachtet, offenbar konnten die Bakterien dadurch eine neue zelluläre Homöostase erreichen. Physiologische Mengen von GSH im Medium komplementierten den Ausfall der GSH-Synthese fast vollständig. Im Laufe dieser Analysen fiel das Augenmerk auf ein Gen mit unbekannter Funktion, lmo0799, das in der ΔgshF-Mutante als deutlich heraufreguliert identifiziert worden war. Eine nähere in-silico-Analyse ergab deutliche Homologien des Lmo0799 Proteins zu einem Blaulicht-photorezeptor, YtvA, von Bacillus subtilis. Da ein Zusammenhang mit dem TDRM aufgrund der Microarray-Analysen mehr als wahrscheinlich schien, richtete sich das Augenmerk verstärkt auf die Charakterisierung des putativen Blaulichtrezeptors Lmo0799. Es wurde eine In-Frame-Deletionsmutante in lmo0799 hergestellt, die mit Δlmo0799-Mutante bezeichnet wurde. Darin ist das ursprünglich 253 Aminosäuren (AS) große Genprodukt von lmo0799 auf sieben AS verkürzt, ohne den Promotor- oder Terminatorbereich bzw. umliegende Gene zu verändern. Parallel wurde begonnen, Versuche zum Einfluss von Licht (blau, λ=455nm bzw. rot, λ=625nm) in vivo und in vitro auf L. monocytogenes durchzuführen. Versuche mittels qRT-PCR wurden durchgeführt um die genaue Wirkweise von Lmo0799 näher aufzuklären. Dazu wurden Testgene aus verschiedenen Regulons ausgewählt und deren Transkription in Proben von Wildtyp und Δlmo0799-Mutante mit und ohne blauem bzw. rotem Licht sowie mit und ohne Salzstress gemessen. Dabei zeigte sich, dass vor allem die Transkription von Genen des SigB-Regulons, das für die allgemeine Stressantwort in Listerien zuständig ist, durch Licht moduliert wurde. Die Wirkung von Blaulicht hing in hohem Maße von der Anwesenheit von Lmo0799 ab, welches wahrscheinlich eine Komponente des „Stressosoms“ von Listeria darstellt. Die Lichtregulation betraf auch die Internaline A und B, deren Transkription durch Belichtung stark erhöht wurde. Infektionsversuche mit blau belichteten bzw. dunkel gehaltenen Wildtyp- bzw. Δlmo0799-Bakterien an humanen Caco-2 Enterozyten zeigten, dass wildtypische Listerien nach Bestrahlung mit blauem Licht ihre Invasionsrate verdoppelten, während die Δlmo0799-Listerien auf Niveau der Dunkelkontrolle blieben. In der vorliegenden Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass L. monocytogenes (und wohl auch die anderen Listeria-Arten) in Lmo0799 einen funktionalen Blaulichtrezeptor besitzt, der eine wichtige Rolle in der Vermittlung von Stressreizen via SigB spielt und auch die Motilität und Virulenz moduliert. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass auch rotes Licht die Transkription zahlreicher durch Blaulicht regulierter Gene beeinflusst. Der molekulare Mechanismus konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht mehr aufgeklärt werden. / The thiol-redox metabolism, which can be found in all living cells, counteracts oxidative stress. It also serves in maintaining a proper intracellular thiol:disulfide balance which is essential for many protein functions. It also provides reducing power for the production of deoxynucleotides and thus for DNA synthesis and helps in repairing oxidized proteins. The thiol-redox metabolism and other cellular processes are partially regulated by thiol-based regulatory switches. The thiol:disulfide-redox metabolism (TDRM) differs from other metabolic pathways in that no carbon- or nitrogenbonds are altered. In many cases it involves the reversible oxidation of two neighboring cysteines in the corresponding protein, leading to the formation of disulfide bonds. As a total deficiency in GSH synthesis seemed to have a lesser effect as a partial one, DNA microarray experiments were carried out with the ΔgshF mutant. As it turned out, a large number of genes was affected. Around 750 genes were identified to be differentially transcribed to a significant (p < 0.05, fold-change <0.5 or >2) extend. The focus was on the most differentially transcribed genes and therefore the threshold was set to < 0.2 or >5 – fold regulated, respectively. These parameters held true for 92 genes, of which 41 were up regulated by the lack of GSH (meaning the amount of mRNA of this gene is x-fold higher in the mutant than in the wildtype), and 51 were down regulated. First analyses showed that only few genes of the TDRM list fulfilled these parameters, among them trxB, perR and sod. Interestingly prfA-dependent virulence genes like hly, actA, plcB or inlA and inlB were among the genes down regulated most significantly. This was also confirmed by e.g. lecithinase assay. prfA itself was not differentially transcribed. Strikingly the expression of many SigB-regulated genes was altered when GSH was lacking. Among the genes up regulated the most (six- to elevenfold) were lmo0135-7, encoding a putative oligopeptide transporter. Probably it facilitates the uptake of GSH from the medium into the cell. Taken together, the results of this work show that a loss of GSH synthesis in Listeria does not result in a particular phenotype. However, extensive changes in the transcription profile were observed as a consequence of the lack of GSH, apparently the bacteria thus could establish a new cellular homeostasis. Physiological amounts of GSH in the medium can complement the loss of GSH synthesis almost completely. During these analyses a gene of unknown function, lmo0799, was noticed to be significantly up regulated in the ΔgshF mutant. A closer in silico analysis showed strong homologies of the Lmo0799 protein to a blue-light photoreceptor, YtvA from Bacillus subtilis. As there seemed to be a clear connection to the TDRM because of the microarray analysis, the focus shifted to the characterization of the putative blue light receptor Lmo0799. An in-frame deletion mutant in lmo0799 was obtained, which was designated Δlmo0799. In this mutant the 253 amino acid long gene product of lmo0799 was shortened to seven amino acids, without altering the promoter or terminator region or any surrounding gene, respectively. In parallel, experiments were started to investigate the influence of light (blue, λ=455nm or red, λ=625nm) on L. monocytogenes in vivo and in vitro. qRT-PCR experiments were carried out to give more detailed information on the mode of action of Lmo0799. Test genes from different regulons were selected and their transcription was tested in samples from wild type and the Δlmo0799 mutant, kept in the dark or irradiated with red or blue light, and plus/minus salt stress. It turned out that Lmo0799 is linked to the SigB regulon, responsible for the stress response in Listeria, suggesting that Lmo0799 is a component of the “stressosome”. It also became clear that the transcription of the Internalins A and B was stimulated by blue light. Infection assays with human Caco-2 enterocytes, using wild type and Δlmo0799 bacteria grown under NaCl-stress conditions and in the dark or with blue light, showed that the wild type doubles its invasion rate after illumination with blue light compared to the reference kept in the dark, while the Δlmo0799 mutant showed no increased invasiveness. In this work it could be demonstrated for the first time that L. monocytogenes possess a functional blue-light photoreceptor, Lmo0799, which plays a major role in relaying stress stimuli via SigB and which also modulates motility and virulence. Furthermore, it could be shown that also red light has an effect on the transcription of blue-light modulated genes. The underlying mechanism could not be elucidated in the framework of this thesis.
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Interaktion humaner dendritischer Zellen mit Listeria monocytogenes / Interaction of human dendritic cells with Listeria monocytogenesKolb-Mäurer, Annette January 2001 (has links) (PDF)
Dendritische Zellen (DZ) aktivieren naive CD4+ und CD8+ T-Lymphozyten und spielen daher die entscheidende Rolle bei der Auslösung einer Immunantwort gegenüber pathogenen Mikroorganismen. In dieser Arbeit wurde die Interaktion von DZ mit Listeria monocytogenes untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass L. monocytogenes effizient in unreife, humane DZ aufgenommen wird. Die Phagozytoserate von L. monocytogenes unter Zugabe von humanem Plasma war wesentlich höher als im Plasma-freien Medium oder Medium mit fötalem Kälberserum (FCS). Die Zugabe von Immunglobulinen führte zu einem konzentrationsabhängigen Anstieg der Phagozytose von L. monocytogenes in humane DZ, der mit der Phagozytoserate bei Zugabe von humanem Plasma vergleichbar war. Plasma von gesunden Spendern enthielt Antikörper gegen das listerielle Oberflächenprotein p60. Durch die Verwendung einer p60 Deletionsmutante konnte gezeigt werden, dass der p60 Antikörper das Haupt-Opsonin für die Aufnahme von L. monocytogenes in Mo-DZ darstellt. Die Aufnahmerate dieser Mutante zeigte nur geringe Differenzen bei An- oder Abwesenheit von humanem Plasma während der Inkubationszeit, was den Schluss zulässt, dass Immunglobuline gegen das Oberflächenprotein p60 von L. monocytogenes und anderen apathogenen Listerien, für die effiziente Phagozytose verantwortlich sind. Nach Aufnahme der Listerien befanden sich die meisten (> 95 Prozent) DZ in Membran-umgrenzten Phagosomen und sehr selten frei im Zytosol. Die Mehrzahl der Listerien wurde im Phagosom der humanen DZ effizient lysiert. L. monocytogenes-infizierte DZ entwickelten sich phänotypisch zu reifen DZ. Die durch Listerien ausgelöste Maturation der DZ ließen sich durch die Zugabe von listerieller Lipoteichonsäure (LTA) nachahmen. Obwohl bekannt ist, dass eine Listerieninfektion in anderen Zellkulturen Zelltod induziert, führte die Infektion humaner DZ lediglich in weniger als 20 Prozent der infizierten DZ zur Nekrose. Apoptotischer Zelltod konnte nicht nachgewiesen werden. Die Interaktion humaner DZ mit L. monocytogenes könnte somit eine Verbreitung der Bakterien im Organismus verhindern. Langfristig gesehen ergeben die in dieser Arbeit gewonnenen Daten zur Interaktion DZ mit L. monocytogenes Erkenntnisse zur Entwicklung neuer DNA-Vakzinierungsstrategien mit L. monocytogenes als DNA-Träger. / Dendritic cells (DC) activate naive CD4+ and CD8+ lymphocytes and are therefore critical for the initiation of an immune response against microorganisms. In this work the interaction between DC and L. monocytogenes was examined. Immature DC show a very efficient uptake of L. monocytogenes. Phagocytosis was much higher in the presence of human plasma than with plasma free media or media with fetal calf serum (FCS). However, the addition of immunoglobulins showed a concentration dependent increase in phagocytosis comparable with the addition of human plasma. Human plama contains antibodies against the listerial surface protein p60. By using a iap-deletion mutant it was shown that antibodies against p60 are the main opsonin for the uptake of L. monocytogenes into DC. Because no difference in the uptake of this deletion mutant in the presence or absence of human plasma was observed; antibodies against p60 appear to be resonsible for the efficient uptake of L. monocytogenes and other apathogenic Listeria strains. A major portion of internalized bacteria is found in membrane-bound phagosomes and rarely free in the cytosol. Most of the bacteria that were taken up by DC were killed very efficiently in the phagosome. Interestingly, infection with L. monocytogenes caused maturation of the immature DC into mature DC. This effect appeared to be largely mediated by listerial lipoteichoic acid. Although L. monocytogenes infection is known to induce death in other cell types, DC were relatively resistant and only 20 per cent of infected DC underwent cell death. Uptake, maturation and resistance to apoptosis suggest that DC are essentiel antigen presenting cell (APC) for L. monocytogenes immunity. Thus these observations into the interaction of L. monocytogenes with human DC provide an important into the pathogenesis of Listeria infection as well as providing a basis for Listeria-based vaccination strategies.
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Molekularbiologischer Nachweis und Immunologie des P60-Proteins, sowie In-vitro-Transkription PrfA-abhängiger bzw. -unabhängiger Gene von Listeria monocytogenes / Molecular biologycal detection and immunology of the P60-protein and in vitro-transcription of PrfA-dependent and -independent genes of Listeria monocytogenesLalic-Mülthaler, Mio January 2003 (has links) (PDF)
Listeria monocytogenes, ein Gram-positives, fakultativ intrazelluläres Bakterium, kann bei immunsupprimierten Menschen schwere Infektionen des Zentralnervensystems auslösen. In Folge seines ubiquitären Vorkommens, sowie seiner hohen Resistenz gegenüber Lebensmittel-Konservierungsmethoden besteht ein großes Interesse an seiner raschen Identifizierung und Differenzierung gegenüber den apathogenen Spezies seiner Gattung. Sein P60 als essentielles Housekeeping-Gen bietet sich auf Grund der zwischen den einzelnen Spezies konservierten und variablen Bereiche für die Etablierung gattungs- und speziesspezifischer Nachweissysteme an. Mit Hilfe des EPITOP-SPOT-Mappings wurde eine Immunogenitätskarte des P60 von L. innocua bzw. L. monocytogenes erstellt, P60-spezifische CD4-T-Zellinien charakterisiert und das Epitop eines dieser T-Zellklone exakt bestimmt. Transferexperimente mit diesen T-Zelllinien und Boosterinfektionen mit L. monocytogenes bzw. L. innocua zeigten, dass L. innocua alleine zwar nicht in der Lage ist, einen Immunschutz gegen L. monocytogenes zu etablieren, diesen jedoch in vitro und in vivo erhalten kann, indem es durch kreuzreaktive Epitope Gedächtnis-T-Zellen stimuliert. Die in vitro-Transkription von Phly, PplcA und PactA erfolgt strikt PrfA-abhängig, während Piap, PprfA1/2 und - unerwarteter Weise - auch Pmpl PrfA-unabhängig transkribiert werden. Sie erfolgt - ausgenommen bei PprfA - nur bei ausreichender Verfügbarkeit von ATP nicht jedoch GTP. Um eine effiziente Transkription zu gewährleisten, müssen die ersten drei initiierenden Nukleotide in höherer Konzentration vorliegen. Die verschiedenen, über eine Heparinsäule aufgetrennten RNAP-Fraktionen von L. monocytogenes zeigten je nachdem, ob die Kulturen einer Hitzeschockbehandlung bei 48°C (RNAP48) ausgesetzt, in MEM geshiftet (RNAPMEM) oder aber direkt aus dem BHI-Medium (RNAPBHI) geerntet wurden, mit den oben genannten Promotoren unterschiedliche Aktivitätsprofile. Demnach benötigen actA und hly für ihre optimale Transkription womöglich einen alternativen Sigmafaktor (als Sigma-43). / Listeria monocytogenes, a Gram positive, optionally intracellular bacterium is capable of causing heavy infections of the central nervous system in immunocompromised humans. Due to its ubiquitous occurrence, as well as its high resistance to preservation methods there is a great interest in its rapid identification and differentiation towards the apathogenen species of Listeria. Due to the preserved and variable domains P60 as an essential housekeeping gene represents a promising target in order to establish ge-nus- and species-specific detection systems. An immunogenic map of the P60 of L. innocua and L. monocytogenes was generated by EPITOP-SPOT-mapping. Furthermore CD4-T-cells specific for P60 were hereby characterized and for one of them the epitope was exactly determined. Transfer experiments with these T-cells and booster infections with L. monocytogenes and/or L. innocua showed that L. innocua alone is not capable of establishing an immune protection against L. monocytogenes, while in vitro and in vivo it was sufficient to maintain an existing immunity through stimulating memory T-cells by cross-reactive epitopes. In vitro-transcription from Phly, PplcA and PactA occurs strictly PrfA-dependent while that of Piap, PprfA1/2 and, unexpectedly, also from Pmpl is PrfA-independent. It requires – except with PprfA - high concentrations of ATP but not GTP. In order to ensure an efficient tran-scription, the first three initiating nucleotides have to be available in higher concentration. RNAP separated over a heparin column after preparation from L. monocytogenes either exposed to heat shock treatment at 48°C (RNAP48), shifted to MEM (RNAPMEM), or cultured directly in BHI (RNAPBHI) showed different activity profiles with the promoters mentioned above. Therefore actA and hly may require an alternative sigma factor (not Sigma-43) for their optimal transcription.
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Achieving protective immunitity against intracellular bacterial pathogens : a study on the efficiency of Gp96 as a vaccine carrier / Immunisierung gegen intrazelluläre Bakterien mit Hilfe von HSP-FusionsproteinenRapp, Ulrike January 2004 (has links) (PDF)
Protective vaccination against intracellular pathogens using HSP fusion proteins in the listeria model. / Impfschutz gegen intrazelluläre Pathogene durch Immunisierung mit HSP-Fusionsproteinen im listerien Modell.
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Identifizierung von essentiellen Genen in Salmonella typhimurium und Listeria monocytogenes durch Genom-weite Insertions-Duplikations-Mutagenese / Identification of essential genes in Salmonella typhimurium and Listeria monocytogenes by genome-wide insertion duplication mutagenesisKnuth, Karin January 2004 (has links) (PDF)
Die in dieser Arbeit etablierte Insertions-Duplikations-Mutagenese IDM ermöglicht es, das Genom von pathogenen Bakterien zu mutagenisieren und die so generierte Mutantenbank im high-throughput-Format auf Gene zu untersuchen, die unter bestimmten Bedingungen für das infektiöse Potential oder für das Überleben dieser Keime von Bedeutung sind. Die Grundlage von IDM bildet ein konditional replizierender Vektor, in den eine Genbank des Wirtsorganismus kloniert wird und der unter nicht-permissiven Replikationsbedingungen mittels homologer Rekombination ins Chromosom integriert und dadurch einen Gen-Knockout bedingt. Das IDM-Verfahren weist gegenüber der Transposon-Mutagenese den Vorteil auf, dass das Genom nach dem Zufallsprinzip saturierend mutagenisiert werden kann und dass keine hot spots für die Insertion auftreten. Darüber hinaus kann der mutierte Genlocus nach Screening der Mutanten schnell per PCR identifiziert werden, indem die Exzision des Vektors induziert und das klonierte, homologe Fragment sequenziert wird. Die Insertion des Vektors ins Chromosom und damit der Gen-Knockout ist selbst ohne Selektionsdruck sehr stabil, so dass die Mutanten im Zellkultur- oder Tier-System untersucht werden können. IDM wurde im Rahmen dieser Arbeit erfolgreich auf Salmonella enterica Serovar typhimurium und Listeria monocytogenes angewandt. Die Applikation von IDM auf S. typhimurium hatte zum Ziel, Gene zu identifizieren, deren Produkte für das Überleben dieses Gram-negativen Keims in Vollmedium unter Laborbedingungen essentiell sind. Ausgehend von 14.000 S. typhimurium Fragmentbank-Klonen konnten durch Induktion der Integration des Vektors 262 Klone identifiziert werden, für welche die Mutation zu einem lethalen Phänotyp führte. 116 der 262 entsprechenden Proteine konnte durch IDM erstmalig eine essentielle Funktion für die Vitalität von S. typhimurium zugewiesen werden. Darunter befinden sich sowohl Proteine, die homolog sind zu Proteinen anderer klinisch-relevanter Keime, als auch Proteine, die Salmonella-spezifisch sind. Der größte Teil der identifizierten Proteine ist in die Speicherung und Weitergabe von Information (Transkription, Translation, DNA-Reparatur etc.) involviert, viele sind allerdings auch Proteine unbekannter Funktion. Die Essentialität der durch IDM identifizierten Gene konnte durch die Konstruktion von konditional lethalen Mutanten bestätigt werden. IDM ist demnach das erste Mutagenese-Verfahren, welches das essentielle Gen-Set von S. typhimurium für das Überleben in Vollmedium zu definieren vermochte. Basierend auf den IDM Daten konnte es auf 511 Gene, d.h. auf 11 % des Gesamt-Genoms beziffert werden. Bei der Applikation von IDM auf L. monocytogenes lag der Fokus auf der Identifizierung von Genen, die für das Überleben dieses Gram-positiven Bakteriums im Zytosol von eukaryontischen Zellen von Bedeutung sind. Im Screening von bis dato 720 der 1491 L. monocytogenes Insertionsmutanten auf ein attenuiertes Replikationsverhalten in Caco-2 Zellen konnten 69 Mutanten selektioniert werden. In diesen Mutanten sind Gene ausgeknockt, deren Produkte hauptsächlich wichtige Funktionen in der Nährstoffbereitstellung, in der Energiesynthese und im Metabolismus inne haben. Mit der Insertions-Duplikations-Mutagenese IDM steht ein molekulares Werkzeug zur Verfügung, welches für die Identifzierung neuer targets für sowohl Breitband- als auch Spezies-spezifische Antiinfektiva eingesetzt werden kann und welches unbekannten Proteinen eine biologische Funktionen zuweisen kann. / Using insertion-duplication-mutagenesis IDM, that has been established in this work, it is possible to mutate the genome of pathogenic bacteria and to generate a mutant bank. This bank can be screened in a high throughput format on genes that are relevant under certain conditions for the infectious potential and the survival of these germs. IDM is based on a conditionally replicating vector which integrates into the chromosome under non-permissive replication conditions via homologous recombination after having cloned a gene bank from the host organism into it. The vector integration causes a knockout of the respective gene. In contrast to transposon mutagenesis, the IDM approach has the advantage that the whole genome is mutated and that no mutation hot spots occur. Furthermore, after having screened the mutant bank, the mutated gene locus can be identified very quickly by applicating PCR: excision of the vector is induced and the cloned, homologous fragment is sequenced. Integration of the vector into the chromosome and therefore the gene knockout is very stable even without any selection so that the mutants can be examined in the cell culture and animal model. In this work IDM has been applicated successfully to Salmonella enterica Servovar typhimurium and Listeria monocytogenes. Application of IDM to S. typhimurium aimed to identify genes whose products are essential for the survival of that Gram negative germ in rich medium under laboratory conditions. Starting with 14.000 S. typhimurium fragment-bank clones, induction of integration of the vector led to the identification of 262 clones for which the mutation resulted in a lethal phenotype. For 116 of the 262 respective proteins, this is the first data that assigns to these proteins an essential function for viability of S. typhimurium. Amongst them are proteins that are homologue to proteins of other clinically relevant germs, as well as proteins that are Salmonella specific. Most of the identified proteins are involved in information storage and processing (transcription, translation, DNA repair etc.), but many are proteins of unknown function. The essentiality of the identified genes could be confirmed by construction of conditionally lethal mutants. Hence, IDM is the first mutagenesis approach that reached to define the essential gene-set of S. typhimurium for survival in rich medium. Based on the IDM data it could be estimated at 511 genes, that means at 11 % of the whole genome. The application of IDM to L. monocytogenes focussed on the identification of genes that play an important role for the survival of that Gram-positive bacterium in the cytosol of eucaryotic cells. Until now 720 of the 1491 L. monocytogenes mutants have been screened on a attenuated replication behaviour in Caco-2 cells and 69 mutants have been selected. These mutants harbour mutations in genes whose products mainly hold important functions in nutrient uptake, energy synthesis and metabolism. The insertion-duplication-mutagenesis IDM has proven to be a suitable molecular tool that can be used for the identification of novel targets for both broad spectrum and species-specific antibiotics and that can assign a biological function to unknown proteins.
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Essential features of a PrfA-dependent : promoter of Listeria monocytogenes / Die essentiellen Eigenschaften eines PrfA-abhängigen Promotors von Listeria monocytogenesLuo, Qin January 2004 (has links) (PDF)
The gram-positive, facultative intracellular pathogen Listeria monocytogenes is the causal agent of listeriosis. Most of well-known virulence genes are controlled by PrfA that belongs to the Crp-Fnr family of transcriptional activators. A PrfA-mediated transcription initiating at a virulence gene promoter, inlC promoter (PinlC) that regulates the expression of the small, secreted internalin C, was in-depth characterized by an in vitro transcription system to unravel the essential features of a PrfA-dependent promoter in this study. The obtained results indicate a dual promoter for inlC that leads to PrfA-dependent and -independent transcription in vitro and in vivo. The PrfA-dependent transcription requires, as expected, the PrfA-box, a conserved 14 bp sequence of dyad symmetry located about 40 bp upstream of the transcriptional start site of each PrfA-regulated gene. Another important structural feature for this PrfA-dependent promoter is the distance between the 3´-end of the PrfA-box and the 5´-end of the SigA-recognized –10 box fixed to 22 or 23 bp, which is observed in the interspace regions of the other known PrfA-dependent promoters, e.g. PactA, PplcA, Phly and Pmpl. The –35 box of PinlC is not necessary for PrfA-dependent transcription. The –10 box of PinlC and also that of the other PrfA-dependent promoters of L. monocytogenes closely resemble SigA-recognized –10 promoter sequences of the well-characterized gram-positive bacterium B. subtilis. Even the extended –10 motif (5´-TRTG-3´) considered to be a basic element for many SigA-recognized promoters in B. subtilis is present in PinlC. Primer extension studies reveal that both the PrfA-dependent and the independent promoter share the same –10 box. The PrfA-independent transcription of inlC depends on a –35 box located directly downstream of the PrfA-box, and the close proximity of the two sites inhibits strongly the transcription activity of the PrfA-independent promoter when the PrfA-RNA polymerase complex binds to the PrfA-box. Deletion of the PrfA-box results in PrfA-independent transcription from PinlC, which is no longer inhibited by PrfA. High concentration of GTP appears to be necessary for PrfA-dependent transcription initiated at the inlC promoter and at other PrfA-dependent promoters. Based on transcriptome analysis, Milohanic and his co-workers identified three groups of genes that were regulated differently by PrfA. Some of these genes containing putative PrfA-boxes in their 5´-upstream regulatory regions were selected for analysis of their transcriptional dependency on PrfA using again the in vitro transcription system. The data show that among these “PrfA-regulated” promoters tested, only the promoter of the hpt gene belonging to group I is clearly activated by PrfA. This promoter is also the only one that exhibited all essential features of a typical PrfA-dependent promoter as described above. In vitro transcription starting at most of the other promoters was neither positively nor negatively affected by PrfA. Transcription initiated at some of the promoters of group III genes (lmo0596 and lmo2067) is rather inefficient with SigA-loaded RNA polymerase, but is highly activated with RNA polymerase loaded with purified SigB. Addition of purified PrfA protein has no effect on the SigB-dependent transcription. These in vitro transcription results indicate that the in vivo observed PrfA effect on the expression of most of the new genes is either indirect or PrfA-mediated transcription of these genes requires - in contrast to the PrfA-dependent transcription of the known virulence genes (including hpt) - additional factors not present in the in vitro transcription assay. In addition to these new genes described by Milohanic, the promoters of two genes (lmo2420 and lmo2840) that contain putative PrfA-boxes with only a single mismatch in their upstream regulatory regions were analyzed in this study. However, transcription of none of these genes is regulated by PrfA, suggesting that these genes are either not truly regulated by PrfA or regulated by other global transcription activators that interact with PrfA by yet unknown mechanisms. By exchanging corresponding sequences between a functionally inactive promoter ParoAP2 and a typical PrfA-dependent promoter PplcA, it is found that PrfA-dependent in vitro transcription can be initiated from the hybrid promoter containing the putative PrfA-box and the SigA-recognized –10 box (TTTAAT) from the putative PrfA-dependent aroAP2 promoter, but it is inhibited strongly by the interspace sequence between these two sites apparently due to an additional RNA polymerase binding site [the –10 box (TAATAT) for the PrfA-independent transcription of ParoAP1)] within this region. Furthermore, a symmetric sequence downstream of the –10 box (TTTAAT) is also shown to be a strongly inhibitory for PrfA-dependent transcription from the putative PrfA-dependent aroAP2 promoter. / Listeria monocytogenes, ein gram-positives, fakultativ intrazelluläres Bakterium. Die meisten bekannten listeriellen Virulenzgene werden durch den positiven Regulationsfaktor PrfA, der zur Crp-Fnr-Familie von Transkriptionsfaktoren zählt, reguliert. Zu den durch PrfA regulierten Genen zählt auch inlC, das das kleine sekretierte Internalin C kodiert. Mit Hilfe des in vitro Transkriptionssystems wurde in dieser Arbeit die PrfA-abhängige Transkription des inlC-Promotors (PinlC) untersucht, um die essentiellen Eigenschaften eines PrfA-abhängigen Promotors zu charakterisieren. Die hier erhaltenen Ergebnisse deuten auf einen dualen Promotor für inlC hin, der für eine PrfA-abhängige und -unabhängige Transkription in vitro und in vivo verantwortlich ist. Ein weiteres wichtiges Merkmal für diesen PrfA-abhängigen Promotor ist der Abstand zwischen dem 3'-Ende der PrfA-Box und dem 5'-Ende der SigA-abhängigen –10 Box, der 22 oder 23 bp beträgt und auch bei anderen bekannten PrfA-abhängigen Promotoren wie PactA, PplcA, Phly und Pmpl zu finden ist. Untersuchungen zeigten, dass die –35 Box von PinlC nicht notwendig für eine PrfA-abhängige Transkription ist. Die –10 Box von PinlC und anderen PrfA-abhängigen Promotoren von L. monocytogenes ähnelt stark den SigA-abhängigen –10 Promotorsequenzen des gut untersuchten gram-positiven Bakteriums B. subtilis. Sogar das erweiterte –10 Motiv (5'-TRTG-3'), das in B. subtilis als Hauptbestandteil vieler SigA-abhängiger Promotoren betrachtet wird, ist auch in PinlC zu finden. Untersuchungen mit Primer Extension zeigten, dass der PrfA-abhängige und PrfA-unabhängige inlC-Promotor die gleiche –10 Box verwenden. Die PrfA-unabhängige Transkription von inlC ist abhängig von einer –35 Box, die direkt downstream der PrfA-Box liegt. Durch die enge Nachbarschaft dieser beiden Sequenzen wird die Transkriptionsaktivität des PrfA-unabhängigen Promotors stark inhibiert, wenn der PrfA-RNA-Polymerase-Komplex an die PrfA-Box bindet. Deletion der PrfA-Box führt zu einer PrfA-unabhängigen Transkription von PinlC, die nicht länger durch PrfA inhibiert wird. Hohe Konzentration an GTP scheint zudem für die PrfA-abhängige Transkripitonsinitiation am inlC-Promotor und anderen PrfA-abhängigen Promotoren notwendig zu sein. Basierend auf Transkriptomanalysen identifizierte Milohanic et al. drei Gruppen von Genen, die differentiell durch PrfA reguliert werden. Einige dieser Gene besitzen putative PrfA-Boxen in ihren Promotorbereichen und wurden in dieser Arbeit mit Hilfe des in vitro Transkriptionssystems auf ihre PrfA-Abhängigkeit untersucht. Die hier erhaltenen Ergebnisse zeigen, dass unter allen untersuchten "PrfA-regulierten" Promotoren nur der Promotor des hpt-Gens - einem Mitglied der Gruppe I - deutlich durch PrfA aktiviert wird. Die meiste andere Promotoren wurde weder positiv noch negativ durch PrfA beeinflusst. Die Transkription von einigen Promotoren der Gruppe III Gene (lmo0596 und lmo2067) ist relativ ineffizient mit SigA-beladener RNA-Polymerase, wird aber stark aktiviert, wenn RNA-Polymerase mit gereinigtem SigB beladen wird. Zugabe von gereinigtem PrfA-Protein hat keinen Einfluss auf die SigB-abhängige Transkription. Diese in vitro-Transkriptionsergebnisse deuten darauf hin, dass der in vivo beobachtete PrfA-Effekt auf die Expression der meisten neu identifizierten Gene entweder indirekt ist oder die PrfA-vermittelte Transkription dieser Gene im Gegensatz zur PrfA-abhängigen Transkription der bekannten Virulenzgene (einschließlich hpt) zusätzliche Faktoren benötigt, die im in vitro Transkriptionsansatz nicht vorhanden sind. Neben diesen neuen von Milohanic et al. beschriebenen Genen wurden die Promotoren von zwei weiteren Genen (lmo2420 und lmo2840) untersucht, die putative PrfA-Boxen mit nur einem Mismatch aufwiesen. Die Transkription dieser beiden Gene zeigte jedoch keine Abhängigkeit von PrfA. Durch Austausch entsprechender Sequenzen zwischen einem funktionell inaktiven Promotor ParoAP2 und einem typischen PrfA-abhängigen Promotor PplcA konnte gezeigt werden, dass PrfA-abhängige in vitro Transkription von einem Hybridpromotor initiiert werden kann, der die putative PrfA-Box und SigA-abhängige –10 Box (TTTAAT) des möglicherweise PrfA-abhängigen aroAP2-Promotors besitzt. In vitro Transkription wird allerdings durch die zwischen PrfA und –10 Box liegende Sequenz des aroAP2-Promotors stark inhibiert, da offensichtlich eine zusätzliche RNA-Polymerase-Bindungsstelle [die –10 Box (TAATAT) für die PrfA-unabhängige Transkription von ParoAP1] in dieser Region vorliegt. Außerdem konnte gezeigt werden, dass eine symmetrische Sequenz downstream der –10 Box (TTTAAT) die PrfA-abhängige Transkription vom aroAP2-Promotor stark inhibiert.
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