L'autoincompatibilité (AI), généralement sous le contrôle d’un seul locus, le locus S, est la stratégie la plus répandue pour empêcher l'autofécondation chez les plantes hermaphrodites. Les déterminants de la réaction d’AI ont été identifiés dans quelques familles d’Angiospermes. Dans celle des Asteraceae, ces déterminants sont encore inconnus. La chicorée (Cichorium intybus L., Asteraceae) présente un système d’AI sporophytique. Afin d’identifier les déterminants de l’AI de cette espèce, une stratégie de clonage positionnel du locus S a été mise en place.Le locus S de la chicorée avait été cartographié à l'extrémité du groupe de liaison 2. Une carte haute densité a été obtenue à partir d’une approche BSA assistée par marqueurs : 5 marqueurs AFLP ont été identifiés, dont un coségrégeant avec le locus S. A partir d’une importante population (n = 2824), 2 cartes consensus haute résolution de la région du locus S ont été établies, l’une pour les méioses femelles (intervalle de 0,6 cM) et l’autre pour les méioses mâles (intervalle de 1,24 cM), en raison d’un phénomène d’hétérochiasmie.Deux banques BAC de chicorée ont été construites en collaboration avec le CNRGV. Elles ont permis d’initier et d’orienter la marche chromosomique vers le locus S. De plus, 6 clones BAC, soit 546 kb, ont été séquencés et analysés. Un rapport de 0,45 (méiose femelle) à 2 cM/Mb (méiose mâle) a été obtenu. La composition des séquences en éléments répétés et la fraction codante ont été étudiées (banques d’EST de Cichorium sp. et de peptides d’A.thaliana et de V.vinifera). Une relative conservation de la microsynténie a été observée entre ces gènes et leurs homologues chez 5 espèces Dicotylédones. / Generally under the control of one locus, the S-locus, self-incompatibility (SI) is one of the most important strategies to prevent selfing in hermaphrodite plants. Determinants involved in the SI reaction have been identified in some Angiosperm families. In the Asteraceae family, determinants of SI are still unknown. Chicory (Cichorium intybus L., Asteraceae) is a sporophytic SI species. To identify determinants of chicory SI, a positional cloning strategy has been implemented.The chicory S-locus has been assigned to one end of linkage group 2. A high density map have been obtained from a marker assisted BSA (Bulk Segregant Analysis) approach: 5 AFLP markers were obtained, including one co-segregating with the S-locus. From a large population (n = 2.824), 2 consensus high-resolution map of the S-locus region were produced. Due to a heterochiasmy phenomenon, the S-locus was positioned in an interval of 0,6 cM or 1,24 cM considering female or male meiosis, respectively.Two BAC libraries of chicory were produced in collaboration with the CNRGV. They allowed us to start chromosome walking and to turn it toward the S-locus. Moreover, 6 BAC clones, corresponding to 546 kb, were sequenced and analyzed. A ratio of 0,5 Mb/cM for male meiosis and 2,2~Mb/cM for female meiosis were obtained. Repeated element composition and coding part of the sequences were studied (libraries of Cichorium sp. EST and Arabidopsis thaliana and Vitis vinifera peptides). A certain degree of conservation of microsynteny was observed between these genes and their homologues in five Dicotyledon species.

L'ametller, Prunus amygdalus Batsch, és una espècie diploide que pertany al gènere Prunus. Encara que l'autoincompatibilitat (AI) és un caràcter important des del punt de vista evolutiu en el món vegetal, l'autocompatibilitat (AC) és un caràcter agronòmic crític per a assegurar la producció. D'aquesta manera, l'AC s'ha convertit en un dels principals objectius dels programes de millora d'ametller en tot el món. L'AC ha estat identificada en diverses varietats d'ametller, encara que sol ser excepcional. Els mètodes que s'han aplicat per a determinar l'AC són l'observació dels tubs pol·línics, i el quallat de fruits després de pol·linitzacions controlades. No obstant això, les noves tècniques moleculars s'han aplicat cada vegada més al llarg de les dues últimes dècades. Amb això s'ha aconseguit de determinar el genotip de les varietats i seleccions d'una manera molt ràpida i eficaç. L'AC ha estat relacionada amb la presència de l'al·lel Sf, el qual pertany a la sèrie al·lèlica S, i és dominant sobre els altres al·lels d'AI. Com a conseqüència d'això, sempre s'havia considerat que l'AI/AC era un caràcter qualitatiu, controlat per un únic locus, anomenat el locus S.Només un 25% dels individus procedents de l'encreuament 'Vivot' 􀂯 'Blanquerna' ha estat AC, molt menys de l'esperat, un 50%. Les dues versions diferents de l'haplotip Sf, una activa i AI (Sfa) i l'altra inactiva i AC (Sfi), han mostrat el reconeixement per part de la Sfa- RNasa dels pistils de 'Vivot' dels tubs pol·línics amb el Sfi de 'Blanquerna'. Aquests resultats suggereixen la presència d'un locus modificador no lligat al locus S, el qual seria el responsable del control de l'AI/AC en aquesta població. Encara que darrerament s'hagi aprofundit en l'estudi del locus S a nivell molecular, aquest mecanisme no està encara del tot determinat, pel que se suggereix que d'altres gens serien un requisit per a l'AI. En aquesta tesi s'ha localitzat per primera vegada en la família de les rosàcies dos nous loci, situats fora del locus S, els quals es troben en els grups de lligament 6 i 8. Amb aquests resultats, podríem suggerir que l'AI és un caràcter quantitatiu i no qualitatiu, com s'acceptava fins ara.D'altra banda, la construcció d'una llibreria genòmica (fòsmid) de 'Vivot' i 'Blanquerna' ens ha permès de comprovar que tant les Sf-RNases com les SFBf eren completament idèntiques, a pesar de tenir dues expressions tan diferents. Com no ha estat possible de trobar cap mutació entre ambdós Sf, s'ha suggerit la implicació de la metilació de l'ADN en aquesta població. La metilació pot produir canvis en els fenotips o en l'expressió els gens, sense alterar però les seqüències de l'ADN. Els assaigs realitzats en aquesta tesi suggereixen que l'ADN metilat seria el responsable d'aquesta activació i/o inactivació de l'haplotip Sf. De fet, s'ha pogut comprovar que quan la seqüència de la Sf-RNasa és metilada, aquesta inactiva l'expressió, així que aquesta inhibició es traduiria en una expressió AC, com és el cas de 'Blanquerna'. En el cas contrari, si la seqüència d'ADN no és metilada, com és el cas de 'Vivot', la RNasa roman activa i a conseqüència la planta és AI.A més, s'ha construït l'estructura en 3D de les RNases dels aŀlels Sf, S23 i S8 mitjançant tècniques bioinformàtiques. La principal diferència trobada ha estat que en l'estructura del Sf hi havia un llaç més llarg que en les altres dues RNases AI. En la bibliografia s'ha descrit que els llaços grans són susceptibles a la degradació proteòlica, pel que aquest mateix fenomen podria passar en aquestes RNases. / El almendro, Prunus amygdalus Batsch, es una especie diploide que pertenece al género Prunus. Aunque la autoincompatibilidad (AI) es un carácter importante en el reino vegetal desde el punto de vista evolutivo, la autocompatibilidad (AC) es un caràcter agronómico muy crítico para asegurar la producción. De este modo, la AC se ha convertido en uno de los principales objetivos de los programas de mejora de almendro en todo el mundo. Aunque la AC ha sido identificada en algunas variedades de almendro, es muy poco frecuente.Los métodos que se han utilizado para determinar la AC en el almendro son la observación de los tubos polínicos y el cuajado de frutos después de polinizaciones controladas. Sin embargo, las nuevas técnicas moleculares se han ido aplicando cada vez más durante estas dos últimas décadas. De este modo, se ha conseguido determinar el genotipo de las variedades y selecciones de una manera muy rápida y eficaz. La AC ha sido relacionada con la presencia del alelo Sf, el cual pertenece a la serie alélica S, y es dominante sobre los otros alelos de AI.Por ello siempre se había considerado que la AI/AC era un carácter cualitativo. En el transcurso de esta tesis, sólo un 25% de los individuos procedentes del cruzamiento 'Vivot' 􀂯 'Blanquerna' ha sido AC, mucho menos de lo esperado, un 50%. Las dos diferentes versiones del haplotipo Sf, una activa y AI (Sfa) y la otra inactiva y AC (Sfi) han mostrado un mutuo reconocimiento, por lo que la Sfa-RNasa del estilo de 'Vivot' ha impedido el crecimiento del tubo polínico Sfi de 'Blanquerna'. Estos resultados sugieren la presencia de un locus modificador no ligado al locus S, el cual sería responsable del control de la AI/AC en esta población. Aunque últimamente se ha profundizado mucho en el estudio del locus S a nivel molecular, su mecanismo de acción sigue sin estar del todo determinado, por lo que se sugiere que otros genes externos son necesarios en la AI. En esta tesis se han localizado por primera vez en la familia de las rosáceas dos nuevos loci situados fuera del locus S, los cuales se encuentran en el grupo 6 y 8. Con estos resultados, podríamos sugerir que la AI es uncarácter cuantitativo y no cualitativo, como se conocía hasta la fecha.Por otro lado, la construcción de una librería genómica (fósmido) en 'Vivot' y 'Blanquerna' ha permitido comprobar que tanto las secuencias de las Sf-RNasas como de los SFBf eran completamente idénticas, a pesar de tener dos expresiones tan distintas. Como no ha sido posible encontrar ninguna mutación entre ambos Sf, se ha sugerido la implicación de la metilación del ADN en esta población. La metilación puede producir cambios en los fenotipos o en la expresión de los genes sin alterar las secuencias del ADN. Los ensayos llevados a cabo en esta tesis sugieren que el ADN metilado sería el responsable de la activación y/o inactivación del haplotipo Sf. De hecho, se ha podido comprobar que cuando la secuencia de laSf-RNasa es metilada, ésta inactiva la expresión, por lo que esta inhibición se traduciría en unaexpresión AC, como es el caso de 'Blanquerna'. En el caso contrario, si la secuencia de ADN no es metilada, como es el caso de 'Vivot', la RNasa permanece activa y a consecuencia la planta será AI.Además, se ha construido la estructura en 3D de las RNasas de los alelos Sf, S23 y S8 mediante herramientas bioinformáticas. La principal diferencia encontrada fue que en la estructura del Sf, había un lazo más largo que en las otras dos RNasas AI. En la bibliografía se ha descrito que los lazos grandes son susceptibles a la degradación proteólica, por lo que este mismo fenómeno podría estar pasando en estas RNasas. / Almond, Prunus amygdalus Batsch, is a diploid species of the genus Prunus. Although self-incompatibility (SI) is an important trait in plants from the evolutionary point of view, self-compatibility (SC) is a critical agronomic trait in order to ensure the production of an economic crop. Thus, SC has become one of the main objectives worldwide of almond breeding programmes. SC has been identified in several almond cultivars, although it happens rarely. Traditionally tests of pollen tube growth and fruit set after controlled pollinations have been carried out for determining SC cultivars in almond. However, molecular methods have been developed in the last two decades to speed up the genotype determination in cultivars and selections in order to facilitate orchard management and breeding processes. SC has been sofar only related with the presence of the Sf allele, allelic with the S series of SI alleles and dominant over SI. As a consequence, SC/SI has always been considered as a qualitative trait,controlled by a single multi-allelic locus, called the S-locus.The presence of SC of the seedling in the family 'Vivot' 􀂯 'Blanquerna' has been 25%, much less than expected, 50%. The two different versions of the Sf haplotype, one active and being SI (Sfa) and the other inactive thus being SC (Sfi), have shown the recognition of the Sfi-pollen tubes of 'Blanquerna' by the Sfa-RNase of 'Vivot'. These results suggest the presence of a modifier locus unlinked to the S-locus which would control the SI/SC recognition mechanism. The molecular nature of the S-locus has been widely studied in many species. Although the S-locus encodes genes determining the S-specificity, other non-Sspecific genes or modifier genes are required for the S-RNase-based SI reaction. Two additional loci located outside the S-locus are here described for the first time in the rosaceous family. Thus, we may suggest that SI is a quantitative trait rather than a qualitative one.In addition, the construction of a fosmid library in 'Vivot' and 'Blanquerna' has allowed to confirm that the alignment of their Sf-RNases and SFBf were identical. As it was not possible to find any difference between both versions of the Sf haplotype, it was decided to further investigate about DNA methylation, which is involved in changes in phenotype or gene expression caused by mechanisms other than changes in the DNA sequence. Thus, our experiments have allowed suggesting that DNA methylation could be responsible of the activation/inactivation of the Sf haplotype. In fact, when the Sf-RNase sequence is methylated,an inhibition of the expression takes place, as it happens in 'Blanquerna'. Thus, this nactivation would be traduced into self-compatibility. In the case of Sf-RNase sequences with non-methylated cytosines, as it happens in 'Vivot', the RNase would remain active and, as a consequence, it would be self-incompatible.On the other hand, we have constructed the three-dimensional structures of the almond Sf, S23 and S8 RNases trough molecular modelling tools. The main structural difference found between all RNases was that the Sf structure showed an extended looping region. The amino acid residues forming this long loop could be prone to degradation and/or inactivation and as aconsequence this Sf-RNase could be less stable and thus would allow its pollen tube growthtrough its own pistil.

L’auto-incompatibilité (AI) est la capacité génétiquement déterminée d’une plante fertile de rejeter son propre pollen. Chez les Solanacées l’AI dépend des éléments d’un locus fort complexe (locus S) multigénique. L’élément du locus-S exprimé dans le pistil est une ribonucléase (S-RNase) dont le rôle est de dégrader l’ARN chez le pollen self, tandis que l’élément du locus S exprimé dans le pollen est un ensemble de protéines du type F-box, qui sont normalement impliquées dans la dégradation des protéines. Cependant, comment les S-RNases self restent actives lors des croisements incompatibles et comment les S-RNases non-self sont inactivées lors des croisements compatibles ce n’est encore pas clair. Un modèle propose que les S-RNases non-self soient dégradées lors des croisements compatibles. Un autre modèle propose que toutes les S-RNases, self et non-self, soient d'abord séquestrées à l’intérieur d’une vacuole, et elles y resteraient lors des croisements compatibles. Lors de croisements incompatibles, par contre, elles seraient relâchées dans le cytoplasme, où elles pourront exercer leur action cytotoxique. Notre étude tente de répondre à ces questions. Notamment, nous cherchons à mettre en évidence la localisation vacuolaire et/ou cytoplasmique des S-RNases et leur concentration par immunolocalisation, en utilisant un anticorps ciblant la S11-RNase de Solanum chacoense et la microcopie électronique à transmission. Nos résultats montrent que la densité de marquage observée pour les S-RNases cytoplasmiques est significativement plus haute dans les tubes incompatibles que dans ceux compatibles ce qui nous indique que pour qu’un tube pollinique soit compatible il doit contenir une faible densité de S-RNase cytoplasmique. / Self-incompatibility (SI) is a widespread genetic device used by flowering plants to reject their own pollen, and thus to avoid inbreeding. This cell-cell recognition mechanism is mediated by molecular interactions between gene products expressed in the pollen and those expressed in specialized cells of the pistil. The genetic determinants of the system are produced from a highly complex multigenic S-locus with multiple S-haplotypes, although other genes outside the S-locus also contribute to the phenomenon in a non-allele specific manner. SI discriminates between self and non-self pollen, as the former will be rejected (incompatible cross), whereas the latter will be allowed to accomplish fertilization (compatible cross). In the Solanaceae (to which Solanum chacoense belongs) the pistillar determinant to SI is an extremely polymorphic stylar extracellular S-RNase, whereas the pollen determinant involves the collaborative action of several members of the F-box family (SLF or S-locus F-box). This has led to the hypothesis that during compatible crosses, ubiquitin-mediated degradation of non-self S-RNases takes place (degradation model). However, it has also been found that non-self S-RNases appear to be sequestered in the vacuole during compatible crosses (sequestration model). The objective of our study was to discriminate between these two models by using immunolocalization techniques and transmission electron microscopy. We have found that the concentration of S-RNases is significantly higher in incompatible pollen tubes than in compatible ones.

L’auto-incompatibilité (AI) est la capacité génétiquement déterminée d’une plante fertile de rejeter son propre pollen. Chez les Solanacées l’AI dépend des éléments d’un locus fort complexe (locus S) multigénique. L’élément du locus-S exprimé dans le pistil est une ribonucléase (S-RNase) dont le rôle est de dégrader l’ARN chez le pollen self, tandis que l’élément du locus S exprimé dans le pollen est un ensemble de protéines du type F-box, qui sont normalement impliquées dans la dégradation des protéines. Cependant, comment les S-RNases self restent actives lors des croisements incompatibles et comment les S-RNases non-self sont inactivées lors des croisements compatibles ce n’est encore pas clair. Un modèle propose que les S-RNases non-self soient dégradées lors des croisements compatibles. Un autre modèle propose que toutes les S-RNases, self et non-self, soient d'abord séquestrées à l’intérieur d’une vacuole, et elles y resteraient lors des croisements compatibles. Lors de croisements incompatibles, par contre, elles seraient relâchées dans le cytoplasme, où elles pourront exercer leur action cytotoxique. Notre étude tente de répondre à ces questions. Notamment, nous cherchons à mettre en évidence la localisation vacuolaire et/ou cytoplasmique des S-RNases et leur concentration par immunolocalisation, en utilisant un anticorps ciblant la S11-RNase de Solanum chacoense et la microcopie électronique à transmission. Nos résultats montrent que la densité de marquage observée pour les S-RNases cytoplasmiques est significativement plus haute dans les tubes incompatibles que dans ceux compatibles ce qui nous indique que pour qu’un tube pollinique soit compatible il doit contenir une faible densité de S-RNase cytoplasmique. / Self-incompatibility (SI) is a widespread genetic device used by flowering plants to reject their own pollen, and thus to avoid inbreeding. This cell-cell recognition mechanism is mediated by molecular interactions between gene products expressed in the pollen and those expressed in specialized cells of the pistil. The genetic determinants of the system are produced from a highly complex multigenic S-locus with multiple S-haplotypes, although other genes outside the S-locus also contribute to the phenomenon in a non-allele specific manner. SI discriminates between self and non-self pollen, as the former will be rejected (incompatible cross), whereas the latter will be allowed to accomplish fertilization (compatible cross). In the Solanaceae (to which Solanum chacoense belongs) the pistillar determinant to SI is an extremely polymorphic stylar extracellular S-RNase, whereas the pollen determinant involves the collaborative action of several members of the F-box family (SLF or S-locus F-box). This has led to the hypothesis that during compatible crosses, ubiquitin-mediated degradation of non-self S-RNases takes place (degradation model). However, it has also been found that non-self S-RNases appear to be sequestered in the vacuole during compatible crosses (sequestration model). The objective of our study was to discriminate between these two models by using immunolocalization techniques and transmission electron microscopy. We have found that the concentration of S-RNases is significantly higher in incompatible pollen tubes than in compatible ones.