Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El potencial de autorenovación y diferenciación multilinaje ha generado expectativas respecto del uso de células madres mesenquimales (CMM) para ingeniería tisular y medicina regenerativa. En este sentido es relevante evaluar el potencial de manipulación genética de las CMM. El objetivo del presente estudio fue determinar la eficiencia de transfección del plásmido pTracer/CMV/Bsd mediante la utilización de Lipofectamina LTX en CMM aisladas desde medula ósea bovina. CMM aisladas desde médula ósea de fetos bovinos (7-9 meses de gestación, n=3) mediante adherencia al plástico, fueron cultivadas en presencia de una combinación en concentraciones crecientes de pTracer/CMV/Bsd (250, 500 y 750 ng) y de Lipofectamina LTX (1, 1.5, 2, 3, 4.5, 6, 9, 12 μl/ml). Luego de 24 horas, el número de CMM positivas a la proteína de fluorescencia verde (GFP) fue determinado por conteo visual mediante microscopía de epifluorescencia y confirmado por citometría de flujo. Los niveles de mRNA de GFP en CMM fueron determinados mediante PCR cuantitativo (Q-PCR). La utilización de 750 ng/ml de pTracer/CMV/Bsd y 9 μl/ml de Lipofectamina LTX permitieron alcanzar una mayor proporción de células positivas a GFP (15,7%, P<0,05). La concentración mínima efectiva de blasticidina fue de 2 μg/ml. Cultivos de CMM transfectadas y seleccionadas con blasticidina por 21 días, generaron escasas colonias de CMM positivas a GFP. Estas células expresaron mRNA de GFP con un valor CT de 9,94. En conclusión, a pesar de presentar una baja eficiencia de transfección, es posible incorporar de manera estable el plásmido pTracer/CMV/Bsd utilizando Lipofectamina LTX en CMM bovinas fetales. / The self-renewal and multilineage differentiation potential has generated expectations for the potential use of mesenchymal stem cells (MSC) in tissue engineering and regenerative medicine. In this respect, it is relevant to evaluate the potential for genetic manipulation of MSC. The main objective of the present study was to determine the transfection efficiency of the plasmid pTracer/CMV/Bsd using Lipofectamine LTX in bovine bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC). MSC were isolated from bone marrow collected from bovine fetuses (7-9 months of gestation, n=3), based on the capacity to adhere to plastic culture flasks. Thereafter, MSC were cultured in presence of a combination of increasing concentrations of pTracer/CMV/Bsd (250, 500 y 750 ng) and Lipofectamine LTX (1, 1.5, 2, 3, 4.5, 6, 9, 12 μL/mL). After 24 hours, the number of GFP-positive MSC was determined by visual counting using an epifluorescense microscope and corroborated by flow cytometry. The levels of GFP mRNA were determined by quantitative PCR (Q-PCR). The use of 750 ng/mL of pTracer/CMV/Bsd and 9 μL/mL of Lipofectamina LTX allowed to achieve the highest proportion of GFP-positive MSC (15.7%, P<0.05). The lowest effective blasticidin concentration was of 2 μg/mL. Culture of transfected MSC and selection for 21 days using blasticidin resulted in reduced number of isolated GFP-positive MSC colonies. These cells expressed a GFP mRNA with a CT value of 9.94. In conclusion, despite the low transfection efficiency, it is possible to incorporate a pTracer/CMV/Bsd plasmid using Lipofectamine LTX in MSC isolated from bovine fetuses. / Proyecto Fondecyt 11100205

Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / Las células madre mesenquimales (Mesenchymal Stem Cells, MSC) son células con capacidad de auto renovación y potencial de diferenciación hacia linajes celulares mesodérmicos incluyendo el linaje miogénico. Éste último, no ha sido demostrado en la especie bovina, a pesar de su utilidad en este modelo de animales de abasto. El objetivo del presente estudio fue evaluar el efecto del medio comercial SKGM-2 Bullet kit como inductor de diferenciación miogénica en MSC bovinas, derivadas de médula ósea fetal. Las MSC fueron aisladas desde médula ósea de un feto bovino (7-9 meses de gestación) y posteriormente fueron cultivadas en medio de diferenciación SKGM-2 Bullet kit por 21 días. La expresión de marcadores músculo-específicos (MYF5, MYF6, MYOD1, MYOG y DES) fue analizada en MSC durante el proceso de diferenciación mediante PCR cuantitativo (Q-PCR) e inmunofluorescencia. Se detectó un aumento (P<0,05) de los niveles de mRNA de MYOD1 en MSC expuestas a medio de diferenciación los días 7 y 21 de cultivo. En forma similar, se detectó un aumento (P<0,05) de los niveles de mRNA de MYOG y DES en MSC diferenciadas los días 7, 14 y 21 de cultivo. En comparación, los niveles de mRNA de MYF5 y MYF6 no fueron distintos (P>0,05) en MSC diferenciadas en relación al día 0 para los días de cultivo. Adicionalmente, las proteínas de MYF5 y DES fueron inmunodetectadas en cultivos de MSC el día 21 de diferenciación. En conclusión, las MSC fetales bovinas expuestas al medio SKGM-2 Bullet kit alcanzaron un estado intermedio o tardío de diferenciación miogénica caracterizado por un patrón de expresión de marcadores músculo-específicos similar a la etapa de mioblasto temprano. / Mesenchymal stem cells (MSC) possess the capacity of self-renewal and differentiation into mesodermal lineages including myogenic. This myogenic differentiation potential of bovine MSC has not been demonstrated despite its usefulness for the study of this livestock animals model. The aim of this study was to evaluate the effect of commercial media SKGM-2 Bullet kit as a myogenic differentiation inducer in MSC derived from fetal bovine bone marrow. MSC were isolated from bone marrow derived from one bovine fetus (7-9 months of gestation) and were cultured in SKGM-2 Bullet kit differentiation media for 21 days. Gene expression of muscle-specific markers (MYF5, MYF6, MYOD1, MYOG and DES) was analyzed in differentiating MSC by quantitative PCR (Q-PCR) and immunofluorescence. An increase (P<0.05) in mRNA levels of MYOD1 days 7 and 21 of culture. Similarly, an increase in mRNA levels of MYOG and DES was detected in differentiating MSC at days 7, 14 and 21of culture compared to day 0. In comparison, levels of mRNA of MYF5 and MYF6 were not different (P>0,05) in differentiating MSC compared to day 0 during all the culture period. Additionally, MYF5 and DES were immunodetected in differentiated MSC at day 21 of culture. In conclusion, bovine fetal MSC exposed to the SKGM-2 Bullet kit media achieved an intermediate/late stage of myogenesis, characterized by a pattern of muscle-specific marker expression similar to the stage of early myoblast. / Financiamiento: Proyecto Vid Enlace Universidad de Chile 69975 2014.