Memoria para optar al Título Profesional de Médico Veterinario / El potencial de autorenovación y diferenciación multilinaje ha generado expectativas respecto del uso de células madres mesenquimales (CMM) para ingeniería tisular y medicina regenerativa. En este sentido es relevante evaluar el potencial de manipulación genética de las CMM. El objetivo del presente estudio fue determinar la eficiencia de transfección del plásmido pTracer/CMV/Bsd mediante la utilización de Lipofectamina LTX en CMM aisladas desde medula ósea bovina. CMM aisladas desde médula ósea de fetos bovinos (7-9 meses de gestación, n=3) mediante adherencia al plástico, fueron cultivadas en presencia de una combinación en concentraciones crecientes de pTracer/CMV/Bsd (250, 500 y 750 ng) y de Lipofectamina LTX (1, 1.5, 2, 3, 4.5, 6, 9, 12 μl/ml). Luego de 24 horas, el número de CMM positivas a la proteína de fluorescencia verde (GFP) fue determinado por conteo visual mediante microscopía de epifluorescencia y confirmado por citometría de flujo. Los niveles de mRNA de GFP en CMM fueron determinados mediante PCR cuantitativo (Q-PCR). La utilización de 750 ng/ml de pTracer/CMV/Bsd y 9 μl/ml de Lipofectamina LTX permitieron alcanzar una mayor proporción de células positivas a GFP (15,7%, P<0,05). La concentración mínima efectiva de blasticidina fue de 2 μg/ml. Cultivos de CMM transfectadas y seleccionadas con blasticidina por 21 días, generaron escasas colonias de CMM positivas a GFP. Estas células expresaron mRNA de GFP con un valor CT de 9,94. En conclusión, a pesar de presentar una baja eficiencia de transfección, es posible incorporar de manera estable el plásmido pTracer/CMV/Bsd utilizando Lipofectamina LTX en CMM bovinas fetales. / The self-renewal and multilineage differentiation potential has generated expectations for the potential use of mesenchymal stem cells (MSC) in tissue engineering and regenerative medicine. In this respect, it is relevant to evaluate the potential for genetic manipulation of MSC. The main objective of the present study was to determine the transfection efficiency of the plasmid pTracer/CMV/Bsd using Lipofectamine LTX in bovine bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSC). MSC were isolated from bone marrow collected from bovine fetuses (7-9 months of gestation, n=3), based on the capacity to adhere to plastic culture flasks. Thereafter, MSC were cultured in presence of a combination of increasing concentrations of pTracer/CMV/Bsd (250, 500 y 750 ng) and Lipofectamine LTX (1, 1.5, 2, 3, 4.5, 6, 9, 12 μL/mL). After 24 hours, the number of GFP-positive MSC was determined by visual counting using an epifluorescense microscope and corroborated by flow cytometry. The levels of GFP mRNA were determined by quantitative PCR (Q-PCR). The use of 750 ng/mL of pTracer/CMV/Bsd and 9 μL/mL of Lipofectamina LTX allowed to achieve the highest proportion of GFP-positive MSC (15.7%, P<0.05). The lowest effective blasticidin concentration was of 2 μg/mL. Culture of transfected MSC and selection for 21 days using blasticidin resulted in reduced number of isolated GFP-positive MSC colonies. These cells expressed a GFP mRNA with a CT value of 9.94. In conclusion, despite the low transfection efficiency, it is possible to incorporate a pTracer/CMV/Bsd plasmid using Lipofectamine LTX in MSC isolated from bovine fetuses. / Proyecto Fondecyt 11100205

Publicación a texto completo no autorizada por el autor / Estandariza la transfección de un cultivo de hemocitos de langostino blanco con el vector de expresión pEGFP-N1 aplicando dos cantidades: de 2 μg y 4μg de plásmido, así como 2 tiempos de exposición: 12 y 24 horas. La realización de la transfección requirió de una amplificación previa del plásmido utilizando la cepa de E. coli DH5α en la que se clonó y luego se confirmó mediante amplificación por PCR obteniendo un amplicón característico de 860 pb. Posteriormente, los productos se purificaron, alcanzando altas concentraciones de plásmido y fueron agregados en cultivos primarios de hemocitos utilizando el medio L15 e incubándolos a 28°C. Luego se realizaron las evaluaciones de citotoxicidad producida por la transfección en los hemocitos a diferentes tiempos, así como la presencia del plásmido dentro de las células y la expresión del gen EGFP. Los valores de viabilidad del tratamiento con 2 μg de plásmido por 12 horas de exposición tuvieron mayor similaridad con aquellos mostrados en el tratamiento control, los demás tratamientos mostraron valores reducidos de viabilidad. En todos los tratamientos la viabilidad fue disminuyendo en el tiempo hasta alcanzar valores cercanos al 2%. La presencia del plásmido no pudo ser determinada correctamente en la mayoría de las muestras, sin embargo se detectó hasta las 60 horas después de la transfección. Al analizar la expresión del gen reportero EGFP obtenida de los hemocitos transfectados y el control se obtuvo el valor más alto entre las 48 y 60 horas, distinguiéndose al tratamiento de 2 μg por 12 horas por poseer una mayor expresión que los demás tratamientos, mas no fue un dato significativo, a su vez no se registró expresión en las muestras control. En conclusión la metodología utilizada fue efectiva ya que se encontró la expresión del gen reportero, además se podría considerar el tratamiento de 2μg por 12 horas como el más efectivo de los 4 evaluados debido a su mayor expresión genética y una menor citotoxicidad comparado con los demás tratamientos. / Tesis

Diseña y analiza la generación de VLPs con membrana lipídica para un Adenovirus, que no posee membrana. Aprovecha la capacidad que tienen las principales proteínas estructurales del virus de la enfermedad de Newcastle (NDV), de tomar parte de la membrana del hospedero y autoensamblarse en viriones, para generar VLPs con envoltura conteniendo a la proteína Fibra-2 de FAdV-4. El primer paso es estandarizar la técnica de transfección con polietilenimina de 25 kDa (PEI25) en células DF-1. La eficiencia media máxima de transfección, medida en porcentaje de células que expresan EGFP, fue de 61.07%, la cual se obtiene utilizando 0.53 μg DNA más 1.59 μg de PEI25 por cm2 de células sembradas en monocapa. Luego, se expresa simultáneamente las proteínas Matriz (M) y Nucleoproteína (N) de NDV, con la proteína quimérica hnFib2. Esta última compuesta de la proteína Fibra-2 de FAdV-4 fusionada en su extremo N-terminal a los dominios citoplasmático y transmembrana de la proteína Hemaglutinina-Neuraminidasa (HN) de NDV, permitiendo la interacción de la Fibra-2 con la proteína M lo que facilita el ensamblaje de los viriones. Los VLPs purificados son evaluados por Western blot, obteniéndose bandas de ~40 kDa y ~55kDa positivas a suero anti-NDV correspondientes a las proteínas M y N, respectivamente; y a suero anti epítope CDSATMGNRPGDLNS de Fibra-2 obteniendo una banda de ~63 kDa. Esta investigación es el primer trabajo de la obtención de VLP para FAdV, dando un paso importante en el desarrollo de la siguiente generación de vacunas contra este patógeno. Estos VLP necesitan ser probados a nivel inmunológico para determinar su eficiencia como vacuna candidata contra FAdV-4. / Tesis