Submitted by Ana Maria Fiscina Sampaio (fiscina@bahia.fiocruz.br) on 2014-05-22T16:45:28Z No. of bitstreams: 1 Rodrigo de Araujo Silva. Avaliação.. 2013.pdf: 704260 bytes, checksum: 65c652d8db75845b4afbf79b59d83a94 (MD5) / Made available in DSpace on 2014-05-22T16:45:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Rodrigo de Araujo Silva. Avaliação.. 2013.pdf: 704260 bytes, checksum: 65c652d8db75845b4afbf79b59d83a94 (MD5) Previous issue date: 2013 / Fundação Oswaldo Cruz. Centro de Pesquisa Gonçalo Moniz. Salvador, BA, Brasil / A leishmaniose visceral (LV) é atualmente um grande problema de saúde pública, tendo o cão como seu principal reservatório em áreas urbanas. O controle da enfermidade é baseado no diagnóstico e eutanásia de cães infectados por Leishmania infantum que apresentam soropositividade para infecção. Como tentativa de conter o aumento do número de casos de LV canina (LVC), duas vacinas comerciais vêm sendo empregadas como medida de controle. Os testes diagnósticos preconizados pelo Ministério da Saúde no Brasil para identificação da infecção em cães é o teste sorológico rápido (DPPLVC ©) como triagem e ELISA (EIA-Biomanguinhos) como confirmatório. Estes métodos não foram desenvolvidos para diferenciar cães vacinados e infectados. Assim, animais que se tornam sorologicamente positivos em razão da vacinação podem vir a ser eutanasiados. Sete antígenos recombinantes foram previamente selecionados a partir de bibliotecas de cDNA e DNA utilizando soros de homens e cães infectados por L. infantum e foram empregados no presente estudo para terem sua reatividade testada contra soros de animais vacinados, utilizando o teste de triagem multi antigen print imunoassay (MAPIA). Primeiramente, esses antígenos recombinantes foram produzidos a partir da transformação de Escherichia coli (BL21(DE3)pLysS) com construções em plasmídeo pRSET, contendo cauda de histidina. Os sedimentos bacterianos contendo os sete antígenos recombinantes previamente selecionados foram purificados por cromatografia de afinidade. No presente estudo, foi utilizado um conjunto de soros de cães sem raça definida que foram vacinados com LEISHMUNE® (n = 28) ou Leish- Tec® (n = 30) e, cumpriram os critérios de inclusão (negativos para Leishmania em ELISA, cultura e qPCR). Assim, foi avaliada a reatividade desses soros frente ao antígeno bruto, utilizando ELISA, e aos sete antígenos recombinantes de L. infantum, utilizando o MAPIA. Em relação à reatividade ao antígeno bruto, 43,3% (13/30) dos soros de cães vacinados com Leish-Tec® e 96,4% (27/28) dos soros de cães vacinados com LEISHMUNE® testaram positivo no ELISA. Além disso, em relação à reatividade aos antígenos recombinantes, 54% dos soros de cães vacinados com LEISHMUNE® identificaram pelo menos uma das três proteínas rLci1A, rLci2B ou rLci12A-II, enquanto que 77% dos soros de cães vacinados com Leish-Tec® identificaram pelo menos uma das duas proteínas rLci6A-I ou rLci12A-II. Como em estudo anterior, identificamos que rLci1A, rLci2B e rLci12A-II foram altamente reconhecidas por soros de cães infectados com LVC, as análises de positividade contra os soros de animais vacinados foram também realizadas sem considerar essas proteínas. Assim, a reatividade dos soros de cães vacinados, sem considerar as proteínas rLci1A, rLci2B e rLci12A-II, identificadas como candidatas promissoras para comporem um teste para o diagnóstico de LVC, mostrou que o conjunto formado pelos antígenos rLci6A-I, rLci7A ou rLci10A-II foram reconhecidos por 70% dos soros de cães vacinados com Leish- Tec® e apenas 4% de cães vacinados com LEISHMUNE®. Em resumo, esse conjunto de antígenos recombinantes de L. infantum (rLci6A-I + rLci7A + rLci10A-II) não permitiu a diferenciação dos soros de cães vacinados com LEISHMUNE® de cães infectados, porém, permitiram a diferenciação dos soros de cães vacinados com Leish- Tec® de cães infectados, empregando a técnica do MAPIA / Visceral leishmaniasis is currently a major public health problem, and the dog the main reservoir in urban areas. The control of the disease is based on the diagnosis and euthanasia of all Leishmania infantum-infected dogs showing seropositivity to infection. In attempt to contain the increase in the number of cases of canine visceral leishmaniasis (CVL), two commercial vaccines have been employed as a measure of prophylaxis. The diagnostic tests recommended by the Brazilian Ministry of Health to identify the infection in dogs are the rapid test DPP-LVC© for screening and EIABiomanguinhos to confirm. Serological methods currently used are not able to differentiate infected from vaccinated dogs, resulting in the euthanasia of animals that become serologically positive due to vaccination. Seven recombinant antigens were previously screened from a cDNA and DNA library using sera from Leishmania infantum-infected human and dogs and employed in this study to have their reactivity tested against sera from vaccinated dogs using the screening test multi antigen print imunoassay MAPIA. Selected fragments were produced using Escherichia coli (BL21 (DE3) pLysS), which were transformed with plasmid constructions in pRSET with a histidine tag. The recombinant antigens were purified by affinity chromatography. Dogs tested negative for Leishmania in ELISA, culture and qPCR were vaccinated with LEISHMUNE® (n= 28) or Leish-Tec® (n= 30). Reactivity of serum from 58 vaccinated dogs was assessed against a set of seven recombinant antigens of L. infantum, using MAPIA. The results using in house ELISA diagnostic test containing crude L. infantum as antigen showed that 43.3% (13/30) of sera from Leish-Tec® vaccinated dogs and 96.4% (27/28) of sera from Leishmune® vaccinated dogs tested positive. In addition, it was observed that 54% of sera from Leishmune® vaccinated dogs identified at least one of the three proteins, rLci1A, rLci2B or rLci12A-II, whereas 77% of the sera from Leish-Tec® vaccinated dogs identify at least one of the two proteins, rLci6A-I or rLci12A-II. Since in a previous study we found that rLci1A, rLci2B, and rLci12A-II shown to be highly recognized by sera from dogs with CVL, analysis of positivite reactivity against serum of vaccinated dogs were also performed without considering these proteins. Therefore, 70% of sera from Leish-Tec® vaccinated dogs recognized at least one of the recombinant proteins rLci6A-I, rLci7A or rLci10A-II. However, the percentage of sera from Leishmune® vaccinated dogs that recognized other recombinant proteins than rLci1A, rLci2B, and rLci12A-II did not exceed 4%. In summary, a set of recombinant antigens from L. infantum used in this study did not allow the differentiation of sera from LEISHMUNE® vaccinated dogs and those from infected dogs, however, together the recombinant antigens, rLci6A-I, rLci7A and rLci10A-II of L. infan,tum allowed the differentiation of sera from Leish-Tec® vaccinated dogs from those of infected dogs, employing the technique of MAPIA.