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京都大学 / 0048 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第21000号 / 医博第4346号 / 新制||医||1027(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 岩井 一宏, 教授 中川 一路, 教授 伊達 洋至 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

In T cells, signalling events initiated at the immunological synapse by T cell receptor (TCR) have been already thoroughly studied. In contrast, signalling pathways involved in MHCII-mediated signal transduction on the APC side of this structure are still rather poorly understood. Transmembrane adaptor proteins (TRAPs) are a class of proteins with an essential role in signalling triggered by TCR and other immunoreceptors. So far no TRAPs involved in MHCII signalling have been identified. In this work a new TRAP, highly enriched in the immunological synapse in APCs is described and termed Nvl. Nvl is expressed exclusively in professional antigen presenting cells - B cells, monocytes/macrophages and dendritic cells, and the level of its expression positively correlates with the expression of MHCII. Nvl is present in tetraspanin microdomains and together with tetraspanins it is localized to the polarized structures of the cell, including uropod, cleavage furrow, and, most interestingly, the immunological synapse. The presence in the immunological synapse indicates possible role for Nvl in MHCII- mediated signal transduction. Indeed, Nvl becomes tyrosine-phosphorylated after stimulation via MHCII, although strong phosphorylation has also been observed after FcγR stimulation or treatment with...

Antigen presentation during which antigen fragments in complex with MHC glycoproteins are recognized by T cell antigen-specific receptors is necessary for the initiation of adaptive immune response. During this process, immunological synapse is assembled at the site of contact between the T cell and the antigen-presenting cell (APC). This leads to the activation of receptors on the surface of both cells followed by triggering of multiple signaling pathways. However, our knowledge about the signaling occurring at the APC-side of the IS is limited in comparison to the T cell side. Here, we analyze role of Src family kinases in the APC signaling pathways. For this purpose, constructs targeting Csk kinase to the plasma membrane of APCs were prepared to inhibit SFKs there. We show that expression of these constructs inhibits activation of SFKs, calcium mobilization and cell activation of K46 B cell line. Further, expression of these constructs in hematopoietic progenitors attenuates their differentiation into dendritic cells which then results in their decreased ability to stimulate T cells.

Les cellules présentatrices d'antigène (CPAs) font le lien entre le système immunitaire inné et adaptatif en présentant des antigènes (Ags) étrangers aux cellules T CD4+. Pour être efficace, cette présentation nécessite que les Ags soient apprêtés et chargés de manière adéquate dans le sillon des molécules du complexe majeur d'histocompatibilité de classe II (CMHII). C'est uniquement dans ce contexte que les cellules T CD4+, via leur récepteur (TCR), peuvent reconnaître l'Ag et engager pleinement la réponse immunitaire adaptative. Ce processus doit être finement contrôlé pour diminuer les risques de réaction auto- immune. L'expression de CMHII est régulée à la fois au niveau transcriptionnel par le trans- activateur du CMHII (CIITA) et au niveau post-traductionnel via l’ubiquitination d'un seul résidu de lysine, situé dans la queue cytoplasmique de sa chaîne b. Dans les cellules dendritiques (DCs) et les cellules B, cette ubiquitination est dépendante de la E3 ubiquitine ligase MARCH1. La baisse d’expression de MARCH1 contribue à l'acquisition de propriétés immuno-stimulatrices qui accompagnent la maturation des DCs humaines. De plus, il a été démontré que l'absence d'ubiquitination du CMHII entraîne son accumulation excessive au niveau de la membrane plasmique, ce qui perturbe les radeaux lipidiques et les réseaux de tétraspanines chez les DCs de souris. Ces structures membranaires sont connues pour interagir avec des molécules de signalisation régulant de nombreux processus biologiques dans les cellules B, comme le récepteur des cellules B (BCR) et CD19. De surcroît, dans les cellules B naïves, les molécules de CMHII sont fortement exprimées à la surface cellulaire, même si elles sont constitutivement ubiquitinées par MARCH1. Il est également intéressant de noter que les lymphocytes B présentent l'expression la plus élevée de MARCH1 parmi toutes les cellules immunitaires et que cette expression augmente au cours de leur développement. L'impact qu’a l’ubiquitination des molécules de CMHII à la surface membranaire des lymphocytes B sur leur développement, leur activation et leurs fonctions n'a pas encore été pleinement étudié. Ici, nous montrons d'abord que l'absence d'ubiquitination du CMHII modifie fortement le pool de cellules B de la zone marginale (MZBs). Nous soutenons que cette altération peut résulter en partie de la protéotoxicité du CMHII sur les réseaux de tétraspanines contenant CD81, ce qui influe sur la dynamique de CD19 à la surface cellulaire et affecte sa capacité à activer la cascade PI3K / Akt induite par les signaux BCR dits « toniques ». L’altération du pool de cellules MZBs a également des répercussions sur la réponse immunitaire aux Ags T-indépendants de type 2 (TI-2 Ags) et sur la formation de centre germinatifs (GCs) dans la rate. Ensemble, ces effets atténuent la réponse humorale et peuvent conférer un effet protecteur contre les infections. Par exemple, nous montrons ici que les infections parasitaires à Leishmania donovani, dont l’établissement nécessite la présence de cellules B pleinement fonctionnelles, sont beaucoup mieux contrôlées en l’absence de MARCH1. Ces résultats démontrent qu’un contrôle fin de l'expression de surface du CMHII est nécessaire pour l'établissement d'un pool de cellules B variées et pleinement fonctionnelles pouvant répondre à une large gamme d'Ags. En second lieu, nous avons décrit une approche expérimentale que nous avons adaptée pour produire des outils moléculaires permettant d’identifier des partenaires d’interaction potentiels de MARCH1 dans des lignées cellulaires et des cellules B primaires. Cette approche repose sur la production de protéine de fusion qui pourront être utilisées dans des tests de liaison de proximité (BioID2). Ce projet a permis de mettre en lumière les effets importants de l'ubiquitination du CMHII sur le développement, l'activation et les fonctions des lymphocytes B. Il a également permis d’établir des bases solides pour de futures études sur de nouvelles cibles de MARCH1 qui permettront de mieux comprendre les effets biologiques de cette E3 ubiquitine ligase et leurs impacts sur la santé et les maladies. / Antigen-presenting cells (APCs) link the innate and adaptive immune system by presenting foreign antigens to CD4+ T cells. To be efficient, this presentation requires antigens to be adequately processed and loaded in the peptide groove of the major histocompatibility complex class II (MHCII) molecules. It's solely in this context that CD4+ T cells, via their T cell receptor (TCR), can recognize the antigen and fully engage the adaptative immune response. This process needs to be tightly regulated to avoid autoimmunity. MHCII expression is regulated both transcriptionally by the MHCII transactivator (CIITA) and post- translationally by ubiquitination of a single lysine residue located in the cytoplasmic tail of its b-chain. This is carried out by the MARCH1 E3 ubiquitin ligases in dendritic cells (DCs) and B cells. The down-regulation of MARCH1 contributes to the acquisition of potent immunostimulatory properties that coincides with the maturation of human DCs. Accordingly, the lack of MHCII ubiquitination has been shown to result in its excessive accumulation at the plasma membrane and in the disruption of lipid rafts and tetraspanin webs in mice DCs. These membrane structures are known to interact with signaling molecules that regulate numerous biological processes in B cells, such as the B cell receptor (BCR) and CD19. Moreover, in naïve B cells, MHCII molecules are highly expressed at the cell surface even if they are constitutively ubiquitinated by MARCH1. Interestingly, B lymphocytes exhibit the highest expression of MARCH1 among all immune cells and this expression is increasing during B cells development. The impact of the ubiquitin-dependent MHCII turnover on B lymphocytes development, activation, and functions have yet to be fully addressed. Here, we first show that the absence of MHCII ubiquitination strongly alter the marginal zone (MZ) B cell pool. We provide evidence that this alteration may in part be due to the previously described MHCII proteotoxicity on the CD81-containing tetraspanin web, which impacted CD19 surface dynamic and its capacity to activate the PI3K/Akt cascade during “Tonic” BCR signaling. The altered MZ B cell pool also affected the immune response to a type 2 T-independent antigen (TI-2 Ag) and the germinal center (GC) reaction in the spleen, which dampens humoral response and may confer a protective effect against infections. As per example, we show here that parasitic infections with Leishmania donovani, the establishment of which requires the presence of fully functional B cells, are better controlled in the absence of MARCH1. These results demonstrate the need for a tight control over MHCII surface expression for the establishment of a varied and fully functional B cell pool, which are mandatory for proper responses to a broad range of antigens. Secondly, we described an experimental approach that we adapted to produce molecular tools that will allow the identification of potential interacting partners of MARCH1 in cell lines and primary B cells. This approach is based on the production of fusion proteins that can be used in proximity binding assays (BioID2). This project shed light on the important effects of MHCII ubiquitination on the development, activation, and function of B lymphocytes. It also laid the groundwork for valuable future studies on novel MARCH1 targets which will provide a better understanding of the biological effects of this E3 ubiquitin ligase and their impact on health and disease.