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It has become increasingly apparent that the misregulation of histone modification actively contributes to cancer. The histone H3 lysine 79 (H3K79) methyltransferase Dot1l has been implicated in the development of leukemias bearing translocations of the Mixed Lineage Leukemia (MLL) gene. We studied the global epigenetic profile for H3K79 dimethylation and found abnormal H3K79 dimethylation profiles exist not only in leukemias driven by MLL-fusion proteins with nuclear partners like AF9, but also in leukemia with MLL-fusions containing cytoplasmic partners like AF6. Genetic inactivation of Dot1l led to downregulation of fusion target genes and impaired both in vitro bone marrow transformation and in vivo leukemia development by MLL-AF10, CALM-AF10 as well as MLL-AF6, suggesting that aberrant H3K79 methylation by DOT1L sustains fusion-target gene expression in MLL rearranged leukemias and CALM-AF10 rearranged leukemias. Pharmacological inhibition of DOT1L selectively killed MLL-AF10 and MLL-AF6 transformed cells but not Hox9/Meis1 transformed cells, pointing to DOT1L as a potential therapeutic target in MLL-rearranged leukemia. We further characterized the DOT1L complex under physiological conditions from human leukemia cells and identified AF10 as a key DOT1L complex component. Given the importance of H3K79 methylation in MLL-rearranged leukemia, we sought to study the role of DOT1L complex component AF10 in H3K79 methylation and MLL leukemia. We generated conditional knockout mice in which the Dot1l-interacting octapeptide-motif leucine-zipper (OM-LZ) domain of Af10 was flanked by LoxP sites. Cre induced deletion of \(Af10^{OM-LZ}\) is predicted to abrogate the Af10-Dot1l interaction. Our histone mass spectrometry data demonstrated that deletion of the endogenous \(Af10^{OM-LZ}\) domain abrogated global H3K79 dimethylation but retained H3K79 monomethylation. Interestingly, bone marrow transformation by MLLAF6 and MLL-AF9 is abrogated by induced deletion of endogenous \(Af10^{OM-LZ}\), while bone marrow transformation by MLL-AF10 and CALM-AF10 is not affected by deletion of endogenous \(Af10^{OM-LZ}\), confirming the importance of Af10-Dot1l interaction in MLL- or CALM fusion-leukemias. Moreover, we showed \(Af10^{OM-LZ}\) deletion prolonged survival of MLL-AF9 leukemia in vivo and led to chromotin compaction and downregulation of MLL fusion targets in MLL-AF9 leukemia. Therefore our results demonstrate a role for Af10 in the conversion of H3K79 monomethylation to dimethylation and reveal the AF10-DOT1L interaction as an attractive therapeutic target in MLL-rearranged leukemias.

Made available in DSpace on 2014-06-12T18:01:07Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo3047_1.pdf: 3228564 bytes, checksum: 23acd94f90ada864423eb7173c3cd7c9 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2010 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A análise citogenética convencional e molecular nas leucemias do lactente (LL) é de fundamental importância para estabelecer alterações cromossômicas e que definem grupos e subgrupos de risco. Este estudo caracterizou alterações cromossômicas em 83 lactentes, oriundos do Centro de Oncohematologia do Hospital Universitário Oswaldo Cruz e Centro de Transplante de Medula Óssea do Instituto Nacional do Cancer (CEMO/INCA) no período de julho/2000 a agosto/2010, sendo 73 casos de leucemias agudas (LA) e 10 de síndrome mielodisplásica (SMD). As Leucemias agudas foram classificadas como leucemia linfoblástica aguda (LLA) (47 casos), leucemia mielóide aguda (LMA) (23 casos) e leucemias ambíguas (3 casos). A idade dos pacientes com leucemia linfoblástica aguda variou de 5 dias a 22 meses, com proporção entre os sexos de 1:1. A idade dos casos de leucemia mielóide aguda variou de 2 a 21 meses, sendo 15 masculinos e 7 femininos. Os subtipos morfológicos foram leucemia mielóide com diferenciação (M2), leucemia mielomonocítica (M4), leucemia mielomonocítica eosinofílica (M4eo), leucemia monoblástica (M5) e leucemia megacarioblástica (M7). O bandeamento G (GBG) revelou anormalidades da região 11q23 em 38% dos casos de leucemia linfoblástica e em 50% dos casos de leucemia mieloblástica. O rearranjo do gene MLL por hibiridização in situ foi observado em 65% e 39% das leucemias linfoblásticas e leucemia mielóide, respectivamente. Nos casos com síndrome mielodisplásicas, a idade variou entre 20 dias a 20 meses, sendo seis do sexo masculino e quatro do feminino. Sete casos foram leucemia mieloblástica em portadores de S.Down, destes seis eram leucemias megacarioblásticas (LMA-K/LMA-M7) e uma leucemia mielóide sem diferenciação (LMA-MO). Todas as leucemias megacarioblásticas tiveram cariótipos complexos com translocações envolvendo o cromossomo 1. Os métodos de Hibridização in situ (FISH), multicolor FISH (M-FISH) e bandeamento cromossômico multicolorido (MCB), foram essenciais nos casos duvidosos pelo GBG, nos cariótipos complexos e nos casos de cromossomos marcadores

京都大学 / 新制・課程博士 / 博士(医学) / 甲第23803号 / 医博第4849号 / 新制||医||1058(附属図書館) / 京都大学大学院医学研究科医学専攻 / (主査)教授 村川 泰裕, 教授 滝田 順子, 教授 小川 誠司 / 学位規則第4条第1項該当 / Doctor of Medical Science / Kyoto University / DFAM

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As sÃndromes mielodisplÃsicas (SMD) representam um grupo heterogÃneo de doenÃas clonais que acometem a cÃlula precursora hematopoÃtica pluripotente, caracterizando-se por baixa contagem de cÃlulas no sangue perifÃrico, displasia em uma ou mais linhagens celulares, hematopoese ineficiente, alÃm do risco aumentado de progressÃo para leucemia mielÃide aguda. Embora a doenÃa possa acometer pacientes de outras faixas etÃrias, Ã mais frequente naqueles com idade avanÃada, com mÃdia ao diagnÃstico de 60 a 75 anos. As anormalidades cromossÃmicas sÃo observadas em aproximadamente 50% de todos os casos de SMD, estando, em alguns casos, relacionadas com achados clÃnicos e morfolÃgicos. O objetivo deste trabalho foi determinar, atravÃs da tÃcnica de FISH (hibridizaÃÃo in situ por fluorescÃncia), a frequÃncia de alteraÃÃes envolvendo os genes MLL, RB e TP53 em pacientes com SMD e associar estas alteraÃÃes com os achados citogenÃticos. Os casos inseridos no estudo foram oriundos do ambulatÃrio de SMD do Hospital UniversitÃrio Walter CantÃdio. Dos 33 pacientes selecionados, 17 pertenciam ao grupo com idade acima de 60 anos. 52% dos pacientes foram classificados, segundo a OMS, como citopenia refratÃria com displasia em mÃltiplas linhagens (CRDM) e 61% estratificados, segundo o IPSS, como de risco intermediÃrio 1 (INT-1). Um total de 78% dos pacientes apresentaram alteraÃÃes citogenÃticas, dentre eles 31% possuÃam cariÃtipos complexos (mais de 3 alteraÃÃes por metÃfase). A tÃcnica de FISH permitiu identificar em 18% dos pacientes alteraÃÃes envolvendo um dos trÃs genes avaliados. TrÃs pacientes apresentaram alteraÃÃo do gene TP53, sendo detectada em dois deles (registros 31 e 6) a deleÃÃo de um Ãnico alelo ou de ambos os alelos do gene, respectivamente, e no terceiro (registro 2), detectou-se a amplificaÃÃo do gene TP53, sendo estas alteraÃÃes nÃo visualizadas atravÃs da citogenÃtica clÃssica, por se tratar de um tÃcnica menos sensÃvel. Detectou-se em 6% dos pacientes (registros 7 e 22) rearranjo do gene MLL, no primeiro a FISH descartou a suposta deleÃÃo do gene alegada pela citogenÃtica, provando que o mesmo estava presente no genoma do paciente, porÃm de forma rearranjada e no segundo a citogenÃtica nÃo conseguiu demonstrar o rearranjo do gene. Quanto ao gene RB, a FISH permitiu identificar apenas um paciente (3%) com deleÃÃo de um dos alelos do gene, sendo esta alteraÃÃo tambÃm nÃo detectada pela citogenÃtica clÃssica. A FISH possibilitou identificar, durante a avaliaÃÃo do gene TP53, dois pacientes (registros 5 e 10) apresentando pelo menos 6 cÃpias extras do cromossomo 17, devendo essa alteraÃÃo se tratar de um pequeno clone hiperdiplÃide detectado parcialmente no primeiro paciente e nÃo detectado no segundo. Nos seis pacientes que apresentaram alteraÃÃo dos genes avaliados, a FISH proveu informaÃÃes que adicionaram, confirmaram ou alteraram o resultado previamente emitido pela citogenÃtica clÃssica, sendo estas uma das principais aplicaÃÃes desta tÃcnica devido sua alta sensibilidade quando comparada ao mÃtodo clÃssico. / Myelodysplastic syndromes (MDS) represent a heterogeneous group of clonal disorders affecting the hematopoietic pluripotent cell, characterized by low cell counts in peripheral blood, dysplasia in one or more cell lines, inefficient hematopoiesis and increased risk of progression to acute myeloid leukemia. Although the disease can affect patients of other age groups, they are more frequent in those with advanced age with an average 60 to 75 years at diagnosis. Chromosomal abnormalities are observed in approximately 50% of all cases of MDS and are related with clinical and morphological findings. The aim of this study was to determine, through the technique of FISH (fluorescence in situ hybridization), the frequency of changes involving the MLL, RB, and TP53 genes in patients with MDS and associate these changes with cytogenetic findings. The cases included in the study were selected in the ambulatory of SMD from University Hospital Walter CantÃdio. Thirty three patients were selected, 17 had aged over 60 years. 52% of patients were classified, according to WHO criteria, as refractory cytopenia with dysplasia in multiple lineages (RCDM) and 61% stratified, according to IPSS, as intermediate risk 1 (INT-1). 78% of patients had abnormalities detected by cytogenetics, among them 31% had complex karyotypes (more than 3 changes per metaphase). 18% of patients had changes at least in one of the three genes valued in this study by FISH. Three patients showed alterations of TP53 gene, being detected in two patients (records 31 and 6) the deletion of a single allele or both alleles of the gene, respectively, and in the third (record 2), we detected amplification of TP53 gene, all this changes were not detected by classical cytogenetics, because it is a less sensitive technique. 6% of patients (records 7 and 22) had rearrangement of MLL gene. In the first case, FISH discarded the gene deletion alleged by cytogenetic, proving that it was present in the genome of the patient, but in a rearranged form, and in the second case cytogenetics failed to demonstrate rearrangement of the gene. For the RB gene, FISH identified only one patient (3%) with deletion of one allele of the gene, and this change was also not detected by classical cytogenetics. During evaluating the TP53 gene, FISH allowed identification of two patients (records 5 and 10) presenting at least six extra copies of chromosome 17, probably representing a small hyperdiploid clone partially detected in the first patient and not detected in the second . In the six patients who showed abnormalities of the genes analyzed, FISH has provided information that added, changed or confirmed the result previously given by classical cytogenetics, which are a major application of this technique due to its high sensitivity compared to the traditional method.

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