Les ARN messagers (ARNm) fonctionnels sont produits au cours d'un mécanisme complexe qui allie la transcription, qui permet la synthèse d'un pré-ARNm, la maturation de ce transcrit et son export. De plus, ces différentes machineries vont devoir faire face à la structure compacte de la chromatine, nécessitant une activité de décondensation/recondensation de la chromatine qui est notamment régulée par les mécanismes épigénétiques. Un très grand nombre de facteurs sont donc requis pour la production des ARNm fonctionnels . Parmi ces facteurs, les protéines Spt6 et Iws1 sont impliquées dans le mécanisme général de la transcription, dans la modulation de la structure de la chromatine et la maturation et l'export des ARNm. Ces travaux de thèse ont permis de caractériser biochimiquement, structuralement et fonctionnellement ces deux protéines, leur complexe et leur interaction avec d'autres effecteurs de la transcription. Ces travaux ont notamment permis de comprendre en termes moléculaires et fonctionnels (i) comment Spt6 est recrutée par l'ARN polyméraseII au cours de la transcription et (ii) comment le complexe Spt6/Iws 1 est formé. Ils ont également permis d'identifier de nouveaux interactants potentiels de Spt6, et notamment le facteur d'élongation de la transcription TFIIS. Ces travaux ont ainsi permis de révéler le rôle essentiel et extrêmement complexe joué par Spt6 et Iws1 lors de la production d'un ARNm, mais également de permettre l'étude future de leur interaction avec d'autres facteurs transcriptionnels. / Production of functional messenger RNA (mRNA) requires a complex mechanism that couples transcription with maturation and export of the mRNA. In addition to this mechanism, chromatin needs to be unwound to allow the transcription machinery access the DNA, this unwinding being also highly regulated. Thus, production of a functional mRNA requires a huge number of factors implicated in these different processes. Among these proteins Spt6 and Iws1 are participating in the mechanism of transcription, chromatin unwinding, and maturation and export of the mRNA. The work carried out during this thesis has enabled the biochemical, structural and functional characterization of these proteins, their complex and their interaction with other effectors of transcription. This work has specifically enabled the molecular and functional characterization (i) of the recruitment of Spt6 by RNA polymerase II and (ii) of the formation of the Spt6/Iws1 complex. Moreover, this work has identified putative new partners of Spt6, not ably the elongation factor TFIIS. Thus, our work has highlighted the essential and complex role of Spt6 and Iws1 during the production of functional mRNA, and has also enabled future studies of the complexes formed by these two proteins with other transcriptional factors.

The recent advances in molecular and computational biology have made possible the study of complicated transcriptional regulatory networks that control a wide range of biological processes and phenotypic traits. In this thesis, several approaches were combined including next generation sequencing, gene expression profiling, chromatin and RNA immunoprecipitation, bioinformatics and genome editing methods in order to characterize the biological significance of the ZBED6 and ZC3H11A genes. A mutation in the binding site of ZBED6, located in an intron of IGF2, disrupts the binding and leads to 3-fold upregulation of IGF2 mRNA in pig muscle tissues. The first part of the thesis presents a detailed functional characterization of ZBED6. Transient silencing of ZBED6 expression in mouse myoblasts led to increased Igf2 expression (~2-fold). ChIP-seq analysis of ZBED6 and histone modifications showed that ZBED6 preferentially binds active promoters and modulates their transcriptional activities (paper I). In the follow-up studies using CRISPR/Cas9 we showed that either the deletion of ZBED6 or its binding site in Igf2 (Igf2ΔGGCT) led to more than 30-fold up-regulation of Igf2 expression in myoblasts. Differentiation of these genetically engineered cells resulted in hypertrophic myotubes. Transcriptome analysis revealed ~30% overlap between the differentially expressed genes in Zbed6-/- and Igf2ΔGGCT myotubes, with significant enrichment of muscle-specific genes. ZBED6-overexpression in myoblasts led to cell cycle arrest, reduced cell viability, reduced mitochondrial activities and impaired the differentiation of myoblasts (paper II). Further studies on cancer cells showed that ZBED6 influences the growth of colorectal cancer cells with dramatic changes in the transcription of hundreds of cancer-related genes (paper III). The phenotypic characterization of Zbed6-/- and Igf2pA/mG mouse models showed that the ZBED6-Igf2 axis has a major effect on regulating muscle growth and the growth of internal organs. Transcriptome analysis demonstrated a massive up-regulation of Igf2 expression (~30-fold) in adult tissues, but not in fetal tissues, of transgenic mice (paper IV). In the second part of the thesis we investigated the cellular function of Zc3h11a, the gene harboring ZBED6 in one of its first introns. The function of the ZC3H11A protein is so far poorly characterized. We show that ZC3H11A is a novel stress-induced protein that is required for efficient mRNA export from the nucleus. The inactivation of ZC3H11A inhibited the growth of multiple viruses including HIV, influenza, HSV and adenoviruses (paper V).

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[ES] The study of eukaryotic gene expression is challenging because of the interconnection between all steps. Many factors orchestrate gene expression by influencing several layers of regulation. The Spt-Ada-Gcn5 acetyltransferase (SAGA) complex is a transcriptional coactivator involved in the coupling between transcriptional activation and downstream events, such as transcriptional elongation and mRNA export, by interacting with other elements of the regulatory machinery, such as transcription and export complex 2 (TREX-2). In this thesis, we demonstrate that TREX-2 components influence the activity of the SAGA deubiquitination module (DUBm) and the formation of the SAGA-like (SLIK) complex, a SAGA-related complex that exists in budding yeast, whose function is still unclear. We deepened our understanding of the SAGA and SLIK duality by studying different scenarios in which the two complexes behaved similarly or showed functional differences, such as osmotic stress. We created new Spt7 mutants, in which SLIK formation was triggered or impaired, to determine the differential roles of SAGA and SLIK. Although we observed that some SAGA functions, such as histone deubiquitination, were also performed by SLIK, others were not, such as chromatin recruitment of the Spt7 and Spt8 SAGA subunits and nuclear retention of bulk mRNA under osmotic stress. We also demonstrated that the C-terminal domain of Spt7 interacts with Spt8 outside of the SAGA complex. Additionally, in this thesis we focused on the study of Mip6 protein, an mRNA-binding protein that interacts with the general export factor Mex67 and has been recently reported to participate in the regulation of the heat stress response, in a recent study from our laboratory. Using a multi-omics approach, we characterized the mip6¿ mutant in a heat shock time course experiment (0,20 and 120 min) through the generation of a high-quality multi-omics dataset, which allowed us to deepen the study of Mip6 function under heat shock and adaptation to stress. mip6¿ showed altered levels of some transcripts under stress and non-stress conditions, together with impaired recruitment of the stress-transcription factors Hsf1 and Msn2 to the chromatin and altered occupancy of RNApol II under stress. Consistent hyperactivation of trehalose metabolism genes was observed at the transcriptional level, which was accompanied by the accumulation of trehalose, a key disaccharide in the stress response with a protective function. / [CA] El estudio de la expresión génica en eucariotas es un desafío debido a la interconexión entre todos los pasos. Muchos factores orquestan la expresión genética al influir en varios niveles su regulación. El complejo Spt-Ada-Gcn5 acetiltransferasa (SAGA) es un coactivador transcripcional involucrado en el acoplamiento entre la activación transcripcional y eventos posteriores, como la elongación transcripcional y la exportación de ARNm, al interactuar con otros elementos de la maquinaria de regulación, como el complejo de transcripción y exportación 2 (TREX-2). En esta tesis, demostramos que componentes de TREX-2 influyen en la actividad del módulo de desubiquitinación de SAGA (DUBm) y en la formación del complejo SAGA-like (SLIK), un complejo relacionado con SAGA que existe en la levadura, cuya función aún se desconoce. Profundizamos nuestra comprensión de la dualidad de SAGA y SLIK, mediante el estudio de diferentes escenarios en los que los dos complejos se comportaban de manera similar o mostraban diferencias funcionales, como el estrés osmótico. Creamos nuevos mutantes de Spt7, en los que se favoreció o impidió la formación de SLIK, para determinar las diferencias funcionales entre ambos complejos. Aunque observamos que algunas funciones de SAGA, como la desubiquitinación de histonas, también fueron realizadas por SLIK, otras no, como el reclutamiento a la cromatina de las subunidades de SAGA Spt7 y Spt8 y la retención nuclear del ARNm en estrés osmótico. También demostramos que el dominio C-terminal de Spt7 interacciona con Spt8 fuera del complejo SAGA. Además, en esta tesis nos centramos en el estudio de la proteína Mip6, una proteína de unión a ARNm que interacciona con el factor general de exportación Mex67 y cuya función en la regulación de la respuesta al estrés térmico se ha descrito en un reciente estudio de nuestro laboratorio. Utilizando un enfoque multiómico, caracterizamos el mutante mip6D en un experimento de estrés térmico de 120 minutos mediante la generación de un conjunto de datos de alta calidad, lo que nos permitió profundizar en el estudio de la función de Mip6 en choque térmico y en la adaptación a dicho estrés. mip6D mostró niveles alterados de algunos tránscritos en condiciones de estrés y no estrés, junto con un reclutamiento a la cromatina deficiente de los factores de transcripción Hsf1 y Msn2 y una alteración en la ocupación de la RNA polimerasa II (RNApol II) en estrés térmico. Se observó una hiperactivación constante de los genes del metabolismo de la trehalosa, así como acumulación de trehalosa, un disacárido clave en la respuesta al estrés con una función protectora. / [EN] L'estudi de l'expressió gènica en eucariotes és un desafiament a causa de la interconnexió entre tots els passos. Molts factors orquesten l'expressió genètica en influir en diversos nivells la regulació. El complex Spt-Ada-Gcn5 acetiltransferasa (SAGA) és un coactivador transcripcional involucrat en l'acoblament entre l'activació transcripcional i esdeveniments posteriors, com l'elongació transcripcional i l'exportació d'ARNm, en interactuar amb altres elements de la maquinària de regulació, com ara el complex de transcripció i exportació 2 (TREX-2). En aquesta tesi, demostrem que components de TREX-2 influeixen en l'activitat del mòdul de desubiquitinació de SAGA (DUBm) i en la formació del complex SAGA-like (SLIK), un complex relacionat amb SAGA que existeix al llevat, la funció del qual encara es desconeix. Hem aprofundit la nostra comprensió de la dualitat de SAGA i SLIK, mitjançant l'estudi de diferents escenaris on els dos complexos es comportaven de manera similar o mostraven diferències funcionals, com l'estrès osmòtic. Hem creat nous mutants de Spt7, en què s'afavoreix o s'impedeix la formació de SLIK, per determinar les diferències funcionals entre ambdós complexos. Tot i que observem que algunes funcions de SAGA, com la desubiquitinació d'histones, també foren realitzades per SLIK, d'altres no, com el reclutament a la cromatina de les subunitats de SAGA Spt7 i Spt8, i la retenció nuclear de l'ARNm en estrès osmòtic. També hem demostrat que el domini C-terminal de Spt7 interacciona amb Spt8 fora del complex SAGA. A més, en aquesta tesi ens centrem en l'estudi de la proteïna Mip6, una proteïna d'unió a ARNm que interacciona amb el factor general d'exportació Mex67 i la funció de la qual en la regulació de la resposta a l'estrès tèrmic s'ha descrit en un estudi recent el nostre laboratori. Utilitzant un enfocament multiòmic, hem caracteritzat el mutant mip6D en un experiment d'estrès tèrmic de 120 minuts mitjançant la generació d'un conjunt de dades d'alta qualitat, cosa que ens ha permés aprofundir en l'estudi de la funció de Mip6 en xoc tèrmic i en la adaptació a aquest estrès. mip6D va mostrar nivells alterats d'alguns trànscrits en condicions d'estrès i no estrès, juntament amb un reclutament a la cromatina deficient dels factors de transcripció Hsf1 i Msn2, i una alteració en l'ocupació de l'RNA polimerasa II (RNApol II) en estrés tèrmic . Es va observar una hiperactivació constant dels gens del metabolisme de la trehalosa, així com acumulació de trehalosa, un disacàrid clau en la resposta a l'estrès amb una funció protectora. / This thesis was accomplished thanks to two pre-doctoral fellowships, both given by the Generalitat Valenciana, and a predoctoral contract: Pre-doctoral fellowship associated with the PROMETEO project PROMETEO2016/B/093 – “The Next Systems Biology: development of statistical methods for the biology of multiomic systems"; Pre-doctoral fellowship for research stays outside the Valencian Community BEFPI/2019/035; Pre-doctoral contract associated with the project 20182D179 – “Regulación epigenética de la formación y metabolismo de mRNPs”, given by the Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades from the Spanish Government. / Nuño Cabanes, MDC. (2024). Study of the Role of SAGA/SLIK Complexes and Mip6 Protein in Gene Expression Regulation in Eukaryotes [Tesis doctoral]. Universitat Politècnica de València. https://doi.org/10.4995/Thesis/10251/207009

Enfermer le porteur de l’information génétique dans le noyau a obligée la cellule a créé un système de transport complexe, qui permet l’export d’un ARNm du noyau au cytoplasme. Le mécanisme général de l’export des ARNm est encore mal connu, même si les facteurs principaux ont été découverts il y a longtemps. De récents progrès en microscopie nous ont permis d’étudier directement le comportement des ARNm durant le processus d’export. Durant ma maitrise, nous avons été capables de localiser et suivre des ARNm en temps réel pour la première fois chez Saccharomyces cerevisiae. Nous avons créé un gène rapporteur en mettant le gène GLT1 sous le contrôle du promoteur GAL1. Nous avons aussi marqué l’ARNm de GLT1 avec plusieurs boucles PP7. L’ARNm sera visible après l’attachement de plusieurs protéines PP7-GFP aux boucles. En utilisant la technique d’imagerie en cellules vivantes, nous sommes capable de visualiser et suivre chaque ARNm, depuis son relâchement du site de transcription jusqu’à l’export. Une fois relâché du site de transcription, l’ARNm diffuse librement dans le nucléoplasme, mais une fois à la périphérie nucléaire, il commence à « scanner » l’enveloppe nucléaire avant d’être exporté. Nous avons trouvé que le « scanning » dépend de la présence des Myosin Like Proteins (Mlp1p et Mlp2p), protéines qui forment le panier nucléaire, car suite à la délétion de MLP1 et MLP2, les ARNm n’étaient plus capable de « scanner ». Nous avons également trouvé que la partie C-terminale de Mlp1p était nécessaire au « scanning ». De plus, suite à la délétion du gène TOM1, gène codant pour une ubiquitine ligase, les ARNm ont un comportement similaire aux ARNm d’une souche ∆mlp1/mlp2, suggérant que le « scanning » permet à Tom1p d’ubiquitiner Yra1p, ce qui causera son relâchement de l’ARNm. Également, nous avons montré que les ARNm endogènes MDN1 et CBL2 scannent aussi la périphérie nucléaire. Ensemble, nos résultats suggèrent que le scanning est un processus par lequel passent tout les ARNm nucléaire lorsqu’ils se retrouvent à la périphérie du noyau, pour initier plusieurs étapes de réarrangements nécessaires à leurs export. De plus, nous avons examiné le rôle de Yhr127p, une protéine nouvellement identifiée qui se lie à l’ARN. Après avoir marqué cette protéine avec la GFP, nous avons montré qu’elle forme des foci dans le noyau et que ces derniers vont disparaitre suite à l’arrêt de la transcription. La délétion de YHR127 à conduit à une augmentation de la transcription de quelques gènes spécifiques, mais n’affecte pas la capacité de la cellule à exporter les ARNm. Nos résultats suggèrent que cette protéine joue un rôle dans la régulation de la transcription et/ou dans la stabilité de l’ARNm. / In eukaryotic cells, the processes of RNA and protein synthesis are spatially separated into two distinct compartments. With this division, a complex pathway of nucleocytoplasmic RNA export has evolved, which to date remains poorly understood. Recent advances in single-molecule microscopy have enabled direct studies focused on investigating the dynamics and kinetics of RNA export. In this Master thesis, we present the first real time visualization of mRNA export in the yeast Saccharomyces cerevisiae. We first generated a GLT1 reporter under the control of the inducible GAL1 promoter, in which the GLT1 mRNA was tagged with an array of PP7 repeats and detected by exogenous PP7-GFP binding protein. Using a single-molecule live cell imaging approach, we were able to visualize and track the behavior of individual mRNAs from the site of transcription to the point of export. Interestingly, we found that once released from the transcription site, single mRNAs diffuse freely in the nucleoplasm, but once they reach the nuclear periphery, they scan the periphery before being exported to the cytoplasm. This scanning behavior was dependent on Myosin Like Proteins (Mlp1p and Mlp2p), which form the basket of the Nuclear Pore Complex (NPC), as mRNAs were not retained at the periphery and were rapidly released into the nucleoplasm in mlp1p/mlp2p double mutant cells. Specifically, we found that the C-terminal part of Mlp1p was important for scanning. Furthermore, mRNAs from cells depleted of the E3 ubiquitin ligase TOM1 had a similar phenotype to mRNAs in mlp1p/mlp2p double mutant cells, suggesting a role for scanning in the Tom1p-mediated release of Yra1p from the RNA. Lastly, we confirmed that endogenous MDN1 and CBL2 mRNAs also exhibit scanning behaviour. Taken together, our results suggest that mRNAs scanning the nuclear periphery is a general behaviour for all mRNAs to initiate the mRNA export process, allowing mRNP arrangement required for export to occur at the nuclear periphery. In addition, we investigated the role of YHR127, a newly identified RNA binding protein, in RNA biogenesis. Notably, we show that GFP-tagged YHR127p formed distinct foci in the nucleus, which were lost upon transcription arrest. Deletion of YHR127 led to an increase in transcript levels of specific genes, but not to a global accumulation of mRNAs in the nucleus, suggesting a role for this protein in regulating transcription and/or mRNA stability.