No description available.

Hippo signaling pathway represents organ size control mechanism constrained between all metazoans. Individual components of the Hippo signaling pathway were identified as key tumor-suppressors which phosphorylate and inhibit activity of several oncogenic factors and signaling pathways (such as YAP/TAZ, PI3K and mTOR). MST1 kinase is a part of central protein complex of the Hippo signaling pathway and its activation is involved in anti-cancer activity of several drugs. We have demonstrated activation of the MST1 kinase by natural compounds in leukemic cells followed by inhibition of proliferation and induction of apoptosis. Shikonin represents natural naphthoquinonic compound isolated from Lithospermum erythrorhizon which acts as inhibitor of glycolysis and mitochondrial respiratory chain in human cells. Shikonin induces fast activation of the MST1 protein in leukemic cells however mechanism of this activation remains unknown. Therefore, we tried to characterize posttranslational modifications of the MST1 kinase during shikonin treatment of leukemic cells. Firstly, we isolated MST1 kinase from control and shikonin-treated cells using immunoprecipitation. Then we characterized posttranslational modifications of the MST1 protein employing mass spectrometry. Using this approach we found out...

Vitamine E analogues α-tocopheryl succinate (α-TOS) and mitochondrially targeted vitamine E succinate (MitoVES) are anti-cancer agents from the group of "mitocans", the compounds acting via mitochondria which present a promising invariant target for cancer cell therapy. α-TOS and MitoVES induce apoptosis selectively in various cancer cell types involving generation of reactive oxygen species (ROS). Generated superoxid anion radicals in response to α-TOS and MitoVES are believed to be converted into hydrogen peroxide that is known to activate Mammalian sterile 20-like kinase (Mst1), the central component of Hippo signalling pathway, that presents an universal size control mechanism in all metazoans and its deregulation is linked to tumourigenesis. MitoVES and α-TOS were both reported to activate Mst1 that phosphorylates Forkhead box O1 (FoxO1) transcription factor resulting in its transport to nucleus where induce the expression of pro-apoptotic genes, including NOXA, and thus promote apoptosis. The target of Hippo signalling pathway is transcriptional co- activator Yes-associated protein (Yap) which was found in Drosophila melanogaster to regulate the expression of transcription factor c-Myc which is known as the most prominent human oncogene. This thesis focused on involvement of Hippo signalling...

Le mésothéliome pleural malin (MPM) est une tumeur primitive de la plèvre, rare, très agressive, avec un pronostic sombre. Nous avons souhaité au cours de ce travail de thèse, identifier de nouveaux biomarqueurs du MPM en testant l’influence de l’inactivation des membres de la famille RASSF/Hippo sur la survie des 448 patients inclus dans l’essai clinique MAPS (IFCT-GFPC-0701). Nous souhaitions également comprendre quelles fonctions et signalisations essentielles à l’homéostasie cellulaire, auxquelles participe la voie de signalisation RASSF/Hippo, sont perturbées lors du processus de transformation des cellules mésothéliales. L’inactivation des membres de la voie a été étudiée par PCR spécifique de méthylation (MS-PCR) et leur influence sur la survie des 448 patients inclus dans l’essai clinique MAPS testée en analyse uni- et multivariée avant d’être validée par boostrap. D’autre part, nous avons mimé in cell, l’inactivation par ARN interférence de plusieurs membres de la voie Hippo dans des cellules de lignées mésothéliales humaines (MSTO-211H, H2452, H28 et H2052). Nous avons pu identifier plusieurs biomarqueurs du MPM : i) la kinase MST1 dont l’inactivation est un facteur de mauvais pronostic, ii) l’amphiréguline dont l’expression cytoplasmique est au contraire un facteur de bon pronostic et enfin iii) le CD44 dont l’expression élevée constitue un outil diagnostique du MPM. Les approches in cell, nous ont permis de démontrer que les altérations de la voie RASSF/Hippo induisent une activité inappropriée de l’effecteur terminal YAP : le moins bon pronostic des patients présentant une inactivation de MST1 s’explique ainsi par le fait qu’en régulant l’activité de YAP, MST1 contrôle la balance apoptose/prolifération et prévient l’invasion et la croissance sans adhésion. En son absence, ces processus cellulaires sont dérégulés. Ce travail démontre l’importance de l’axe CD44/RASSF1A/MST1 dans le contrôle d’une activité appropriée de YAP et de l’homéostasie des cellules mésothéliales. La compréhension des désordres cellulaires induits par la dérégulation de le voie RASSF/Hippo, désigne YAP comme cible thérapeutique potentielle chez les patients atteints de MPM et présentant des altérations de cette voie de signalisation. / Malignant pleural mesothelioma (MPM) is a rare, very aggressive, primary tumor with a poor prognosis. During this thesis, we wanted to identify new biomarkers of MPM by testing the influence of the RASSF/Hippo pathway inactivation on the survival of the 448 patients included in the clinical trial MAPS (IFCT- GFPC-0701). We also wanted to understand which functions and signals essential to cellular homeostasis, linked to RASSF/Hippo signaling pathway, are disturbed during the mesothelial cell transformation process. Inactivation of RASSF/Hippo members was studied by methylation-specific PCR (MS-PCR) and their influence on the survival of the 448 patients included in the MAPS clinical trial tested in uni- and multivariate analysis before being validated by bootstrap. We also mimed in cell, by RNA interference, several members of the Hippo pathway inactivation in human mesothelial cells lines (MSTO-211H, H2452, H28 and H2052). We have identified several biomarkers of MPM: i) MST1 kinase whose inactivation is a factor of poor prognosis, ii) amphiregulin whose cytoplasmic expression is on the contrary a factor of good prognosis and finally iii) CD44 whose high expression is a diagnostic tool for MPM. In cell we demonstrate that RASSF/Hippo pathway alterations induce an inappropriate activity of YAP, one Hippo end effector: the poorer prognosis of patients with inactivation of MST1 is thus explained by the fact that, by regulating YAP activity, MST1 controls the apoptosis/proliferation balance and prevents invasion and growth without adhesion from mesothelial cells. In its absence, these cellular processes are deregulated. This work finally demonstrates the importance of the CD44/RASSF1A/MST1 axis in controlling appropriate YAP activity and mesothelial cell homeostasis. The understanding of the cellular disorders induced by the of the RASSF/Hippo pathway deregulation designates YAP as a potential therapeutic target in patients with MPM and presenting alterations of this signaling pathway.

Des études de liaison et d’association génétiques ont permis d’identifier certains des facteurs de risque génétiques aux maladies inflammatoires de l’intestin (MII) dans la région chromosomique 3p21. Dans cette région, le polymorphisme nucléotidique simple (SNP) codant non-synonyme du gène MST1, rs3197999, encodant pour la mutation R689C, a été associé et répliqué à la fois à la colite ulcéreuse (CU) et à la maladie de Crohn (MC). Un autre SNP, corrélé à des SNP codants non-synonymes du gène MST1R, a également été associé à la MC. Afin de déterminer si d’autres variantes des gènes MST1 et MST1R sont associés à la CU, nous avons testé pour association des SNP de ces gènes. Seul un proxy de R689C a montré un signal d’association significatif aux MII, ce qui suggère que R689C est la variante causale aux MII dans le gène MST1. En cherchant à déterminer si la région 3p21 contenait plusieurs signaux d’association mutuellement indépendants, trois SNP ont été identifiés comme possible facteurs de risque indépendants, et ont été génotypés dans des cas de CU et de MC et des témoins, puis nos résultats d’association ont été combinés à ceux provenant de trois autres cohortes indépendantes. Les trois SNP, R689C (MST1), rs6802890 et rs7629936 (CDHR4), sont associés aux MII, mais une étude d’association conditionnelle suggère qu’il existe en fait deux signaux d’association mutuellement indépendants dans la région 3p21. Le signal principal provient de R689C, une mutation de la protéine MSP. Cette protéine a un rôle dans l’inflammation chez les macrophages murins, et la migration, la cicatrisation et la survie chez les cellules épithéliales. Dans cette étude, le rôle de la MSP a été investigué dans des modèles de macrophages humains et de cellules épithéliales de côlon, et seule la phosphorylation d’AKT, un acteur dans la voie de signalisation de la survie cellulaire, a été modulée par la MSP dans nos modèles. Ce projet a donc permis d’apporter des connaissances sur les facteurs de risques génétiques aux MII dans la région 3p21, en identifiant 2 signaux d’association indépendants, et en nous informant sur le rôle de MST1, duquel provient le signal d’association principal, chez les cellules humaines. / Linkage studies and association studies allowed the discovery of some of the genetic risk factors of inflammatory bowel disease (IBD) in the chromosomal region 3p21. In this region, the non-synonymous coding single nucleotide polymorphism (SNP) rs3197999, situated in the gène MST1 and encoding for the mutation R689C, has been associated to UC and CD multiple times, and an other SNP, correlated to non-synonymous coding SNPs in the gene MST1R, has also been associated to CD. In order to verify if other variants of MST1 and MST1R are associatied to UC, we tested the association of some of their SNPs. Apart from R689C, only its proxy showed a significative association signal to IBD. It suggests that R689C might be the causal variant of IBD in the region 3p21. In the aim to determine if the region 3p21 has multiple independant association signals, 3 SNPs have been identified, from the results of a published meta-analysis of UC genome-wide association studies, as being possibly independant risk factors for UC based on their correlation. Their association to IBD and their independance have been tested by genotyping them in a cohort composed of controls, and UC and CD cases. The results of the association tests have been combined, in a meta-analysis, to the results of 3 other independent association studies. The 3 SNPs, R689C (MST1), rs6802890 and rs7629936 (CDHR4) are associated to IBD, but the results of the subsequent conditional association tests suggest that there is only 2 independant association signals in the region 3p21. The main signal is raising from R689C, a mutation of the protein MSP. According to published studies, this protein has a function in the inflammation in murine macrophages, and also in the scattering, wound healing and survival of epithelial cells. In this thesis, we investigated the role of MSP in human macrophage models and in human côlon epithelial cells, and it has been show that MSP modulates the phosphorylation of AKT, an actor in the pathway of cellular survival. This project brought some knowledges about the IBD genetic risk factors in the region 3p21. We identified 2 independent association signals to IBD in this region, and the main signal is coming from a SNP in MST1, a gene which has a role, based on our results, in the survival in human colon epithelial cells.

Des études de liaison et d’association génétiques ont permis d’identifier certains des facteurs de risque génétiques aux maladies inflammatoires de l’intestin (MII) dans la région chromosomique 3p21. Dans cette région, le polymorphisme nucléotidique simple (SNP) codant non-synonyme du gène MST1, rs3197999, encodant pour la mutation R689C, a été associé et répliqué à la fois à la colite ulcéreuse (CU) et à la maladie de Crohn (MC). Un autre SNP, corrélé à des SNP codants non-synonymes du gène MST1R, a également été associé à la MC. Afin de déterminer si d’autres variantes des gènes MST1 et MST1R sont associés à la CU, nous avons testé pour association des SNP de ces gènes. Seul un proxy de R689C a montré un signal d’association significatif aux MII, ce qui suggère que R689C est la variante causale aux MII dans le gène MST1. En cherchant à déterminer si la région 3p21 contenait plusieurs signaux d’association mutuellement indépendants, trois SNP ont été identifiés comme possible facteurs de risque indépendants, et ont été génotypés dans des cas de CU et de MC et des témoins, puis nos résultats d’association ont été combinés à ceux provenant de trois autres cohortes indépendantes. Les trois SNP, R689C (MST1), rs6802890 et rs7629936 (CDHR4), sont associés aux MII, mais une étude d’association conditionnelle suggère qu’il existe en fait deux signaux d’association mutuellement indépendants dans la région 3p21. Le signal principal provient de R689C, une mutation de la protéine MSP. Cette protéine a un rôle dans l’inflammation chez les macrophages murins, et la migration, la cicatrisation et la survie chez les cellules épithéliales. Dans cette étude, le rôle de la MSP a été investigué dans des modèles de macrophages humains et de cellules épithéliales de côlon, et seule la phosphorylation d’AKT, un acteur dans la voie de signalisation de la survie cellulaire, a été modulée par la MSP dans nos modèles. Ce projet a donc permis d’apporter des connaissances sur les facteurs de risques génétiques aux MII dans la région 3p21, en identifiant 2 signaux d’association indépendants, et en nous informant sur le rôle de MST1, duquel provient le signal d’association principal, chez les cellules humaines. / Linkage studies and association studies allowed the discovery of some of the genetic risk factors of inflammatory bowel disease (IBD) in the chromosomal region 3p21. In this region, the non-synonymous coding single nucleotide polymorphism (SNP) rs3197999, situated in the gène MST1 and encoding for the mutation R689C, has been associated to UC and CD multiple times, and an other SNP, correlated to non-synonymous coding SNPs in the gene MST1R, has also been associated to CD. In order to verify if other variants of MST1 and MST1R are associatied to UC, we tested the association of some of their SNPs. Apart from R689C, only its proxy showed a significative association signal to IBD. It suggests that R689C might be the causal variant of IBD in the region 3p21. In the aim to determine if the region 3p21 has multiple independant association signals, 3 SNPs have been identified, from the results of a published meta-analysis of UC genome-wide association studies, as being possibly independant risk factors for UC based on their correlation. Their association to IBD and their independance have been tested by genotyping them in a cohort composed of controls, and UC and CD cases. The results of the association tests have been combined, in a meta-analysis, to the results of 3 other independent association studies. The 3 SNPs, R689C (MST1), rs6802890 and rs7629936 (CDHR4) are associated to IBD, but the results of the subsequent conditional association tests suggest that there is only 2 independant association signals in the region 3p21. The main signal is raising from R689C, a mutation of the protein MSP. According to published studies, this protein has a function in the inflammation in murine macrophages, and also in the scattering, wound healing and survival of epithelial cells. In this thesis, we investigated the role of MSP in human macrophage models and in human côlon epithelial cells, and it has been show that MSP modulates the phosphorylation of AKT, an actor in the pathway of cellular survival. This project brought some knowledges about the IBD genetic risk factors in the region 3p21. We identified 2 independent association signals to IBD in this region, and the main signal is coming from a SNP in MST1, a gene which has a role, based on our results, in the survival in human colon epithelial cells.

La voie de signalisation Hippo est composée classiquement des kinases mammalian sterile twenty-like 1 et 2 (MST1/2) et des kinases large tumor suppressor 1 et 2 (LATS1/2) qui régulent les effecteurs transcriptionnels Yes-associated protein (YAP) et transcriptional coactivator with PDZ-binding motif (TAZ). Elle est impliquée dans plusieurs mécanismes cellulaires tels que la prolifération, la différenciation et l’apoptose ainsi que dans le maintien de l’homéostasie de différents tissus. Cependant, bien qu’il ait été démontré que YAP/TAZ contribuent au maintien de la glande surrénale, le rôle joué par les principales kinases de la voie Hippo dans ce tissu n’a jamais encore été évalué. L’objectif de ce projet de thèse est donc d’identifier les rôles des différentes kinases de la voie Hippo dans le développement et le maintien du cortex surrénalien par la création de cinq modèles de souris transgéniques. Grâce au modèle d’inactivation des kinases Mst1/2 dans le cortex surrénalien (Mst1flox/flox;Mst2flox/flox;Nr5a1-cre), nous avons démontré que Mst1/2 empêchent l’apparition prématurée de cellules ressemblant aux cellules du primordium adrénogonadique (AGP-like) dans la couche sous-capsulaire. Les analyses du transcriptome de ce modèle ont de plus démontré que les kinases MST1/2 régulent finement l’activité de YAP et des cellules de la zone glomérulée (zG) du cortex surrénalien à l’âge adulte mais pas l’activité des cellules de la zone fasciculée (zF). Ceci suggère que MST1/2 sont surtout impliqués dans la régulation de la fonction et de la différenciation des cellules de la zG. Contrairement à l’inactivation de Mst1/2, l’inactivation des kinases Lats1/2 dans tout le cortex en utilisant la même lignée Cre (Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;Nr5a1-cre), a démontré que LATS1/2 empêchent la transdifférenciation des cellules du cortex en cellules ressemblant à des myofibroblastes et à la formation de fibrose durant le développement embryonnaire. De plus, l’inactivation de LATS1/2 spécifiquement dans les cellules de la zG (Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;AS-cre) a démontré que LATS1/2 empêchent la transdifférenciation des cellules de la zG en cellules partageant des caractéristiques avec des ostéoblastes et des cellules de Sertoli. Cette inactivation est également responsable de l’induction d’une importante réponse immuno-inflammatoire chez les animaux juvéniles. De plus, l’inactivation de Yap/Taz simultanément à l’inactivation de Lats1/2 dans les cellules de la zG (Yapflox/flox;Tazflox/flox;Lats1flox/flox; Lats2flox/flox;AS-cre) a permis de confirmer que l’augmentation de l’activité transcriptionnelle de YAP et de TAZ était responsable du phénotype observé à la suite de l’inactivation de Lats1/2. Finalement, l’utilisation d’un modèle exprimant une forme constitutivement active de YAP humain dans les cellules de la zG (Rosa26YAP5SA/+;AScre/+) nous a permis de démontrer que l’augmentation de l’activité transcriptionnelle de YAP seule ne pouvait reproduire pleinement le phénotype observé suite à l’inactivation de Lats1/2 mais conduit plutôt à l’hyperplasie de la glande surrénale. Ensemble, nos modèles murins démontrent un rôle important pour la voie Hippo, et particulièrement les kinases LATS1/2 et les effecteurs YAP/TAZ, dans la différenciation des cellules stéroïdogéniques du cortex surrénalien et le maintien de l’homéostasie de la glande surrénale chez la souris. Ces travaux ouvrent non seulement la voie à l’étude plus poussée de cette voie dans des pathologies de la glande surrénale, comme les tumeurs surrénaliennes, mais mettent également en évidence la voie Hippo en tant que cible thérapeutique pour les troubles surrénaliens. / The Hippo pathway canonical signaling is composed of the mammalian kinases sterile twenty-like 1 and 2 (MST1/2) and large tumor suppressor 1 and 2 (LATS1/2) which ultimately regulate the transcriptional co-activators Yes-associated protein (YAP) and the transcriptional coactivator with PDZ-binding motif (TAZ). This pathway plays critical roles in maintaining the homeostasis of various tissues and regulating biological processes such as cellular proliferation, differentiation, and apoptosis in a tissue-specific manner. Although previous studies have shown that the effectors YAP/TAZ are involved in the maintenance of the adrenal gland, the roles played by their main upstream kinases in this tissue have not yet been evaluated. The objective of this thesis project is therefore to identify the importance of these distinct Hippo pathway kinases in the development and maintenance of the adrenal cortex by generating five different conditional transgenic mouse models. Using a Mst1/2 inactivation model (Mst1flox/flox;Mst2flox/flox;Nr5a1-cre), we first demonstrated that loss of Mst1/2 in the entire cortex leads to premature appearance of spindle-shaped cells resembling adrenogonadal primordium “AGP-like” cells in the sub-capsular region of the adrenal cortex. Further transcriptomic analyses performed on this model showed that MST1/2 can regulate the activity of YAP and of cells forming the zona glomerulosa (zG) in adult mice but not the activity of cells of the zona fasciculata (zF). This finding suggested that kinases MST1/2 are mainly involved in the regulation of zG cell function or differentiation. The inactivation of Lats1/2 using the same Cre line (Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;Nr5a1-cre) demonstrated that LATS1/2 prevent the transdifferentiation of cortical cells into myofibroblast-like cells and the onset of fibrosis during embryonic development. Moreover, the inactivation of Lats1/2 specifically in the zG cells (Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;AS-cre) demonstrated that LATS1/2 prevent the transdifferentiation of zG cells into cells sharing characteristics with osteoblast and Sertoli cells. This inactivation is also responsible for the induction of an immune-inflammatory response in juvenile mice. Most importantly, the concomitant inactivation of Yap/Taz with Lats1/2 in zG cells (Yapflox/flox;Tazflox/flox;Lats1flox/flox;Lats2flox/flox;AS-cre) demonstrated that the increase in the transcriptional activity of YAP/TAZ was responsible for the phenotype observed following the loss of Lats1/2. To complete our studies, we employed a mouse model expressing a constitutively active human form of YAP in zG cells (Rosa26YAP5SA/+;AScre/+) which demonstrated that increased transcriptional activity of YAP alone is not sufficient to recapitulate the phenotype observed following the loss of Lats1/2 but induces adrenal gland hyperplasia. Together, these findings indicate an important role for the Hippo signaling pathway, particularly LATS1/2 kinases and YAP/TAZ effectors, in the differentiation of steroidogenic cells of the adrenal cortex and the maintenance of adrenal gland homeostasis in mice. These findings not only pave the way for further studies of this pathway in important adrenal gland pathologies, such as adrenal tumors, but also highlight the Hippo pathway as a potential target for therapeutic treatments of adrenal disorders.