La maladie de Sandhoff est une maladie génétique rare due à des mutations du gène HEXB. Elle se caractérise par un double déficit en hexosaminidase A (αβ) et B (ββ), responsable d’une accumulation de ganglioside GM2 essentiellement dans le système nerveux central (SNC). Cliniquement, la maladie débute dès les premiers mois de vie et le décès survient vers l’âge de 3 ans. A ce jour, aucun traitement n’est disponible pour cette maladie. Le modèle murin obtenu par invalidation du gène Hexb est un bon outil pour le développement d’approches thérapeutiques, car il présente un phénotype proche de la maladie humaine. Le but principal de mon projet de thèse était d’explorer une approche de transfert de gène dans le modèle murin de la maladie de Sandhoff en utilisant un vecteur scAAV9. Ce vecteur a la particularité de pouvoir traverser la barrière hématoencéphalique et de transduire le SNC après administration intraveineuse (IV). Un vecteur codant la chaîne β des hexosaminidases, appelé scAAV9-Hexb, a précédemment été administré par voie IV à des souris en période néonatale à une dose de 3,5 x 1013 vg/kg. Les souris traitées ont survécu comme les souris normales (>700 jours) sans développer d’atteinte neurologique, ni périphérique alors que les souris Sandhoff non traitées sont décédées vers l’âge de 4 mois. J’ai réalisé toutes les analyses à long terme des souris traitées en utilisant des tests de comportements, ainsi que des analyses tissulaires 24 mois après le traitement. Une analyse lipidique par HPTLC a montré que la surcharge en ganglioside GM2 est totalement absente au niveau du cerveau (4 mois après l'injection), alors que dans le cervelet cette accumulation est non significative, mais pas totalement absente. Aucun symptôme lié à cette surcharge n’a été mis en évidence chez les souris à 24 mois, mais nous nous sommes posé la question d’un possible effet délétère à long terme en cas d’extrapolation à la clinique. Nous avons donc décidé de tester une double administration IV + ICV (intracérébroventriculaire) en utilisant le même vecteur et la même dose globale de façon à mieux corriger le cervelet. Deux groupes de souris ont été injectés en période néonatale en utilisant des doses différentes dans les deux compartiments. Les analyses ont montré que dans le cerveau, à court terme, la restauration de l’activité enzymatique est partielle, mais significative. Par ailleurs, il existe une absence totale de surcharge en GM2, ainsi qu’une correction des biomarqueurs associés à la maladie. Dans le cervelet, l’efficacité du traitement a été montrée seulement pour le groupe traité avec la dose la plus importante en ICV, ce qui suggère qu’une dose minimale en ICV est nécessaire pour atteindre de manière globale le SNC. Ces résultats ont été confirmés par l’analyse à long terme. Concernant le foie, nos résultats ont montré qu’une dose IV minimale est nécessaire pour obtenir une baisse de l’accumulation lipidique. Ce travail a permis de définir les doses minimales nécessaires dans chaque compartiment (IV et ICV) et il montre que la double administration peut être avantageuse pour traiter toutes les régions du SNC et notamment les plus atteintes, comme le cervelet. Il va maintenant nous permettre de traiter de façon optimale les souris adultes. L’autre but de mon projet était d’explorer les défauts de signalisation et la physiopathologie cellulaire dans la maladie de Sandhoff en utilisant des études in vivo et in vitro. Les études in vitro ont été réalisées sur des fibroblastes de patients et des cellules embryonnaires murines (MEF) obtenues à partir des souris Hexb-/- et la surcharge lysosomale a été confirmée dans ces cellules. La voie mTOR (mammalian target of rapamycin) a été analysée et nous avons montré qu’elle était dérégulée. L’activité autophagique a aussi été étudiée et nous avons mis en évidence une augmentation du nombre d’autophagosomes chez les souris Hexb-/- suggérant un défaut de cette voie. (...) / Sandhoff disease (SD) is a genetic disorder due to mutations in the HEXB gene. It is characterized by a double Hex A (αβ) and B (ββ) deficiency, responsible for a GM2 accumulation, mainly in the central nervous system (CNS). Clinically, SD begins in the first months of life and culminates in death around 3 years of age. So far, no specific treatment is available for Sandhoff disease. The murine model obtained by invalidation of the Hexb gene is a useful tool for the development of therapeutic approaches, as it exhibits a phenotype quite close to the human disease. The main aim of my PhD project was to explore a gene transfer approach in Sandhoff mice using a specific scAAV9. This vector has the particularity to cross the blood-brain barrier after intravenous (IV) administration and to transduce brain. A vector encoding the hexosaminidases β chain, called scAAV9-Hexb, has been previously IV injected in neonatal Hexb-/- mice with a dose of 3.5 x 1013 vg/kg. I participated to the long-term analysis of the scAAV9-Hexb treated mice using behavioral tests and analysis of tissues at 24 months post-injection. Mice had a survival similar to normal mice (>700 days) without neurological sign and peripheral damage by comparison with naïve Sandhoff mice (death around 120 days). At 4 months post-treatment, lipid analysis using HPTLC showed that GM2 storage was absent in brain, but it was only decreased in cerebellum of treated mice. Even if no symptom was associated with this residual storage in mice at 2 years, we wondered if it could possibly be pathogenic at longer-term if extrapolated to patients. Therefore, we decide to test a combined way of administration i.e. intravenous (IV) + intracerebroventricular (ICV) using the same vector with the same final dose. Two groups of mice were injected using different doses in both compartments and treatment efficacy was evaluated at short- and long-term. In the cerebrum, at short-term, enzymatic activities were partially but significantly restored, GM2 accumulation was completely prevented and disease biomarkers corrected. In the cerebellum, a significant increase of enzymatic activity was only obtained for the group treated with the highest dose in the ICV compartment. Regarding GM2 analysis and long-term behavioral analysis, we confirmed that this dose is required to cure cerebellum. In liver, our results suggest that IV minimal dose is needed to obtain a decrease of lipid accumulation. Our results showed that minimal doses are required in ICV and IV to obtain a good efficacy in each compartments, and that combined administration permit a widespread correction in the CNS. These data will permit to treat adult mice with the optimal treatment. The other goal of my project was to explore signaling defects and cellular pathophysiology in Sandhoff disease using in vivo and in vitro studies. For in vitro studies, fibroblasts from Tay-Sachs and Sandhoff patients were analyzed and mouse embryonic fibroblasts (MEF) were obtained from the Hexb-/- murine model, lysosomal storage was confirmed. mTOR (mammalian target of rapamycin) pathway was studied showing signaling deregulation. Autophagy was analyzed in vitro and in vivo, as defect in this pathway has been reported in other lysosomal storage disorders. An increase of autophagosomes number was observed in Hexb-/- subjects suggesting a defect in autophagy. These results offer novel biomarkers of Sandhoff pathology which can be useful to test the efficacy of therapeutic approaches. They can also provide new therapeutic targets that could be tested in combination with gene transfer.

La thérapie chaperon représente une approche thérapeutique stratégique et innovante, en particulier dans le traitement des maladies lysosomales. Ces maladies génétiques rares ont une gravité variable, qui peut aller de la létalité avant la naissance jusqu'à la nécessité d‟une prise en charge permanente ; elles apparaissent à tous les stades de la vie. Des mimes du substrat appelé iminosucres, vont agir en allant au coeur du site actif de l'enzyme, stabiliser l'enzyme mutée qui est instable mais non inactive. Paradoxalement, la plupart des chaperons pharmacologiques sont des inhibiteurs de l'enzyme visée mais leur administration à faible concentration leur permet de réaliser leur mission de sauvetage de l'enzyme mutée. Dans cette optique, des recherches effectuées au sein de notre laboratoire ont fait état de la synthèse d'iminosucres, tels que les α-1-C-alkyl iminoxylitols qui sont de très bons inhibiteurs de la β-glucocérébrosidase, l'enzyme défaillante dans la maladie de Gaucher, mais aussi qui doublent l'activité enzymatique résiduelle. Une nouvelle voie de synthèse plus efficace a été réalisée afin d'obtenir plus efficacement ce type d'iminosucres et d'autres dérivés. Ces travaux ont également été l'occasion de développer des iminoxylitols structurellement simplifiés qui agissent comme chaperons pharmacologiques toujours pour le traitement de la maladie de Gaucher. Une partie de ces travaux a aussi été consacrée à la recherche d‟inhibiteurs de la β-galactocérébrosidase, l'enzyme impliquée dans la maladie de Krabbé, et qui pourront agir comme chaperons pharmacologiques. Différentes évaluations pharmacologiques ont été réalisées, notamment des tests d'inhibition et la détermination des effets chaperons.

La thérapie chaperon représente une approche thérapeutique stratégique et innovante, en particulier dans le traitement des maladies lysosomales. Ces maladies génétiques rares ont une gravité variable, qui peut aller de la létalité avant la naissance jusqu’à la nécessité d‟une prise en charge permanente ; elles apparaissent à tous les stades de la vie. Des mimes du substrat appelé iminosucres, vont agir en allant au coeur du site actif de l’enzyme, stabiliser l’enzyme mutée qui est instable mais non inactive. Paradoxalement, la plupart des chaperons pharmacologiques sont des inhibiteurs de l’enzyme visée mais leur administration à faible concentration leur permet de réaliser leur mission de sauvetage de l’enzyme mutée. Dans cette optique, des recherches effectuées au sein de notre laboratoire ont fait état de la synthèse d’iminosucres, tels que les α-1-C-alkyl iminoxylitols qui sont de très bons inhibiteurs de la β-glucocérébrosidase, l’enzyme défaillante dans la maladie de Gaucher, mais aussi qui doublent l’activité enzymatique résiduelle. Une nouvelle voie de synthèse plus efficace a été réalisée afin d’obtenir plus efficacement ce type d’iminosucres et d’autres dérivés. Ces travaux ont également été l’occasion de développer des iminoxylitols structurellement simplifiés qui agissent comme chaperons pharmacologiques toujours pour le traitement de la maladie de Gaucher. Une partie de ces travaux a aussi été consacrée à la recherche d‟inhibiteurs de la β-galactocérébrosidase, l’enzyme impliquée dans la maladie de Krabbé, et qui pourront agir comme chaperons pharmacologiques. Différentes évaluations pharmacologiques ont été réalisées, notamment des tests d’inhibition et la détermination des effets chaperons. / Chaperone Mediated Therapy represents an innovative and strategic approach to treat lysosomal storage disorders which a class of rare genetic diseases. Competitive inhibitors for some of these lysosomal enzymes can, at sub inhibitory concentrations, act as chaperones and rescue the mutant proteins. In fact, enzymes carrying some mutations are still catalytically active. α-1-C-alkyl iminoxylitols represent a class of iminosugars which mimic the “gluco” configuration of the substrate and give powerful inhibitors of β-glucocerebrosidase, the enzyme involved in Gaucher disease. Moreover, this class of iminosugars, synthesized by our group, act as pharmacological chaperones and are able to double the residual activity of the N370S mutant. In order to synthesize more efficiently these iminosugars, the synthetic strategy was improved and optimized. Moreover, we focused our investigations on structural variations on our lead compound (α-1-C9 iminoxylitol) and draw important conclusions on structure-activity relationship. Then, we extended our expertise on iminosugars as pharmacological chaperones to another lysosomal glycosidase. In paricular, we targeted β-galactocerebrosidase, the enzyme responsible for Krabbe disease, and synthesized a series of iminosugars which mimic the “galacto” configuration. Biological assays were performed on our compounds to determine their activity as inhibitors and for some of them, their chaperone effects.

Les glycosidases sont des enzymes impliquées dans de nombreux processus biologiques. Entre autres, elles sont responsables de la dégradation des déchets polysaccharidiques de nos cellules. Lorsqu'une modification génétique touche un gène qui code pour une de ces enzymes, des pathologies graves regroupées sous l'appellation de " maladies lysosomales " peuvent être déclenchées. L'objectif de ce projet a été de proposer une méthode de synthèse efficace de molécules potentiellement actives spécifiquement sur l'une ou l'autre de ces maladies. Les molécules ciblées sont des inhibiteurs de glycosidases de la famille des aminocyclitols, utilisés dans une stratégie thérapeutique émergente " par molécules chaperonnes ". La méthode de synthèse développée s'appuie sur une étape enzymatique clé utilisant les aldolases comme catalyseurs et répondant aux contraintes environnementales actuelles de la chimie verte. Nous avons atteint nos objectifs grâce à l'utilisation de trois aldolases différentes, produites et purifiées pour la première fois au sein de notre laboratoire. Il s'agit de la fuculose-1-phosphate aldolase F1PA, de la rhamnulose-1-phosphate aldolase R1PA et de la nouvellement découverte fructose-6-phosphate aldolase FSA. La formation d'une quarantaine de nitrocyclitols, de stéréochimies définies, précurseurs des aminocyclitols correspondant, a ainsi été réalisée avec de très bons rendements de synthèse.

Les glycosidases sont des enzymes impliquées dans de nombreux processus biologiques. Entre autres, elles sont responsables de la dégradation des déchets polysaccharidiques de nos cellules. Lorsqu’une modification génétique touche un gène qui code pour une de ces enzymes, des pathologies graves regroupées sous l’appellation de « maladies lysosomales » peuvent être déclenchées. L'objectif de ce projet a été de proposer une méthode de synthèse efficace de molécules potentiellement actives spécifiquement sur l'une ou l'autre de ces maladies. Les molécules ciblées sont des inhibiteurs de glycosidases de la famille des aminocyclitols, utilisés dans une stratégie thérapeutique émergente « par molécules chaperonnes ». La méthode de synthèse développée s’appuie sur une étape enzymatique clé utilisant les aldolases comme catalyseurs et répondant aux contraintes environnementales actuelles de la chimie verte. Nous avons atteint nos objectifs grâce à l’utilisation de trois aldolases différentes, produites et purifiées pour la première fois au sein de notre laboratoire. Il s’agit de la fuculose-1-phosphate aldolase F1PA, de la rhamnulose-1-phosphate aldolase R1PA et de la nouvellement découverte fructose-6-phosphate aldolase FSA. La formation d’une quarantaine de nitrocyclitols, de stéréochimies définies, précurseurs des aminocyclitols correspondant, a ainsi été réalisée avec de très bons rendements de synthèse. / Glycosidases are enzymes involved in many biological processes. For example, they are responsible for breaking up polysaccharide waste materials of our cells. When a genetic mutation concerns a gene encoding for one of theses enzymes, acute pathologies named lysosomal storage disorders can appear. Aim of this work was to find an effective synthesis method of molecules potentially active specifically on one or others diseases. Target molecules are glycosidases inhibitors from the aminocyclitols family, used in an emergent strategy “by molecular chaperones”. The method of synthesis developed in the course of this work is based on an enzymatic key step using aldolases as catalyst, and follows current environment constraints of the green chemistry concept. Goals were reached thanks to the use of three different aldolases, produced and purified for the first time in our lab. It consists in fuculose-1-phosphate aldolase F1PA, rhamnulose-1-phosphate aldolase R1PA and the newly discovered fructose-6-phosphate aldolase FSA. Formation of around forty nitrocyclitols (aminocyclitols precursors) with a defined stereochemistry was realised with very good yields of synthesis.