Tese (doutorado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Medicina, Programa de Pós-graduação em Medicina Tropical, 2014. / Submitted by Ana Cristina Barbosa da Silva (annabds@hotmail.com) on 2015-05-28T16:46:46Z No. of bitstreams: 1 2014_RebeccaMartinsCardoso_Parcial.pdf: 2132419 bytes, checksum: 631e8e1c99e6ebafd085cc50c2cd2126 (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2015-06-01T19:13:28Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2014_RebeccaMartinsCardoso_Parcial.pdf: 2132419 bytes, checksum: 631e8e1c99e6ebafd085cc50c2cd2126 (MD5) / Made available in DSpace on 2015-06-01T19:13:28Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2014_RebeccaMartinsCardoso_Parcial.pdf: 2132419 bytes, checksum: 631e8e1c99e6ebafd085cc50c2cd2126 (MD5) / Mamíferos silvestres, sinantrópicos e domésticos podem ser hospedeiros dediferentes espécies de Leishmania. Estudos sobre possíveis reservatórios de Leishmania em diferentes áreas são fundamentais para a definição das estratégias de vigilância e controle das doenças. No presente estudo, avaliou-se a ocorrência de infecção por Leishmaniaspp. em mamíferos de duas unidades de conservação e entorno do DF, Brasília, Brasil. Pequenos mamíferos foram capturados em2011 e 2012 em duas Unidades de Conservação Federais do DF, o Parque Nacional de Brasília (PNB) e a Reserva Biológica da Contagem (Rebio), e, em 2013, foram amostrados cães de condomínios residenciais e núcleos rurais do entorno das unidades. Amostras de pele e sangue dos animais silvestres e dos cães foram avaliadas por meio de diferentes testes moleculares, direcionados à região polimórfica D7 do gene 24Sα rRNA, para a região conservada do minicírculo de kDNAe para a região espaçadora interna do DNA ribossômico ITS1 de Leishmania spp.As espécies de Leishmaniaforam identificadas mediante o sequenciamento dos produtos amplificados. As amostras de sangue dos cães foram submetidas ao teste imunocromogrático rápido (DPP) para detecção de anticorpos anti-Leishmania. Foram estudados 179 mamíferos silvestres, os quais 20,1% tiveram amostras positivas para Leishmania spp. nos testes moleculares (Clyomys laticeps, Gracilinanus agilis, Necromys lasiurus, Nectomys rattus, Rhipidomys macruruse Didelphis albiventris). Não foram observadas diferenças significativas comparando a proporção de indivíduos infectados por Leishmania spp.entre as duas áreas amostradas e entre as espécies.A maioria das amostras positivas era do roedor N. lasiurus, as quais foram identificadas como L. amazonensisouL. braziliensis. As 19 amostras dos cães estudados foram positivas ao teste DPP, porém, apenas cinco(26,3%) foram positivas para Leishmania spp. nas análises moleculares.As amostras de cães foram identificadas como L. infantum.Os resultados sugerem o envolvimento de seis espécies de mamíferos silvestres na transmissão enzoótica de Leishmania spp.no Distrito Federal, sendo o primeiro registro de L. amazonensisnoroedor silvestreN. lasiurusno Brasil Central. / Wild, synanthropic and domestic mammals are hosts of Leishmania spp. Studies on possible reservoirs of Leishmania in different areas are fundamental for the development of strategies for the surveillance and control of this disease. In the present study, we evaluated the Leishmania spp. occurrence in mammals in two conservation units and their surroundings in Brasilia, Federal District (FD) Brazil. Small mammals were captured in 2011 and 2012 in two conservation units of FD, the Brasília Nacional Park (BNP) and the Biological Reserve of Contagem (BRC). In 2013, we took samples from dogs in residential areas in the surroundings of these conservation units. Skin and blood samples were evaluated by PCR using different molecular markers (D7 24Sα rRNA, kDNA and DNA ITS1). The Leishmania species were identified by sequencing. Blood samples from the dogs were also subjected to the rapid imunocromogratical test (DPP) for detection of anti-Leishmania antibodies. 179 wild mammals were studied, of which 20.1% had DNA of Leishmania spp successfully detected in at least one positive sample. Six species were considered infected: Clyomys laticeps, Gracilinanus agilis, Necromys lasiurus, Nectomys rattus, Didelphis albiventris and Rhipidomys macrurus. No significant differences comparing the proportion of individuals infected with Leishmania spp were observed between the two sampled areas and between wild mammal species. Most of the positive samples were collected from the rodent N. lasiurus, infected by L. amazonensis or L. braziliensis. All 19 dog samples studied were positive by DPP, however, only five (26.3%) were positive for Leishmania spp. by PCR. DNA sequence of ITS1 amplicons from dog samples had 100% identity with L. infantum sequence. The results suggest the involvement of six species of wild mammals in the enzootic transmission of Leishmania spp. in FD. This is the first record of L. amazonensis in N. lasiurus in Central Brazil.

Dissertação (mestrado)—Universidade de Brasília, Faculdade de Agronomia e Medicina Veterinária, 2016. / Submitted by Fernanda Percia França (fernandafranca@bce.unb.br) on 2016-09-20T18:59:56Z No. of bitstreams: 1 2016_LucianaMirandaMattos.pdf: 757535 bytes, checksum: dc9aaabc293b5718e20254747d9f337a (MD5) / Approved for entry into archive by Raquel Viana(raquelviana@bce.unb.br) on 2016-10-20T20:06:41Z (GMT) No. of bitstreams: 1 2016_LucianaMirandaMattos.pdf: 757535 bytes, checksum: dc9aaabc293b5718e20254747d9f337a (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-20T20:06:41Z (GMT). No. of bitstreams: 1 2016_LucianaMirandaMattos.pdf: 757535 bytes, checksum: dc9aaabc293b5718e20254747d9f337a (MD5) / A perda da diversidade biológica vem aumentando consideravelmente no bioma Cerrado, sendo causada pela destruição de hábitats ocasionados pelo crescimento das cidades, fronteiras agrícolas, aumento da população humana, extração de madeira, abertura de estradas e distúrbios como fogo, caça, pecuária e, sobretudo, atropelamentos de animais silvestres em rodovias. Com essa intensa perda de material genético, fez-se necessário a criação de um banco de germoplasma para se evitar a extinção de espécies ameaçadas. O objetivo deste trabalho foi primeiramente avaliar a possibilidade de recuperar, isolar e caracterizar fibroblastos de três espécies diferentes (lobo-guará, veado-catingueiro e cachorrodo- mato), assim como testar o efeito dos crioprotetores DMSO 10% e DMF 5% associados a uma curva de resfriamento lenta e não controlada, sobre a viabilidade celular destes animais. Em seguida, utilizando o meio de criopreservação mais eficiente identificado previamente, formar um banco de germoplasma contendo fibroblastos de diferentes espécies silvestres do bioma Cerrado, aproveitando o material genético que seria perdido com a morte do animal. Os animais foram provenientes de atropelamento nas rodovias, encontrados mortos no meio ambiente ou do Hospital Veterinário do Jardim Zoológico de Brasília. Foram retirados fragmentos de pele da orelha dos animais mortos. Em seguida foram tricotomizados e fragmentados em pedaços de 2 mm2. As amostras foram colocadas em placas de petri, preenchidas com 3 mL de meio DMEM, suplementado com 10% de SFB e antibiótico e, em seguida levadas à estufa de CO2 a 38,5 ºC e 5% de CO2. Os fragmentos foram retirados após 10 dias após a troca do meio. No sétimo dia após a troca do meio, as células foram suspensas em tripsina-EDTA e transferidas para garrafas de cultivo até atingirem a confluência. Após atingirem a terceira passagem, uma parte das células foi diluída em solução de criopreservação com 10% de DMSO, e a outra parte foi diluída em solução com 5% de DMF. As células foram envasadas em palhetas de 0,25 mL e armazenadas por 24 horas a -80ºC e, logo após esse tempo, armazenadas em nitrogênio líquido. As células pós-congelamento foram coradas com Trypan blue 4% para análise de viabilidade. Os fibroblastos dos exemplares de lobo-guará apresentaram um atraso no crescimento celular em meio DMEM em relação a outras espécies, sendo um fator limitante para seu armazenamento futuro. Diferenças na morfologia celular foram observadas entre os fibroblastos de lobo-guará, veado-catingueiro e cachorro-do-mato, que apresentaram formato ramificado, fusiforme e esférico, respectivamente. A solução de crioproteção contendo 10% de DMSO foi mais eficiente que o meio com DMF 5%, para conservar a viabilidade dos fibroblastos das três espécies (P<0,05). Um banco de germoplasma foi formado com 508 amostras criopreservadas com fibroblastos de 19 animais, provenientes de 11 espécies diferentes. Dentro destas espécies, quatro são classificadas em escala de risco de extinção como menos preocupantes (cachorro-do-mato, veado-catingueiro, furão e macaco-da-noite), seis espécies como vulneráveis (lobo-guará, onça-pintada-preta, onça-pintada, gato-maracajá e gato-palheiro), uma em perigo de extinção (mico-leão-preto) e uma criticamente em perigo (cairara). Este reservatório biológico se configura no primeiro banco de germoplasma contendo células somáticas de mamíferos silvestres mortos do bioma Cerrado do Brasil. Este material está alocado no Jardim Zoológico de Brasília e servirá para estudos futuros de caracterização das espécies e multiplicação de animais por meio da clonagem por transferência nuclear. ________________________________________________________________________________________________ ABSTRACT / The loss of biological diversity has increased considerably in the Cerrado biome, being caused by the destruction caused habitat for the growth of cities, agricultural areas, increasing human population, logging, opening roads and disturbances such as fire, hunting, livestock and especially, road kill wildlife on highways. With this intense loss of genetic material, it became necessary to create a germplasm bank to prevent the extinction of endangered species. The objective of this study was first to evaluate the possibility to recover, isolate and characterize three different species fibroblasts (maned wolf, deer brocket and dog-eating fox) and tests the effect of cryoprotectants 10% DMSO and DMF 5% associated with a slow cooling curve and not controlled on the cell viability of these animals. Then, using the most efficient means of cryopreservation identified previously, form a germplasm bank containing fibroblast different wild species of the Cerrado biome, taking advantage of the genetic material that would be lost with the death of the animal. The animals came from being run over on highways, found dead in the environment or the Veterinary Hospital Garden Brasilia Zoo. Ear skin fragments were removed from dead animals. Then they were shaved and fragmented into 2 mm2 pieces. The samples were placed in petri dishes, filled with 3 mL of DMEM supplemented with 10% FBS and antibiotics, and then brought to the CO2 incubator at 38.5 °C and 5% CO2. The fragments were removed after 10 days and the medium replaced. On the seventh day after the exchange of the medium, the cells were suspended in trypsin-EDTA and transferred for cultivation bottles until reaching confluence. After reaching the third passage, a part of the cells was diluted cryopreservation solution with 10% DMSO, and the other part was diluted in solution with 5% DMF. The cells were filled into 0.25 ml straws and stored at -80 °C for 24 hours and, after this time, stored in liquid nitrogen. The post-freezing cells were stained with Trypan blue to 4% viability analysis. Fibroblasts of the maned wolf specimens showed a delay in cell growth in DMEM in relation to other species, a limiting factor for their future storage. Differences in cell morphology were observed between the maned wolf fibroblasts, brocket deer and dog-eating fox, which had branched form, fusiform and spherical, respectively. The cryoprotection solution containing 10% DMSO was more efficient than the medium with 5% DMF, to preserve the viability of the fibroblasts of the three species (P <0.05). A germplasm bank was formed with 508 samples cryopreserved with fibroblasts of 19 animals from 11 different species. Within these species, four are classified endangered risk scale as less worrying (dog-eating fox, brocket deer, ferret and night monkey), six species as vulnerable (maned wolf, black jaguar, jaguar cat maracajá and barn cat) an endangered (black lion tamarin) and a critically endangered (cairara). This biological reservoir is configured in the first germplasm bank containing somatic cells of wild mammals killed the Cerrado biome in Brazil. This material is allocated to the Zoo of Brasilia and serves for future studies to characterize the species and multiplication of animals through cloning by nuclear transfer.