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Caractérisation des sirtuines de Schistosoma mansoni : cibles thérapeutiques potentielles / Charaterization of Schistosoma mansoni sirtuins : potential therapeutic targetsLancelot, Julien 13 December 2013 (has links)
La schistosomiase représente actuellement la seconde endémie parasitaire mondiale après le paludisme. Annuellement, cette pathologie est responsable de 280 000 décès et 700 millions d’individus y sont exposés dans 74 pays à travers le monde. Actuellement, le traitement de la schistosomiase repose sur l’utilisation d’un seul médicament, le Praziquantel®. Ainsi, le développement de nouveaux médicaments est devenu une priorité absolue pour l’OMS. Dans cette étude, notre objectif a été d’identifier de nouvelles cibles thérapeutiques afin de développer de nouveaux précurseurs de médicaments. Au cours de ce projet, nous avons focalisé nos recherches sur les enzymes impliquées dans la modification des histones et plus particulièrement sur les sirtuines, qui sont des lysines désacétylases NAD+ dépendantes.Dans une première partie, nous avons caractérisé 5 orthologues de sirtuines de mammifères chez Schistosoma mansoni (SmSirt1, 2, 5, 6 et 7). De plus, nous avons étudié le potentiel des sirtuines comme cibles thérapeutiques pour le traitement de la schistosomiase en évaluant la toxicité d’inhibiteurs génériques de sirtuines humaines sur des parasites maintenus en culture. Ainsi, nous avons montré que les inhibiteurs de sirtuines humaines affectent in vitro la viabilité des schistosomules ainsi que la stabilité de l’accouplement et la production d’oeufs des vers adultes. De plus, ces inhibiteurs induisent des changements morphologiques de l’appareil génital du ver femelle.Dans une seconde partie, nous avons entrepris d’étudier plus spécifiquement le rôle de SmSirt2 en tant que cible thérapeutique. Ainsi, l’expression de la protéine recombinante en bactérie E. coli (collaboration: C. Romier, IGBMC, Illkirch) ainsi que l’optimisation d’un dosage fluorimétrique nous ont permis de montrer que SmSirt2 présente une activité lysine désacétylase in vitro (collaboration: M. Jung, Université Albert-Ludwigs, Freibourg). De plus, l’utilisation de ce dosage nous a permis de mettre en place le criblage à haut débit d’une chimiothèque de plus de 80 000 composés afin d’identifier de nouvelles molécules inhibitrices de l’enzyme SmSirt2 (collaboration: J. Schultz, Kancera AB, Stockholm). Les composés les plus prometteurs, ont été testés in vitro sur des parasites en culture. Les résultats obtenus démontrent que les inhibiteurs de SmSirt2 affectent également la viabilité des schistosomules ainsi que la stabilité de l’accouplement et la production d’oeufs des vers adultes.Dans une dernière partie, nous avons mis en place un criblage d’une banque d’ADNc de vers adultes par la technique du double hybride en levure dans le but d’identifier les partenaires protéiques de Sirt1 chez S. mansoni. L’analyse partielle des résultats nous a permis de mettre en évidence que SmSirt1 interagit avec plusieurs protéines impliquées dans la régulation des gènes chez le schistosome. Au cours de ce projet, nous avons également développé et optimisé un protocole permettant d’étudier l’activité enzymatique de SmSirt1 par injection d’ARNm dans des ovocytes de Xénope. Ainsi, nous avons pu montrer que le sirtinol et la salermide, deux inhibiteurs de Sirt1 humaine, présentent également une activité inhibitrice sur l’enzyme du parasite (collaboration: K. Cailliau, Université des Sciences et Technologies, Lille).L’ensemble des résultats obtenus au cours de ce projet de thèse suggère que les sirtuines sont des cibles thérapeutiques potentielles dans le traitement de la schistosomiase. Parmi les 5 orthologues identifiés chez S. mansoni, SmSirt2 semble une cible prometteuse. De plus, le criblage à haut débit que nous avons réalisé sur l’enzyme recombinante a permis d’identifier des molécules qui, après bio-optimisation, pourront être des candidats médicaments. Pour finir, ces résultats participent à une meilleure compréhension du rôle biologique des sirtuines chez S. mansoni et plus particulièrement sur leur implication dans la survie et la reproduction du parasite. / Schistosomiasis is the second most important parasitic disease worldwide after malaria. It is responsible for about 280 000 deaths annually and 700 million people in 74 countries are exposed to infection. Treatment of schistosomiasis currently depends on the use of the only available drug, praziquantel, and for this reason the development of new drugs is a strategic priority of the W.H.O. In this study, our objective was to identify novel therapeutic targets in order to develop new lead molecules for drug development. During this project we have focused our research on enzymes involved in histone modification, and more particularly on sirtuines, which are NAD+-dependent lysine deacetylases.In the first part of the project, we have identified 5 homologues of mammalian sirtuins in Schistosoma mansoni (SmSirt1, 2, 5, 6 and 7). Moreover, we studied the potential of sirtuins as therapeutic targets for the treatment of schistosomiasis by evaluating the toxicity for parasites maintained in culture of generic inhibitors of human sirtuins. In this way we showed that these inhibitors affect the viability of schistosomula and the stability of pairing and egg production of adult worms. Moreover, these inhibitors caused major morphological changes, particularly to the female worm genital apparatus.A second part of our work was devoted to the more detailed study of SmSirt2 as a therapeutic target. Immunisation of mice with the recombinant protein allowed us to obtain specific antibodies and to show that SmSirt2 protein is expressed at all parasite developmental stages. Furthermore, the use of the recombinant SmSirt2 expressed in E. coli (collaboration: C. Romier, IGBMC, Illkirch) and the optimization of a fluorimetric assay allowed us to show that SmSirt2 possesses a lysine deacetylase activity (collaboration: M. Jung, University Albert-Ludwigs, Freibourg). Moreover, the use of this assay allowed the setting up of a high-throughput screen (collaboration: J. Schultz, Kancera AB, Stockholm) of more than 80 000 compounds in order to identify novel inhibitors. The most promising candidates were tested on parasites in culture and the results obtained showed that SmSirt2 inhibitors also affect the viability of schistosomula, as well as the stability of pairing and egg production of adult worms.In parallel, we have carried out screening of a yeast two-hybrid cDNA library in order to identify protein partners of Sirt1 in S. mansoni. The partial analysis of the results obtained shows that SmSirt1 interacts with several proteins involved in gene regulation. In the course of this project, using the enzyme expressed in Xenopus oocytes we were able to show that both sirtinol and salermide, inhibitors of human Sirt1, also inhibit the schistosome enzyme (Collaboration: K. Cailliau, University of Sciences and Technologies, Lille).Taken together, the results of this thesis project suggest that sirtuins are potential therapeutic targets for the treatment of schistosomiasis. Of the five orthologues of human sirtuins identified in S. mansoni, SmSirt2 seems to be a promising target. Moreover, high-throughput screening using the recombinant enzyme identified inhibitors that, after bio-guided optimization, could be drug candidates. Finally, these results contribute to a better understanding of the biological role of S. mansoni sirtuins and in particular their importance in parasite survival and reproduction.
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