Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-04-17T18:53:02Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2609607 bytes, checksum: 556bda4a6de90f9be2c592e47697cdca (MD5) / Made available in DSpace on 2017-04-17T18:53:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 2609607 bytes, checksum: 556bda4a6de90f9be2c592e47697cdca (MD5) Previous issue date: 2005-05-13 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / O presente trabalho teve por objetivo o estudo de diversos fatores que influenciam a morfogênese in vitro e o estabelecimento e implementação de protocolo de transformação genética mediada por Agrobacterium para duas espécies de maracujazeiro (Passiflora edulis f. flavicarpa e P. cincinnata). O método de retirada total do tegumento da semente foi efetivo para a germinação de P. cincinnata, sendo a maior produção de plântulas normais obtida em meio MS na sua força total. Melhor resultado de regeneração em P. cincinnata foi obtido em meio MS suplementado com 0,5 mg l -1 de BAP e 10% (v/v) de água de coco, sendo indicado a redução da concentração de BAP pela metade aos 15 dias, no primeiro subcultivo. O uso de ágar Vetec para essa espécie é aconselhável, tendo em vista seu menor custo e maior rendimento obtido de ramos por explante. Apesar do bom alongamento dos ramos regenerados, o enraízamento e a manutenção desses ramos quando individualizados não foi satisfatória. Embriogênese somática foi observada no tratamento cujo meio de cultura foi suplementado apenas com água de coco. Os calos obtidos nesse tratamento foram bastante proliferativos e os embriões formados, em geral, normais. A germinação desses embriões gerou plântulas aclimatadas. morfologicamente Explantes normais, hipocotiledonares as quais puderam ser das duas espécies de maracujazeiro estudadas se mostraram bastante resistentes à Higromicina. Em teste realizado com P. cincinnata, a Higromicina foi menos ativa em meio gelificado com ágar Vetec, em comparação com aquele gelificado com Phytagel. Solução de Agrobacterium com densidade ótica (λ= 600 nm) ajustada para 0,25 se mostrou mais eficiente que aquela ajustada para 0,50. Foram obtidas raízes transformadas por A. rhizogenes de ambas as espécies. Em raízes transformadas de P. cincinnata mantidas em meio seletivo, sem reguladores de crescimento, foi observada a formação de gemas e embriogênese somática. Plantas de P. edulis f. flavicarpa, transformadas com A. tumefaciens SHOOTER, regeneradas em meio sem reguladores de crescimento, não apresentaram reação histoquímica positiva para gus, embora a reação e PCR com primers específicos tenha indicado a presença desse gene no DNA genômico das plantas regeneradas. A combinação de reguladores proposta por DREW (1991) foi eficiente na indução de novo de gemas adventícias em explantes cotiledonares e hipocotiledonares, sendo o acréscimo de 10 μM de STS importante para o incremento do número de ramos, principalmente em explantes hipocotiledonares, que se mostraram mais sensíveis ao etileno. O tratamento com enzimas pecto-celulolíticas foi bastante eficiente na indução de regeneração ao longo do explante, sendo essa uma característica que poderá ser bastante útil em protocolos de transformação genética mediada por Agrobacterium. / The present work had for objective study of diverse factors that influence the in vitro morphogenesis and the genetics Agrobacterium- mediated transformation for two species of passion fruit (Passiflora edulis f. flavicarpa e P. cincinnata). The total withdrawal of teguments of seeds method was effective for the germination of P. cincinnata, being the biggest production of normal seedlings was obtained in half salts concentration of MS media. Better resulted of regeneration in P. cincinnata it was gotten in MS media supplemented with 0,5 mg l -1 of BAP and 10% (v/v) of coconut water, being indicated the reduction of the concentration of BAP for the half to 15 days, in the first subculture. The use of VetecTM agar-agar is advisable, having in sight its lesser cost and greater income of branches for explant. Despite the good along of the regenerated branches, the rooting and the maintenance of these branches when isolated was not satisfactory. Somatic embryogenesis was observed in the treatment whose media was supplemented only with coconut water. Callus gotten in this treatment had been very proliferated and the embryos formed, in general, were normal. The germination of these embryos generated seedlings morphologically normal, which could have been acclimatized. Hypocotyls explants of the two studied species of yellow passion fruit showed sufficiently resistant to the Hygromycin. In test carried through with P. cincinnata, the Hygromycin was less active in media gelling with VetecTM agar-agar in comparison with the one with PhytagelTM. Solution of Agrobacterium with optical density (λ= 600 nm) adjusted for 0.25 showed more efficient that that one adjusted for 0.50. They had been gotten roots transformed for A. rhizogenes of both the species. In roots transformed of P. cincinnata kept in selective media, without growth regulators, it was observed the formation of buds and somatic embryogenesis. Plants of P. edulis f. flavicarpa, transformed with A. tumefaciens SHOOTER, regenerated in way without growth regulators not they had presented positive histochemical reaction for gus, even so reaction e PCR with primers specific it has indicated the presence of this gene in the DNA genomic of the regenerated plants. The plant growth regulators combination of proposal for DREW (1991) it was efficient in the induction de novo of adventitious buds in cotyledon and hypocotyl explants, being the addition of 10 μM of STS was important for the increment of the number of branches, mainly in hypocotyl explants, that they had revealed more sensible to the ethylene. The treatment with pecto-cellulolytics enzymes were efficient in the induction of regeneration to long of the explant, being this one characteristic that it could be very useful in protocols of Agrobacterium- mediated genetic transformation. / Tese importada do Alexandria

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2016-04-27T08:33:54Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3736622 bytes, checksum: 39fd593857e319e4d9577fd3428a7f25 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-04-27T08:33:54Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 3736622 bytes, checksum: 39fd593857e319e4d9577fd3428a7f25 (MD5) Previous issue date: 2015-03-25 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / A aquisição de competência embriogênica por células somáticas é um processo intrigante e necessita da junção de dados genético-moleculares e citológicos para melhor compreensão dos mecanismos e mudanças celulares envolvidas. À vista disso, os objetivos desse trabalho foram isolar e caracterizar o padrão de expressão dos genes SERK e BBM por hibridização in situ durante o processo de embriogênese somática em Passiflora cincinnata, avaliar a responsividade morfogênica in vitro de P. setacea e P. cincinnata submetidas a condições de indução de embriogênese somática, bem como, acompanhar a mobilização de reservas e a expressão dos genes supracitados durante a embriogênese somática. Para tal, a partir de calos embriogênicos de P. cincinnata, com 20 dias em meio de indução (MI), extraiu-se o RNA total e obteve-se o cDNA, o qual serviu como molde para amplificação da sequência codante utilizando-se primers degenerados para SERK e BBM. A responsividade de embriões zigóticos maduros de P. setacea e P. cincinnata foi avaliada mediante o cultivo em meio de indução alternativo constituído por sais MS suplementado com 31,06 μM de Picloram + 2,22 μM de BA + 2,27 μM de TDZ (MIP) + 500 mg L -1 de Extrato de Malte (EM) + 13,77 μM de Espermidina (Spd). Após 30 dias as culturas foram transferidas ao meio de maturação (MM) composto de meio MS acrescido de 1,0% de carvão ativado e ausência de reguladores de crescimento. Amostras com 0, 10, 20 e 30 dias foram coletadas para microscopia de luz, microscopia eletrônica de varredura, testes histoquímicos e hibridização in situ, todas seguindo protocolos específicos. Para visualização da expressão dos genes SERK e BBM foi gerada uma sonda de RNA a partir de um clone sequenciado de P. cincinnata. Para P. setacea utilizou-se uma sonda heteróloga sense e antisense de P. cincinnata. O relacionamento filogenético das sequências isoladas de P. cincinnata comparadas às de outras espécies apontou que as funções das proteínas podem ser conservadas na espécie. Em SERK, o Pc contig1 agrupou-se com membros de SERK1 e SERK2, enquanto o Pc contig2 agrupou-se com membros de SERK3/BAK1. Por sua vez, o Pc contig1 de BBM, agrupou-se com membros de BBM1 e BBM2. A expressão do gene SERK foi constatada em embriões zigóticos e gradualmente diminuída até os 20 dias em MI. Aos 30 dias em MI, embriões somáticos globulares foram intensamente marcados, assim como em embriões com 5 e 40 dias em MM. Transcritos do BBM foram observados em embriões zigóticos, no entanto, a expressão foi cessada no decorrer do desenvolvimento dos embriões somáticos. A expressão foi retomada em embriões somáticos cotiledonares após 40 dias em MM, assemelhando-se ao observado no embrião zigótico. Observou-se que em P. setacea, durante o processo embriogênico, houve formação de protuberâncias que deram origem a zonas pró-embriogênicas, as quais se desenvolveram em embriões somáticos. Já em P. cincinnata houve proliferação das células do meristema fundamental e formação de meristemoides, caracterizando regiões organogênicas. Quando transferidos ao meio de maturação não houve regeneração de plantas a partir de embriões somáticos em P. setacea. Em P. cincinnata houve intumescimento das regiões calejadas e, em alguns casos, formação de primórdios foliares. Quanto à expressão gênica, em P. setacea foi constatada expressão de BBM e SERK em todas as fases analisadas, especialmente em protuberâncias e embriões somáticos formados. P. cincinnata, por sua vez, também apresentou transcritos dos genes BBM e SERK em todas as fases analisadas, sendo intensificado o sinal de hibridização na periferia dos explantes e regiões meristemáticas após 20 dias em MI. P. setacea apresentou corpos proteicos com decréscimo gradativo até os 30 dias em meio de indução. Houve presença de carboidratos e amido no explante e seu decréscimo após 10 dias, e verificou-se a síntese de novo de amido aos 30 dias de indução, quando há formação de embriões somáticos. Não foi verificada a presença de corpos lipídicos durante o processo embriogênico. Já em P. cincinnata, constatou-se corpos proteicos e amido de forma moderada em todas as etapas de desenvolvimento e a presença de carboidratos totais e corpos lipídicos foi averiguada nas fases iniciais de indução. Após 20 dias, houve mobilização dessas substâncias de reserva concomitantemente com a formação e desenvolvimento de meristemoides. Deste modo, sugere-se que a expressão desses genes está associada aos processos de aquisição de competência embriogênica e podem servir como marcadores moleculares desse processo. Os resultados do isolamento e expressão dos genes SERK e BBM em P. cincinnata são inéditos e contribuem para o melhor entendimento dos processos que envolvem a embriogênese somática na espécie. Nosso trabalho apresenta dados inéditos da indução de embriões somáticos em P. setacea e como as espécies estudadas apresentam respostas morfogênicas divergentes quando submetidas ao mesmo meio de indução. E ainda, relatamos à expressão dos genes BBM e SERK e a mobilização de compostos de reserva no decorrer dos eventos morfogênicos in vitro em P. setacea e P. cincinnata. / The acquisition of embryogenic competence in somatic cells is intriguing process and requires both molecular-genetic and cytological knowledge to better understand the mechanisms and cellular changes involved. Based on this, the aim of this study was to isolate and characterize the expression of SERK and BBM genes in somatic embryos of Passiflora cincinnata, as well as to evaluate the morphogenic in vitro response of Passiflora setacea and P. cincinnata somatic embryogenesis inducted and monitoring the reserve mobilization and expression of the these genes during embryogenesis. For this, RNA was extracted and cDNA was obtained from embryogenic calli of P. cincinnata after 20 days in induction medium (IM), which was used as template for the coding sequence amplification with degenerate primers of SERK and BBM. Mature zygotic embryos of P. setacea and P. cincinnata were inoculated on MS medium supplemented with 31.06 μM of picloram + 2.22 μM of benzyladenine + 2.27 μM of thidizuron + 500mg L -1 of malt extract + 13.77 μM of spermidine. After 30 days, the cultures were transferred to the maturation medium (MM), composed of MS medium supplemented with 1 % of activated charcoal without growth regulators. Samples with 0, 10, 20 and 30 days were collected for light microscopy, scanning electron microscopy, histochemical analyzes and in situ hybridization, following specific protocols. A RNA probe from P. cincinnata cDNA was generated to figure out the expression of SERK and BBM genes, whereas to P. setacea a heterologous sense and antisense probe of P. cincinnata was used. The phylogenetic relationship of P. cincinnata isolated sequences compared with other species suggests that the functions of the proteins are preserved. In SERK, the Pc contig1 grouped up with SERK1 and SERK2 members, while the Pc contig2 grouped with SERK3/BAK1 members. On the other hand, the BBM Pc contig1 was grouped with BBM1 and BBM2 members. The expression of SERK gene was found in zygotic embryos and gradually decreased until 20 days in the IM. After 30 days in the IM, globular somatic embryos were intensely marked with the hybridization signal, as well as embryos with 5 and 40 days in the MM. BBM transcripts were observed in zygotic embryos, but the expression was stopped during the somatic embryos development. The expression was resumed in somatic globular embryos after 40 days in the MM, similar to that observed in zygotic embryos. In the second chapter, in P. setacea embryogenesis process, it was observed the formation of lumps that originate pro-embryogenic zones, which developed into somatic embryos. In P. cincinnata a proliferation of the ground meristem cells and meristemoids formation occurred, emphasizing organogenic regions. When transferred to MM, there was no plant regeneration from somatic embryos of P. setacea. In P. cincinnata, swelling of callus regions and, in some cases, formation of leaf primordia was observed. Regarding the gene expression, in P. setacea there was BBM and SERK expression in all stages, especially in lumps and somatic embryos. Also P. cincinnata showed transcripts of BBM and SERK genes in all stages, with intensification of the hybridization signal at the explants edges and meristematic regions after 20 days in the IM. Protein bodies were found in P. setacea, decreasing gradually until 30 days in the IM. Carbohydrate and starch levels decreased after 10 days, but there was de novo synthesis of starch at 30 days of induction, coupled with the somatic embryos formation. No lipid bodies during the embryogenic process were verified. In P. cincinnata protein bodies and starch were moderately present in all development stages whereas carbohydrates and lipid bodies were present only at the early stages of induction. After 20 days, these reserve substances were mobilized, along with the meristemoids formation and development. Therefore, it is suggested that the expression of these genes is associated with embryogenic competence acquisition process and can be a molecular marker of this process. These results of isolation and expression of SERK and BBM genes in P. cincinnata are original and contribute to a better understanding of the processes involving somatic embryogenesis in this species. This work brings a new approach for somatic embryogenesis induction in P. setacea and highlights how these two species show different responses when submitted to the IM. In addition, the expression of the genes BBM and SERK as well as the mobilization of reserve compounds during in vitro morphogenic events in P. setacea and P. cincinnata were related.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:17Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2008-05-19Bitstream added on 2014-06-13T20:26:30Z : No. of bitstreams: 1 faria_ga_dr_ilha_prot.pdf: 2915526 bytes, checksum: 6eed63992f54372dba74ee2762c7ab68 (MD5) / Estudos preliminares referentes ao tipo de explante, meio de cultura são necessários para se definir protocolos de estabelecimento, desenvolvimento, multiplicação e conservação in vitro, bem como garantir a fidelidade na resposta morfogênica. A determinação do número ideal de repetições e do tamanho ótimo de parcelas experimentais é uma das maneiras de se aumentar a precisão experimental e, conseqüentemente, maximizar as informações obtidas em um experimento. Este trabalho teve por objetivo a determinação do tamanho ótimo de parcelas em experimentos in vitro nas etapas de estabelecimento, desenvolvimento, multiplicação e conservação de Passiflora sp. Foram conduzidos sete experimentos, com diversos ensaios de uniformidade com as espécies Passiflora giberti N.E. Brown., P. edulis Sims f. edulis, e P. laurifolia L.. Foram simulados diversos tamanhos e formas de parcelas, em que cada frasco com um explante foi considerado como uma unidade básica (parcela), os quais foram combinados formando parcelas com até 10, 25 e 50 frasco com um explante por unidade básica, em função do tipo de experimento. Para a estimação do tamanho ótimo de parcelas empregou-se o método da máxima curvatura modificado. De acordo com os resultados obtidos para experimentos in vitro com a espécie P. giberti N. E. Brown., o tamanho ótimo de parcelas recomendado é o de 15 frasco com um explante para experimentos de estabelecimento, 10 frasco com um explante por parcela para experimentos com conservação e 13 frasco com um explante para experimentos com desenvolvimento. Para a espécie P. edulis Sims f. edulis, o tamanho ótimo de parcelas recomendado é o de 11 frasco com um explante para experimentos de estabelecimento e 26 frasco com um explante para experimentos de multiplicação. Para a espécie P. laurifolia L., o tamanho ótimo de parcela deve ser de 9 frasco com um explante para... / Preliminary studies concerning to explant type and culture medium are necessary to define establishment, development multiplication and in vitro conservation protocols, as well to guarantee fidelity in morphogenic response. One of the ways to increase experimental precision is to determinate the ideal number of repetitions and the optimal size of plots and maximize informations obtained in a experiment. This work aimed to determinate optimal size of plots in in vitro experiments for establishment, development, multiplication e conservation of Passiflora sp. Seven experiments were made, with several uniformity essays with Passiflora giberti N.E. Brown., P. edulis Sims f. edulis, e P. laurifolia L. species. Various sizes and plot forms were simulated, where as each bottle with a explain was considered as the basic unit till 10, 25 e 50 bottles with a explant by basic unit. Modified maximum curvature method was employed to estimate the optimal size of plots. According to results in vitro experiments with P. giberti N. E. Brown. species, optimal size of plots recommended is 15 bottles with a explant in establishment experiments, 10 bottles with a explant by plot in conservation experiments and 13 bottles with a explant in development experiments. The optimal size of plots recommended to P. edulis Sims f. edulis species is 11 bottles with a explant in establishment experiments and 26 bottles with a explant in multiplication experiments. The optimal size of plots to P. laurifolia L. species is 9 bottles with a explant in establishment experiments and 34 bottles with a explant in multiplication experiments, considering available variables in all experiments. The results obtained can subsidize with Passiflora culture in vitro experiments under different conditions