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Le chromosome circulaire de la bactérie Escherichia coli est composé de quatre macrodomaines et deux régions non structurées. Cette organisation influence la ségrégation des chromatides sœurs et la mobilité de l’ADN chromosomique. La structuration de la région terminus (Ter) en macrodomaine est lié à l’interaction de la protéine MatP avec la séquence cible de 13 pb (sic) appelée matS répétée 23 fois dans ce domaine de 800 kb. Le travail réalisé durant ma thèse a permis l’identification et la caractérisation d’un système site-spécifique qui restreint à la région Ter un effet associé à la protéine MatP qui contraint la mobilité de l’ADN et retarde la ségrégation de loci après réplication. Deux séquences spécifiques de 12 pb localisées dans les macrodomaines Right et Left sont requises et suffisantes pour arrêter la propagation du processus de contrainte sur le reste du chromosome. Les changements de propriétés de l’ADN ne sont pas dus à la présence d’un procédé agissant en trans mais probablement à un effet agissant en cis à longue distance et partant des sites matS. De manière remarquable, ces changements de propriétés sont régulés au cours du cycle cellulaire et ne sont présents seulement quand le macrodomaine Ter est associé à la machinerie de division au centre de la cellule. L’insulation de la région Ter requière une protéine nouvellement identifiée comme encrée à la membrane que nous avons nommé TidP et qui a été conservé avec la protéine MatP au cours de l’évolution. Nos résultats indiquent que deux systèmes d’organisation spécifiques sont requis pour l’organisation du macrodomaine Ter au cours du cycle cellulaire. Un second aspect de mon travail a été la caractérisation des mécanismes de contraintes affectant les macrodomaines Right et Left. Nous avons montré, en étudiant le comportement de grands cercles d’ADN excisés, que les propriétés de ces macrodomaines sont conservées dans un contexte extra-chromosomique. Ces résultats suggèrent l’implication d’éléments associés à la molécule d’ADN dans ces macrodomaines et responsable de leur organisation. / The organization of the Escherichia coli chromosome into a ring composed of four macrodomains and two less-structured region influences the segregation of sister chromatids and the mobility of chromosomal DNA. The structuring of the terminus region (Ter) into a macrodomain relies on the interaction of the protein MatP with a 13 bp target called matS repeated 23 times in the 800-kb long domain. The work performed during my Ph. D. allowed the identification and characterization of a site-specific system that restricts to the Ter region an effect associated to MatP that constrains DNA mobility and delays loci segregation. Two specific 12 bp sequences located in the flanking Left and Right macrodomains are required and sufficient to impede the spreading of the constraining process to the rest of the chromosome. The change of DNA properties does not rely on the presence of a trans-acting process but rather involves a cis-effect acting at a long distance from matS sites. Remarkably, the constraining process is regulated during the cell cycle and occurs only when the Ter MD is associated with the division machinery at mid-cell. Insulation of the Ter region requires a newly identified membrane-anchored protein designated TidP conserved with MatP through evolution. Our results indicate that 2 specific organizational systems are required for the management of the Ter region during the cell cycle. A second aspect of my work, consisted in the characterization of constraining mechanisms affecting the Right and Left macrodomains. I have shown, using excisions of large chromosomal rings, that their macrodomain properties were conserved in an extrachromosomal context, suggesting that a chromatin like structuring was involved in their organization.

La molécule d’ADN d’un chromosome décondensé a toujours une taille supérieure au volume de la cellule. Elle doit donc être compactée tout en restant fonctionnelle pour les grandes fonctions cellulaires telles que l’expression des gènes, la réplication et la ségrégation fidèle des chromosomes. Cette compaction fait appel à une structuration finement régulée à différentes échelles chez la bactérie Escherichia coli. A l’échelle moléculaire, le chromosome est maintenu sous une forme surenroulée négative par deux types de surenroulement, l’un « contraint » par la fixation de protéines à l’ADN formant le nucléoïde, et l’autre « libre », diffusible le long du chromosome. A l’échelle sub-cellulaire, le chromosome d'E. coli est composé de quatre régions chromosomiques appelées Macro-Domaines (MD) (Ori, Right, Left, Ter), isolées spatialement et génétiquement, ainsi que de deux régions non structurées (NSR, NSL). La structuration du MD Ter résulte de la liaison de dimères de la protéine MatP sur 22 séquences palindromiques matS de 13 pb. L’absence de MatP entraînant une décondensation relative de l’ADN dans cette région, il est supposé qu’un tétramère de MatP ponte deux sites matS. Mon projet de thèse a consisté à étudier le contrôle de la topologie de l’ADN chromosomique chez la bactérie E. coli et à montrer sa relation avec l’organisation en MD et la formation de la chromatine. J’ai adapté un système rapporteur basé sur la réaction de résolution du transposon gamma delta (Tn1000) qui implique la formation d’une structure d’ADN surenroulée. Ce test a permis de mesurer à la fois le niveau de surenroulement de la molécule d’ADN mais également sa capacité à coulisser, révélant la présence de barrières topologiques. Ces travaux montrent que le niveau de surenroulement diffusible varie localement et suivant les conditions de croissance, impliquant un rôle prépondérant de la réplication, de la transcription et des protéines de fixation à l’ADN. Cependant, le système Res ne suffit pas à déterminer le mécanisme précis par lequel l’ADN est contraint par un déterminant comme MatP ; un système optimal devra combiner les résultats de capture de conformation de chromosome, de Microscopie à Super Resolution et de mesure du surenroulement. / Decondensed DNA molecule of a chromosome is always larger than the volume of the cell. It must therefore be compacted while remaining functional for the major cellular functions such as gene expression, replication and faithful segregation of chromosomes. This compaction uses a tightly regulated structure at different scales in the bacterium Escherichia coli. At the molecular level, the chromosome is maintained under a negative supercoiled form by two types of supercoiling, one "constrained" by the DNA binding protein forming the nucleoid and the other "free" and diffusible along the chromosome. At the subcellular level, the chromosome of E. coli is composed of four chromosomal regions called Macro-Areas (R) (Ori, Right, Left, Ter), spatially and genetically isolated, and two unstructured regions (NSR NSL) .The structure of the MD results from the Ter dimer protein binding of MatP palindromic sequences of 22 bp 13 masts. As the absence of MatP causes relative decondensation of DNA in this region, it is assumed that a tetramer of two MatP bounds two matS sites. My thesis project was to study the control of the chromosomal DNA topology in E. coli and to show its relationship with the organization in MD and chromatin. I’ve adapted a suitable reporter system based on the reaction of resolution of the gamma delta (Tn1000) transposon which involves the formation of a supercoiled DNA structure. This test was used to measure both the level of DNA supercoiling molecule but also its ability to slide, revealing the presence of topological barriers. This work shows that the level of free supercoiling varies locally according to the conditions of growth, implying a major role in the replication, transcription and protein binding to DNA. However, Res system is not sufficient to determine the precise mechanism by which DNA is constrained by a determinant as MatP; an optimal system will combine the results of capture of chromosome conformation of Microscopy Super Resolution and measurement of supercoiling.

Escherichia coli, comme la majorité des bactéries, possède un unique chromosome circulaire. Au moins une copie du chromosome doit être transmise à chacune des cellules filles avant la division cellulaire afin d'assurer une prolifération cellulaire correcte. Une couplage spatio-temporel précis de la ségrégation avec la division cellulaire est donc nécessaire pour assurer la bonne répartition des deux chromosomes après réplication. La région terminale du chromosome (ter) est la dernière à être répliquée et ségrégée, et migre du pôle vers le centre de la cellule au moment de la mise en place du septum de division, à la fin du cycle cellulaire. Les loci de la région ter présentent une période de cohésion post-réplicative étendue. Cette cohésion étendue est contrôlée par la protéine MatP, qui se fixe spécifiquement au niveau des sites matS, présents uniquement dans ter. MatP se fixe à l'ADN sous forme de dimère, via son domaine N-terminal, et tétramérise via son domaine C-terminal. La tétramérisation est stimulée par la liaison à l'ADN et permet le pontage de deux sites matS distants. MatP interagit aussi avec ZapB, un composant du divisome, la machinerie protéique participant à la formation du septum. Alors que la tétramérisation de MatP semble importante pour la compaction de la région ter, son interaction avec ZapB, qui est localisée au septum via ZapA et FtsZ, participe au positionnement et à la cohésion étendue de cette région. Le couplage de la région ter avec le divisome est essentiel pour le bon déroulement de nombreux évènements tardifs du cycle cellulaire : (i) la ségrégation active, ordonnée et progressive de la région ter par FtsK, un composant du divisome, (ii) la résolution des dimères de chromosomes via la recombinaison spécifique de site XerCD/dif, activée par FtsK, (iii) la résolution des liens d'intercaténation par la TopoIV et (iv) la régulation positive de l'assemblage du divisome en absence des régulateurs négatifs MinCDE et SlmA. Pendant ma thèse, je me suis tout d'abord intéressée au rôle de MatP dans la structuration globale du chromosome. En utilisant un système permettant de visualiser deux loci marqués avec un site parSp1 et un site parSpMT1, reconnu par ParBp1 et ParBpMT1 spécifiquement, nous avons analysé le positionnement et l'orientation du chromosome dans la cellule. Nous avons montré que MatP est nécessaire au positionnement et à l'orientation de tout le chromosome à la fin du cycle cellulaire. La localisation de SlmA dans des souches wt et DeltamatP prouve que l'inactivation de MatP, induisant une mauvais positionnement du chromosome, s'accompagne d'une défaut de localisation de SlmA, et induit donc une inhibition de la division. Ces résultats pris ensemble montre que MatP, SlmA et leur communication à travers la structuration globale du chromosome sont importants pour le management du chromosome et le contrôle de la division cellulaire. En collaboration avec l'équipe d'Olivier Espeli, nous avons utilisé des méthodes de génomiques et de biologie moléculaire pour caractériser la régulation de la TopoIV au cours du cycle cellulaire d'E. coli. Nous avons montré qu'au site dif, les activités de fixation et de clivage de la TopoIV sont améliorées par la présence des recombinases XerCD et de MatP. L'amélioration de l'activité de la TopoIV favorise la décaténation des chromosomes nouvellement répliqués et assure, en lien avec d'autres processus, la séparation précise des chromosomes frères. Ces résultats permettent de mieux comprendre le réseau d'interactions dédiées au management du chromosome à la fin du cycle cellulaire, et l'influence du management du chromosome sur le contrôle de la division cellulaire. / Escherichia coli, as the majority of bacteria, has a unique circular chromosome. Faithfull cell proliferation requires that a least one copy of the chromosome is transmitted to sister cells prior to cell division. A strict temporal and spatial coupling of chromosome segregation with cell division is thus required to ensure the accurate separation of the two fully replicated chromosomes. The terminal region of the chromosome (ter) is the last one to be replicated and segregated, and moves from the pole to the middle of the cell where the division septum is formed, at the end of the cell cycle. Loci of the ter region display an extended cohesion period. This extended cohesion is controlled by the MatP protein, which binds specific matS sites restricted to the ter region. MatP binds DNA as a dimer and forms tetramers via its N-terminal and C-terminal domains respectively. Tetramerisation is stimulated by binding to DNA and pairs remote matS sites. MatP also interacts with ZapB, a component of the divisome, the protein machinery that contributes to septum formation. While tetramerisation of MatP appears important for compacting the ter region, its interaction with ZapB, which is localized at the septum via ZapA and FtsZ, is involved in the positioning and the extended cohesion of this region. The linkage of the ter region with the divisome is required for the success of many later events of the cell cycle : (i) the active, ordered and progressive segregation of the ter region by FtsK, a component of the divisome, (ii) resolution of chromosome dimers via the site-specifique recombination XerCD/dif, activated by FtsK, (iii) the resolution of intercatenation links by TopoIV and (iv) the positive regulation of divisome assembly in the absence of the negative regulators MinCDE and SlmA. During my thesis, I first studied the role of MatP in the chromosome management. By using pairs of loci tagged with parSp1 and parSpMT1 sites recognized by cognate ParB-XFP proteins, we directly analysed chromosome positioning and orientation in the cell. We show that MatP is required for normal positioning and orientation of the whole chromosome at the end of the cell cycle. The localisation of SlmA in wt and Delta matP strains proves that inactivation of MatP leads to inaccuracy of nucleoid positioning accompanied by defects in SlmA localisation, and thus induces division inhibition. Take together, these results show that MatP, SlmA and their interplay are important for chromosome management and control of cell division in E. coli. In collaboration with O. Espeli's team, we have used genomic and molecular biology methods to characterize TopoIV regulation during the E. coli cell cycle. We show that at the dif site, TopoIV binging and cleavage are enhanced by the presence of the XerCD recombinases and MatP. This enhancement of TopoIV activity at dif promotes decatenation of fully replicated chromosomes and ensure, through interaction with other processes, accurate separation of sister chromosomes. These results provide insight into the protein network dedicated to the final step of chromosome management during the cell cycle, and how the chromosome management is linked to cell division.

This work is concerned with the genetic basis of normal human pigmentation variation. Specifically, the role of polymorphisms within the solute carrier family 45 member 2 (SLC45A2 or membrane associated transporter protein; MATP) gene were investigated with respect to variation in hair, skin and eye colour ― both between and within populations. SLC45A2 is an important regulator of melanin production and mutations in the gene underly the most recently identified form of oculocutaneous albinism. There is evidence to suggest that non-synonymous polymorphisms in SLC45A2 are associated with normal pigmentation variation between populations. Therefore, the underlying hypothesis of this thesis is that polymorphisms in SLC45A2 will alter the function or regulation of the protein, thereby altering the important role it plays in melanogenesis and providing a mechanism for normal pigmentation variation. In order to investigate the role that SLC45A2 polymorphisms play in human pigmentation variation, a DNA database was established which collected pigmentation phenotypic information and blood samples of more than 700 individuals. This database was used as the foundation for two association studies outlined in this thesis, the first of which involved genotyping two previously-described non-synonymous polymorphisms, p.Glu272Lys and p.Phe374Leu, in four different population groups. For both polymorphisms, allele frequencies were significantly different between population groups and the 272Lys and 374Leu alleles were strongly associated with black hair, brown eyes and olive skin colour in Caucasians. This was the first report to show that SLC45A2 polymorphisms were associated with normal human intra-population pigmentation variation. The second association study involved genotyping several SLC45A2 promoter polymorphisms to determine if they also played a role in pigmentation variation. Firstly, the transcription start site (TSS), and hence putative proximal promoter region, was identified using 5' RNA ligase mediated rapid amplification of cDNA ends (RLM-RACE). Two alternate TSSs were identified and the putative promoter region was screened for novel polymorphisms using denaturing high performance liquid chromatography (dHPLC). A novel duplication (c.–1176_–1174dupAAT) was identified along with other previously described single nucleotide polymorphisms (c.–1721C>G and c.–1169G>A). Strong linkage disequilibrium ensured that all three polymorphisms were associated with skin colour such that the –1721G, +dup and –1169A alleles were associated with olive skin in Caucasians. No linkage disequilibrium was observed between the promoter and coding region polymorphisms, suggesting independent effects. The association analyses were complemented with functional data, showing that the –1721G, +dup and –1169A alleles significantly decreased SLC45A2 transcriptional activity. Based on in silico bioinformatic analysis that showed these alleles remove a microphthalmia-associated transcription factor (MITF) binding site, and that MITF is a known regulator of SLC45A2 (Baxter and Pavan, 2002; Du and Fisher, 2002), it was postulated that SLC45A2 promoter polymorphisms could contribute to the regulation of pigmentation by altering MITF binding affinity. Further characterisation of the SLC45A2 promoter was carried out using luciferase reporter assays to determine the transcriptional activity of different regions of the promoter. Five constructs were designed of increasing length and their promoter activity evaluated. Constitutive promoter activity was observed within the first ~200 bp and promoter activity increased as the construct size increased. The functional impact of the –1721G, +dup and –1169A alleles, which removed a MITF consensus binding site, were assessed using electrophoretic mobility shift assays (EMSA) and expression analysis of genotyped melanoblast and melanocyte cell lines. EMSA results confirmed that the promoter polymorphisms affected DNA-protein binding. Interestingly, however, the protein/s involved were not MITF, or at least MITF was not the protein directly binding to the DNA. In an effort to more thoroughly characterise the functional consequences of SLC45A2 promoter polymorphisms, the mRNA expression levels of SLC45A2 and MITF were determined in melanocyte/melanoblast cell lines. Based on SLC45A2’s role in processing and trafficking TYRP1 from the trans-Golgi network to stage 2 melanosmes, the mRNA expression of TYRP1 was also investigated. Expression results suggested a coordinated expression of pigmentation genes. This thesis has substantially contributed to the field of pigmentation by showing that SLC45A2 polymorphisms not only show allele frequency differences between population groups, but also contribute to normal pigmentation variation within a Caucasian population. In addition, promoter polymorphisms have been shown to have functional consequences for SLC45A2 transcription and the expression of other pigmentation genes. Combined, the data presented in this work supports the notion that SLC45A2 is an important contributor to normal pigmentation variation and should be the target of further research to elucidate its role in determining pigmentation phenotypes. Understanding SLC45A2’s function may lead to the development of therapeutic interventions for oculocutaneous albinism and other disorders of pigmentation. It may also help in our understanding of skin cancer susceptibility and evolutionary adaptation to different UV environments, and contribute to the forensic application of pigmentation phenotype prediction.