As técnicas de cultivo de folículos e oócitos in vitro, com o objetivo de se obter oócitos maduros para procedimentos de Reprodução Assistida (RA), têm sido aplicadas em diferentes contextos. O sucesso destes procedimentos está diretamente relacionado ao sistema de cultivo utilizado. A utilização de células da granulosa (CG) humanas cultivadas in vitro como um suporte para o co-cultivo destes oócitos imaturos e folículos tem sido descrita por alguns autores. A criopreservação destas células, considerando-se o contexto de sua obtenção em procedimentos de RA, permitiria a viabilização da aplicação destas células na prática clínica diária. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi padronizar o congelamento de células da granulosa (CG) humanas para aplicação em sistemas de co-cultivos de folículos e oócitos imaturos. Foram obtidas CG de 20 voluntárias em tratamento de reprodução assistida, células de 10 voluntárias foram cultivadas em meio ?-MEM suplementado para interrupção da luteinização e congeladas após 48 horas em container \"Cryostep\" (grupo 2C- 2 cultivos) (etapa 2) e células de 10 voluntárias foram congeladas em container \"Cryostep\" sem cultivo prévio (grupo CD- congelamento direto) (etapa 3). Após o descongelamento estas células foram (re)cultivadas por 144 horas, com troca de meio em 48, 96 e 144 horas para avaliações da produção de estradiol (E2) e progesterona (P4) (ng/mL). Verificamos redução na contagem celular e na viabilidade celular tanto no método de congelamento direto (CD) quanto no método com dois cultivos (2C) após o descongelamento (p<0,05), e isso se refletiu na produção de estradiol e progesterona que foi maior nas culturas de células frescas em relação às células criopreservadas (p<0,05). Porém, a relação de E2/célula foi mantida após o descongelamento, sugerindo que esta redução na produção se deve à redução no número de células, as que sobrevivem se mantém normofuncionantes (p=0,23).O CD foi mais eficiente pois permitiu uma maior recuperação celular e uma melhor viabilidade quando comparado ao grupo 2C. A relação estradiol/progesterona foi mantida em todos os tempos de cultivo, fresco, CD e 2C (p>0,05), indicando que a característica funcional destas células foi preservada após o descongelamento. Concluímos que a criopreservação de CG humanas obtidas durante a captação de oócitos compromete a contagem celular e a viabilidade geral da cultura, entretanto, a capacidade funcional e a característica destas células se mantêm preservadas (manutenção das relações E2/célula e E2/P4) / Follicle and oocyte in vitro culture techniques, aiming to obtain mature oocytes for Assisted Reproductive Treatments (ART), have been applied to different contexts. The success of these procedures depends on the culture system used. The use of human granulosa cells (GC) in co-culture systems for follicle and oocyte maturation have been described by some authors. The cryopreservation of these cells, considering the context in which they are obtained during ART, would enable the usage of these cells in such procedures in daily clinical practice. Thus, the objective of this study was to standardize the freezing protocol for human granulosa cells (GC) for future applications in co-culture systems for follicle and oocyte maturation. Twenty volunteers submitted to ART donated their granulosa cells after oocyte retrieval, 10 were cultivated previously in order to interrupt the luteinization process and then frozen \"Cryostep\" container (group 2C- two cultures) (step 2) and 10 were directly frozen with no previous culture in the \"Cryostep\" container (group DF- direct freeze) (step 3). After thawing these cells were (re)cultured for 144 hours, with medium exchange at 48, 96 and 144 hours to evaluate the estradiol (E2) and progesterone (P4) production (ng/mL). After thawing, there was a reduction in the cell number (p<0,05) and cell viability in both methods, the direct freezing (DF) and the two cultures (2C) (p<0,05); this had an impact in the production of estradiol and progesterone, which were higher in fresh cultures than in the frozen ones (p<0,05). However, the E2/cell ratio was maintained after thawing (p=0.23), suggesting that this impairment in steroid production was probably due to the reduction in the cell count. The cells that survive remain functionally normal. The DF was more efficient since it allowed greater cell recovery and better viability when compared to 2C. The estradiol/progesterone ratio was maintained in all culture times, in the fresh, DF or 2C groups (p>0.05), indicating that the functional characteristic of these cells was preserved post-thawing. We conclude that cryopreservation of human GC obtained during oocyte retrieval compromises the cell count and the overall viability of the culture; however, the functional capacity and the characteristic of these cells are preserved (maintenance of E2/cell and E2/P4 relations)

Made available in DSpace on 2016-12-08T16:24:20Z (GMT). No. of bitstreams: 1 PGCA15MA161.pdf: 119035 bytes, checksum: a5dfaf04161545272882e1423c258dc0 (MD5) Previous issue date: 2015-02-27 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The in vitro embryo production has a strong commercial and preservationist impact in Brazil. However, there are still barriers to be overcome, since the in vitro maturation does not mimic the in vivo maturation. The maturation optimization increases the embryo competence and quality, making them more cryotolerants. The meiotic blockage, after oocytes removal from their follicular environment, may be a good alternative. Three experiments (n = 2848) evaluated the Cordicepim as a meiotic blocker in bovine oocytes in different culture media, and its influence on embryonic development. Follicles 3-8 mm diameter, were punctured from abattoir ovaries and allocated into 4 groups: Control (TCM-199 + pyruvate, FSH, LH and SFB); MIVCord (TCM-199 + Pyruvate, FH, LH, FCS, Cordicepim); TCMCor (TCM-199 + Cordicepim) and TCMCont (TCM-199), followed by standard maturation (IVM) for 20 or 24 h. The effect of meiosis blockage in embryo production was assessed by cleavage and blastocyst rate, and total number of cells assessed. To evaluate the stage of maturation, oocytes were stained with Hoechst and evaluated by microscopy. Quantitative data were analyzed by ANOVA and Tukey test and the qualitative data by chi-square, with 5% significance. Cordicepim did not affect cleavage (60.7 vs. 56.4%) and blastocysts (30.7 vs. 24.8%) rates when added to supplemented medium (MIVCord). However, there was a reduction in cleavage (42%) and blastocysts (12.1%) rates when added to a medium without supplements (TCMCord). On the kinetics of maturation after 6 hours of pre culture, only TCMCord group maintained most oocytes blocked. Cell density of the produced embryos (26 h maturation) in MIVcont groups (189.2 ± 11.4), MIVCord (187.1 ± 12.1) and TCMCont (171.2 ± 10.4) did not differ and were higher than TCMCord group (119.7 ± 11.4). Already, with 30 h maturation cell density was similar between embryos from control group (224.2 ± 17.5) and TCMCord group (240.1 ± 10.4). However, even with 30 h maturation, only 64.8% of the oocytes completed maturation in TCMCord group, while 100% maturated in Control group. We conclude that 6 h of culture in cordicepim in the absence of gonadotropins, partially inhibits the meiosis in oocytes, and this inhibition is not successfully reversed even after 24 hours of maturation pattern in the absence of cordicepim. The cordicepim reduces embryo production when in vitro maturation is performed for 26 h. However, within 30 h maturation time, the Cordicepim does not affect embryo production rate. Yet, the cordicepim prevents the cumulus cells expansion in an irreversible manner / A produção in vitro de embriões tem um forte impacto comercial e preservacionista no Brasil. Entretanto ainda existem barreiras a serem superadas, já que a maturação in vivo não é totalmente mimetizada pela maturação in vitro. A otimização da maturação pode aumentar a competência e a qualidade embrionária, tornando-os mais criotolerantes. Uma boa alternativa pode ser o bloqueio meiótico reversível. Três experimentos (n = 2848) avaliaram o Cordicepim como bloqueador meiótico para oócitos bovinos, em diferentes meios de cultivo e sua influência no desenvolvimento embrionário. Folículos de 3-8 mm, obtidos por aspiração de ovários de frigorífico foram distribuídos em 4 grupos: Controle (TCM-199 + piruvato, FSH, LH e SFB) MIVCord (TCM-199 +Piruvato, FH, LH, SFB, Cordicepim) TCMCor (TCM-199 + Cordicepim) e TCMCont (TCM-199), seguido de maturação padrão (MIV) por 20 ou 24 horas. O efeito do bloqueio meiótico na produção de embriões foi avaliado pela taxa de clivagem, blastocisto e número total de células. Para avaliação do estágio de maturação, os oócitos foram corados com Hoechst e avaliados por microscopia. Os dados quantitativos foram submetidos à ANOVA e teste de Tukey e os qualitativos ao qui-quadrado, com 5% de significância. O Cordicepim não influenciou as taxas de clivagem (60,7 vs 56,4%) e blastocistos (30,7 vs 24,8%), quando empregado em meio suplementado (MIVCord). Porém, houve uma redução na taxa de clivagem (42%) e blastocistos (12,1%), quando empregado em meio sem suplementos (TCMCord). Na cinética de maturação nuclear após 6 horas de pré-maturação, apenas o grupo TCMCord manteve a maioria dos oócitos bloqueados (67%). A densidade celular dos embriões produzidos (26 h maturação) nos grupos controle (189,2 ± 11,4), MIVCord (187,1 ± 12,1) e TCMCont (171,2 ± 10,4) não diferiram entre si e foram superiores ao grupo TCMCord (119,7 ± 11,4). Já com 30 h de maturação a densidade celular dos embriões foi semelhante entre os grupos controle 30 (224,2 ± 17,5) e TCMCord 30 (240,1 ± 10,4). Porém, mesmo com 24 h de maturação padrão, apenas 64,8% dos oócitos do grupo TCMCord 30 completaram a maturação, enquanto no grupo controle 100% maturaram. Conclui-se que 6 h de pré-maturação em cordicepim, na ausência de suplementos, inibe parcialmente a meiose em oócitos bovinos, porém esta inibição não é revertida com êxito mesmo após 24 horas de maturação padrão na ausência de cordicepim. O cordicepim reduz a produção de embriões in vitro com 26 h de maturação. Já com 30 h de maturação, o Cordicepim não influencia a taxa de produção embrionária. Ainda, o cordicepim impede de forma irreversível a expansão das células do cumulus

As técnicas de cultivo de folículos e oócitos in vitro, com o objetivo de se obter oócitos maduros para procedimentos de Reprodução Assistida (RA), têm sido aplicadas em diferentes contextos. O sucesso destes procedimentos está diretamente relacionado ao sistema de cultivo utilizado. A utilização de células da granulosa (CG) humanas cultivadas in vitro como um suporte para o co-cultivo destes oócitos imaturos e folículos tem sido descrita por alguns autores. A criopreservação destas células, considerando-se o contexto de sua obtenção em procedimentos de RA, permitiria a viabilização da aplicação destas células na prática clínica diária. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi padronizar o congelamento de células da granulosa (CG) humanas para aplicação em sistemas de co-cultivos de folículos e oócitos imaturos. Foram obtidas CG de 20 voluntárias em tratamento de reprodução assistida, células de 10 voluntárias foram cultivadas em meio ?-MEM suplementado para interrupção da luteinização e congeladas após 48 horas em container \"Cryostep\" (grupo 2C- 2 cultivos) (etapa 2) e células de 10 voluntárias foram congeladas em container \"Cryostep\" sem cultivo prévio (grupo CD- congelamento direto) (etapa 3). Após o descongelamento estas células foram (re)cultivadas por 144 horas, com troca de meio em 48, 96 e 144 horas para avaliações da produção de estradiol (E2) e progesterona (P4) (ng/mL). Verificamos redução na contagem celular e na viabilidade celular tanto no método de congelamento direto (CD) quanto no método com dois cultivos (2C) após o descongelamento (p<0,05), e isso se refletiu na produção de estradiol e progesterona que foi maior nas culturas de células frescas em relação às células criopreservadas (p<0,05). Porém, a relação de E2/célula foi mantida após o descongelamento, sugerindo que esta redução na produção se deve à redução no número de células, as que sobrevivem se mantém normofuncionantes (p=0,23).O CD foi mais eficiente pois permitiu uma maior recuperação celular e uma melhor viabilidade quando comparado ao grupo 2C. A relação estradiol/progesterona foi mantida em todos os tempos de cultivo, fresco, CD e 2C (p>0,05), indicando que a característica funcional destas células foi preservada após o descongelamento. Concluímos que a criopreservação de CG humanas obtidas durante a captação de oócitos compromete a contagem celular e a viabilidade geral da cultura, entretanto, a capacidade funcional e a característica destas células se mantêm preservadas (manutenção das relações E2/célula e E2/P4) / Follicle and oocyte in vitro culture techniques, aiming to obtain mature oocytes for Assisted Reproductive Treatments (ART), have been applied to different contexts. The success of these procedures depends on the culture system used. The use of human granulosa cells (GC) in co-culture systems for follicle and oocyte maturation have been described by some authors. The cryopreservation of these cells, considering the context in which they are obtained during ART, would enable the usage of these cells in such procedures in daily clinical practice. Thus, the objective of this study was to standardize the freezing protocol for human granulosa cells (GC) for future applications in co-culture systems for follicle and oocyte maturation. Twenty volunteers submitted to ART donated their granulosa cells after oocyte retrieval, 10 were cultivated previously in order to interrupt the luteinization process and then frozen \"Cryostep\" container (group 2C- two cultures) (step 2) and 10 were directly frozen with no previous culture in the \"Cryostep\" container (group DF- direct freeze) (step 3). After thawing these cells were (re)cultured for 144 hours, with medium exchange at 48, 96 and 144 hours to evaluate the estradiol (E2) and progesterone (P4) production (ng/mL). After thawing, there was a reduction in the cell number (p<0,05) and cell viability in both methods, the direct freezing (DF) and the two cultures (2C) (p<0,05); this had an impact in the production of estradiol and progesterone, which were higher in fresh cultures than in the frozen ones (p<0,05). However, the E2/cell ratio was maintained after thawing (p=0.23), suggesting that this impairment in steroid production was probably due to the reduction in the cell count. The cells that survive remain functionally normal. The DF was more efficient since it allowed greater cell recovery and better viability when compared to 2C. The estradiol/progesterone ratio was maintained in all culture times, in the fresh, DF or 2C groups (p>0.05), indicating that the functional characteristic of these cells was preserved post-thawing. We conclude that cryopreservation of human GC obtained during oocyte retrieval compromises the cell count and the overall viability of the culture; however, the functional capacity and the characteristic of these cells are preserved (maintenance of E2/cell and E2/P4 relations)