As células do cumulus oophorus são firmemente conectadas umas às outras e ao oócito e participam ativamente do amadurecimento oocitário. Essas células apresentam abundância de receptores para o FSH. Os carboidratos da molécula do FSH podem terminar em resíduos de ácido siálico, permitindo que ele exista em numerosas isoformas. As isoformas mais ácidas do FSH contêm mais resíduos de ácido siálico. Os níveis dessas isoformas variam na fase folicular do ciclo menstrual e possuem diferentes capacidades de estímulo ovariano, sendo as menos ácidas mais potentes e de curta meia-vida plasmática. Objetivo: padronizar a técnica de registro eletrofisiológico intracelular para as células do cumulus oophorus humanas e verificar a ação de uma isoforma menos ácida do FSH, a Folitropina Beta (Puregon®) sobre o potencial de membrana dessas células, comparando com a ação de um FSH com menor grau de pureza e mais ácido (FSH ovino). Metodologia: o potencial de membrana foi registrado utilizando células de cumulus oophorus de pacientes encaminhadas ao procedimento de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI). As células do cumulus foram cultivadas em placas de cultura com meio HTF (Life Global® - Guilford, CT USA) acrescido de 10% de Soro Sintético (SSS- Life Global® - Guilford, CT USA) por 24 a 48 horas. Durante o experimento eletrofisiológico, a placa foi perfundida com o fluxo de 1 mL/min de meio de Hank´s acrescido de Hepes com 10% de Soro Sintético (SSS- Life Global® - Guilford, CT USA) mantido a 37º C. O registro intracelular foi realizado com microeletrodos preenchidos com KCl 3 M com uma resistência de 15 a 25 MΩ e acoplados a um eletrômetro. A resistência da membrana ao fluxo de cargas foi avaliada com a aplicação de pulsos quadrados de corrente (0,5 nA, 0,5 Hz e 200 ms) através do eletrodo de registro. Os hormônios testados (FSH ovino e Folitropina Beta) foram aplicados topicamente na placa. Para a análise estatística foi utilizado o teste de Anova de duas vias (seguido do pós-teste de Bonferroni) ou o teste exato de Fischer. Resultados: Foi realizada a padronização da técnica de registro eletrofisiológico para as células do cumulus e o potencial de membrana médio em repouso obtido foi de -34,02 mV, com desvio-padrão de ± 6,46 e erro-padrão da média de ± 2,04. A resistência média das membranas ao fluxo de íons foi de 16,5 MΩ, com desvio-padrão de ± 4,03 e erro-padrão da média de ± 1,8. A aplicação do FSH Ovino (1 μM) causou uma lenta despolarização, estatisticamente significativa 180 segundos após a aplicação do hormônio (P<0,01). A aplicação da Folitropina Beta (Puregon® 1 μM) causou uma lenta despolarização, estatisticamente significativa 120 e 180 segundos após a aplicação do hormônio (P<0,001). O padrão de despolarização foi semelhante entre as duas isoformas, sendo o efeito da Folitropina Beta mais imediato que o do FSH Ovino aos 120 segundos. Conclusões: A partir da padronização da técnica de registro eletrofisiológico intracelular para as células do cumulus oophorus humanas, registrou-se o potencial médio de membrana em repouso (-34,02 mV) e a resistência média da membrana ao fluxo de íons (16,5 MΩ). O FSH Ovino (1 μM) e a Folitropina Beta (Puregon®) (1 μM) possuem uma ação despolarizante sobre o potencial de membrana das células do cumulus. Para o FSH Ovino, essa despolarização foi significativa 180 segundos após a aplicação do hormônio e para a Folitropina Beta, a despolarização foi significativa já aos 120 segundos após a aplicação. Há uma semelhança no padrão de despolarização produzida pelo FSH Ovino e pela Folitropina Beta. Um melhor entendimento das diferenças no funcionamento das isoformas do FSH pode proporcionar o desenvolvimento de melhores protocolos de tratamento para as pacientes, com menos efeitos colaterais. Esse conhecimento também pode ser utilizado para o aprimoramento das técnicas de maturação in vitro dos oócitos, que podem poupar as pacientes dos efeitos colaterais e dos altos custos da estimulação exógena com gonadotrofinas. / The cumulus oophorus cells are firmly connected to each other and to the oocyte and they take an important part on the oocyte maturation. These cells present numerous FSH receptors. The carbohydrates present in the FSH molecule may end in sialic acid residues, allowing FSH to exist in various isoforms. The more acidic isoforms present more sialic acid residues in their carbohydrate moieties. These isoforms exhibit fluctuations in the follicular phase of the menstrual cycle and possess different capabilities of ovarian stimulation, with the least acidic isoform having higher potency and lower plasmatic half-life. Objective: The aim of this study was to standardize the intracellular electrophysiology register technique to the human cumulus oophorus cells and to investigate the membrane potential action of a less acidic FSH isoform (Puregon™), comparing with the membrane action using a less purified, more acidic FSH isoform (sheep FSH). Methods: The membrane potential was registered in cumulus oophorus cells from patients assigned to the intracytoplasmatic sperm injection (ICSI) technique. The cumulus cells were cultured in plates with HTF medium for 24 to 48 hours. During the electrophysiological experiment, the plate was superfused with 1 mL/min of Hank`s medium supplemented with Hepes, maintained at 37º C. The intracellular register was performed with microcapillaries filled with 3 M KCl with resistance ranging between 15 and 25 MΩ, and coupled to an electrometer. The membrane resistance to the ion flow was assessed by the application of square current pulses (0,5 nA, 0,5 Hz and 200 ms) through the register electrode. The tested hormones (sheep FSH and Beta Follitropin Puregon™) were applied topically onto the plate. Statistical analysis was performed using the ANOVA test for repeated measures (with Bonferroni post-test) or Fischer´s exact test. Results: the standardization of the electrophysiological register technique for the cumulus cells was successfully achieved and the mean resting membrane potential obtained was -34,02 ± 2,04 mV (SEM). The mean resistance of the membrane to the ion flow was 16,5 ± 1,8 MΩ (SEM). The sheep FSH application (1 μM) led to a slow depolarization, statistically significant 180 seconds after the hormone application (P<0,01). Beta Follitropin administration (1 μM) led to a slow depolarization, statistically significant 120 and 180 seconds after the hormone application (P<0,001). The depolarization pattern was similar between both isoforms, being that Beta Follitropin`s effect was more immediate than sheep FSH`s. Conclusion: With the electrophysiological intracellular register technique standardization to the human cumulus cells, the mean resting membrane potential was registered (-34,02 mV) and the mean membrane resistance to the ion flow was obtained (16,5 MΩ). Sheep FSH (1 μM) and Beta Follitropin (Puregon™) (1 μM) prompted a depolarizing action in the membrane potential of cumulus cells. Sheep FSH depolarization was significant at 180 seconds after the hormone application and Beta Follitropin depolarization was significant at 120 seconds after its application. Both isohormones have similar depolarization patterns. A better understanding of the differences in the action of both FSH isoforms shall make it possible to develop better hormone induction protocols in fertility treatments, with less side effects for the patients. This knowledge will potencially also make it possible to improve the in vitro oocyte maturation techniques, sparing patients of the hormone treatment side effects and of the high financial costs of the exogenous gonadotrophins administration.

As células do cumulus oophorus são firmemente conectadas umas às outras e ao oócito e participam ativamente do amadurecimento oocitário. Essas células apresentam abundância de receptores para o FSH. Os carboidratos da molécula do FSH podem terminar em resíduos de ácido siálico, permitindo que ele exista em numerosas isoformas. As isoformas mais ácidas do FSH contêm mais resíduos de ácido siálico. Os níveis dessas isoformas variam na fase folicular do ciclo menstrual e possuem diferentes capacidades de estímulo ovariano, sendo as menos ácidas mais potentes e de curta meia-vida plasmática. Objetivo: padronizar a técnica de registro eletrofisiológico intracelular para as células do cumulus oophorus humanas e verificar a ação de uma isoforma menos ácida do FSH, a Folitropina Beta (Puregon®) sobre o potencial de membrana dessas células, comparando com a ação de um FSH com menor grau de pureza e mais ácido (FSH ovino). Metodologia: o potencial de membrana foi registrado utilizando células de cumulus oophorus de pacientes encaminhadas ao procedimento de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI). As células do cumulus foram cultivadas em placas de cultura com meio HTF (Life Global® - Guilford, CT USA) acrescido de 10% de Soro Sintético (SSS- Life Global® - Guilford, CT USA) por 24 a 48 horas. Durante o experimento eletrofisiológico, a placa foi perfundida com o fluxo de 1 mL/min de meio de Hank´s acrescido de Hepes com 10% de Soro Sintético (SSS- Life Global® - Guilford, CT USA) mantido a 37º C. O registro intracelular foi realizado com microeletrodos preenchidos com KCl 3 M com uma resistência de 15 a 25 MΩ e acoplados a um eletrômetro. A resistência da membrana ao fluxo de cargas foi avaliada com a aplicação de pulsos quadrados de corrente (0,5 nA, 0,5 Hz e 200 ms) através do eletrodo de registro. Os hormônios testados (FSH ovino e Folitropina Beta) foram aplicados topicamente na placa. Para a análise estatística foi utilizado o teste de Anova de duas vias (seguido do pós-teste de Bonferroni) ou o teste exato de Fischer. Resultados: Foi realizada a padronização da técnica de registro eletrofisiológico para as células do cumulus e o potencial de membrana médio em repouso obtido foi de -34,02 mV, com desvio-padrão de ± 6,46 e erro-padrão da média de ± 2,04. A resistência média das membranas ao fluxo de íons foi de 16,5 MΩ, com desvio-padrão de ± 4,03 e erro-padrão da média de ± 1,8. A aplicação do FSH Ovino (1 μM) causou uma lenta despolarização, estatisticamente significativa 180 segundos após a aplicação do hormônio (P<0,01). A aplicação da Folitropina Beta (Puregon® 1 μM) causou uma lenta despolarização, estatisticamente significativa 120 e 180 segundos após a aplicação do hormônio (P<0,001). O padrão de despolarização foi semelhante entre as duas isoformas, sendo o efeito da Folitropina Beta mais imediato que o do FSH Ovino aos 120 segundos. Conclusões: A partir da padronização da técnica de registro eletrofisiológico intracelular para as células do cumulus oophorus humanas, registrou-se o potencial médio de membrana em repouso (-34,02 mV) e a resistência média da membrana ao fluxo de íons (16,5 MΩ). O FSH Ovino (1 μM) e a Folitropina Beta (Puregon®) (1 μM) possuem uma ação despolarizante sobre o potencial de membrana das células do cumulus. Para o FSH Ovino, essa despolarização foi significativa 180 segundos após a aplicação do hormônio e para a Folitropina Beta, a despolarização foi significativa já aos 120 segundos após a aplicação. Há uma semelhança no padrão de despolarização produzida pelo FSH Ovino e pela Folitropina Beta. Um melhor entendimento das diferenças no funcionamento das isoformas do FSH pode proporcionar o desenvolvimento de melhores protocolos de tratamento para as pacientes, com menos efeitos colaterais. Esse conhecimento também pode ser utilizado para o aprimoramento das técnicas de maturação in vitro dos oócitos, que podem poupar as pacientes dos efeitos colaterais e dos altos custos da estimulação exógena com gonadotrofinas. / The cumulus oophorus cells are firmly connected to each other and to the oocyte and they take an important part on the oocyte maturation. These cells present numerous FSH receptors. The carbohydrates present in the FSH molecule may end in sialic acid residues, allowing FSH to exist in various isoforms. The more acidic isoforms present more sialic acid residues in their carbohydrate moieties. These isoforms exhibit fluctuations in the follicular phase of the menstrual cycle and possess different capabilities of ovarian stimulation, with the least acidic isoform having higher potency and lower plasmatic half-life. Objective: The aim of this study was to standardize the intracellular electrophysiology register technique to the human cumulus oophorus cells and to investigate the membrane potential action of a less acidic FSH isoform (Puregon™), comparing with the membrane action using a less purified, more acidic FSH isoform (sheep FSH). Methods: The membrane potential was registered in cumulus oophorus cells from patients assigned to the intracytoplasmatic sperm injection (ICSI) technique. The cumulus cells were cultured in plates with HTF medium for 24 to 48 hours. During the electrophysiological experiment, the plate was superfused with 1 mL/min of Hank`s medium supplemented with Hepes, maintained at 37º C. The intracellular register was performed with microcapillaries filled with 3 M KCl with resistance ranging between 15 and 25 MΩ, and coupled to an electrometer. The membrane resistance to the ion flow was assessed by the application of square current pulses (0,5 nA, 0,5 Hz and 200 ms) through the register electrode. The tested hormones (sheep FSH and Beta Follitropin Puregon™) were applied topically onto the plate. Statistical analysis was performed using the ANOVA test for repeated measures (with Bonferroni post-test) or Fischer´s exact test. Results: the standardization of the electrophysiological register technique for the cumulus cells was successfully achieved and the mean resting membrane potential obtained was -34,02 ± 2,04 mV (SEM). The mean resistance of the membrane to the ion flow was 16,5 ± 1,8 MΩ (SEM). The sheep FSH application (1 μM) led to a slow depolarization, statistically significant 180 seconds after the hormone application (P<0,01). Beta Follitropin administration (1 μM) led to a slow depolarization, statistically significant 120 and 180 seconds after the hormone application (P<0,001). The depolarization pattern was similar between both isoforms, being that Beta Follitropin`s effect was more immediate than sheep FSH`s. Conclusion: With the electrophysiological intracellular register technique standardization to the human cumulus cells, the mean resting membrane potential was registered (-34,02 mV) and the mean membrane resistance to the ion flow was obtained (16,5 MΩ). Sheep FSH (1 μM) and Beta Follitropin (Puregon™) (1 μM) prompted a depolarizing action in the membrane potential of cumulus cells. Sheep FSH depolarization was significant at 180 seconds after the hormone application and Beta Follitropin depolarization was significant at 120 seconds after its application. Both isohormones have similar depolarization patterns. A better understanding of the differences in the action of both FSH isoforms shall make it possible to develop better hormone induction protocols in fertility treatments, with less side effects for the patients. This knowledge will potencially also make it possible to improve the in vitro oocyte maturation techniques, sparing patients of the hormone treatment side effects and of the high financial costs of the exogenous gonadotrophins administration.

As células do cumulus oophorus são firmemente conectadas umas às outras e ao oócito e participam ativamente do amadurecimento oocitário. Essas células apresentam abundância de receptores para o FSH. Os carboidratos da molécula do FSH podem terminar em resíduos de ácido siálico, permitindo que ele exista em numerosas isoformas. As isoformas mais ácidas do FSH contêm mais resíduos de ácido siálico. Os níveis dessas isoformas variam na fase folicular do ciclo menstrual e possuem diferentes capacidades de estímulo ovariano, sendo as menos ácidas mais potentes e de curta meia-vida plasmática. Objetivo: padronizar a técnica de registro eletrofisiológico intracelular para as células do cumulus oophorus humanas e verificar a ação de uma isoforma menos ácida do FSH, a Folitropina Beta (Puregon®) sobre o potencial de membrana dessas células, comparando com a ação de um FSH com menor grau de pureza e mais ácido (FSH ovino). Metodologia: o potencial de membrana foi registrado utilizando células de cumulus oophorus de pacientes encaminhadas ao procedimento de injeção intracitoplasmática de espermatozóides (ICSI). As células do cumulus foram cultivadas em placas de cultura com meio HTF (Life Global® - Guilford, CT USA) acrescido de 10% de Soro Sintético (SSS- Life Global® - Guilford, CT USA) por 24 a 48 horas. Durante o experimento eletrofisiológico, a placa foi perfundida com o fluxo de 1 mL/min de meio de Hank´s acrescido de Hepes com 10% de Soro Sintético (SSS- Life Global® - Guilford, CT USA) mantido a 37º C. O registro intracelular foi realizado com microeletrodos preenchidos com KCl 3 M com uma resistência de 15 a 25 MΩ e acoplados a um eletrômetro. A resistência da membrana ao fluxo de cargas foi avaliada com a aplicação de pulsos quadrados de corrente (0,5 nA, 0,5 Hz e 200 ms) através do eletrodo de registro. Os hormônios testados (FSH ovino e Folitropina Beta) foram aplicados topicamente na placa. Para a análise estatística foi utilizado o teste de Anova de duas vias (seguido do pós-teste de Bonferroni) ou o teste exato de Fischer. Resultados: Foi realizada a padronização da técnica de registro eletrofisiológico para as células do cumulus e o potencial de membrana médio em repouso obtido foi de -34,02 mV, com desvio-padrão de ± 6,46 e erro-padrão da média de ± 2,04. A resistência média das membranas ao fluxo de íons foi de 16,5 MΩ, com desvio-padrão de ± 4,03 e erro-padrão da média de ± 1,8. A aplicação do FSH Ovino (1 μM) causou uma lenta despolarização, estatisticamente significativa 180 segundos após a aplicação do hormônio (P<0,01). A aplicação da Folitropina Beta (Puregon® 1 μM) causou uma lenta despolarização, estatisticamente significativa 120 e 180 segundos após a aplicação do hormônio (P<0,001). O padrão de despolarização foi semelhante entre as duas isoformas, sendo o efeito da Folitropina Beta mais imediato que o do FSH Ovino aos 120 segundos. Conclusões: A partir da padronização da técnica de registro eletrofisiológico intracelular para as células do cumulus oophorus humanas, registrou-se o potencial médio de membrana em repouso (-34,02 mV) e a resistência média da membrana ao fluxo de íons (16,5 MΩ). O FSH Ovino (1 μM) e a Folitropina Beta (Puregon®) (1 μM) possuem uma ação despolarizante sobre o potencial de membrana das células do cumulus. Para o FSH Ovino, essa despolarização foi significativa 180 segundos após a aplicação do hormônio e para a Folitropina Beta, a despolarização foi significativa já aos 120 segundos após a aplicação. Há uma semelhança no padrão de despolarização produzida pelo FSH Ovino e pela Folitropina Beta. Um melhor entendimento das diferenças no funcionamento das isoformas do FSH pode proporcionar o desenvolvimento de melhores protocolos de tratamento para as pacientes, com menos efeitos colaterais. Esse conhecimento também pode ser utilizado para o aprimoramento das técnicas de maturação in vitro dos oócitos, que podem poupar as pacientes dos efeitos colaterais e dos altos custos da estimulação exógena com gonadotrofinas. / The cumulus oophorus cells are firmly connected to each other and to the oocyte and they take an important part on the oocyte maturation. These cells present numerous FSH receptors. The carbohydrates present in the FSH molecule may end in sialic acid residues, allowing FSH to exist in various isoforms. The more acidic isoforms present more sialic acid residues in their carbohydrate moieties. These isoforms exhibit fluctuations in the follicular phase of the menstrual cycle and possess different capabilities of ovarian stimulation, with the least acidic isoform having higher potency and lower plasmatic half-life. Objective: The aim of this study was to standardize the intracellular electrophysiology register technique to the human cumulus oophorus cells and to investigate the membrane potential action of a less acidic FSH isoform (Puregon™), comparing with the membrane action using a less purified, more acidic FSH isoform (sheep FSH). Methods: The membrane potential was registered in cumulus oophorus cells from patients assigned to the intracytoplasmatic sperm injection (ICSI) technique. The cumulus cells were cultured in plates with HTF medium for 24 to 48 hours. During the electrophysiological experiment, the plate was superfused with 1 mL/min of Hank`s medium supplemented with Hepes, maintained at 37º C. The intracellular register was performed with microcapillaries filled with 3 M KCl with resistance ranging between 15 and 25 MΩ, and coupled to an electrometer. The membrane resistance to the ion flow was assessed by the application of square current pulses (0,5 nA, 0,5 Hz and 200 ms) through the register electrode. The tested hormones (sheep FSH and Beta Follitropin Puregon™) were applied topically onto the plate. Statistical analysis was performed using the ANOVA test for repeated measures (with Bonferroni post-test) or Fischer´s exact test. Results: the standardization of the electrophysiological register technique for the cumulus cells was successfully achieved and the mean resting membrane potential obtained was -34,02 ± 2,04 mV (SEM). The mean resistance of the membrane to the ion flow was 16,5 ± 1,8 MΩ (SEM). The sheep FSH application (1 μM) led to a slow depolarization, statistically significant 180 seconds after the hormone application (P<0,01). Beta Follitropin administration (1 μM) led to a slow depolarization, statistically significant 120 and 180 seconds after the hormone application (P<0,001). The depolarization pattern was similar between both isoforms, being that Beta Follitropin`s effect was more immediate than sheep FSH`s. Conclusion: With the electrophysiological intracellular register technique standardization to the human cumulus cells, the mean resting membrane potential was registered (-34,02 mV) and the mean membrane resistance to the ion flow was obtained (16,5 MΩ). Sheep FSH (1 μM) and Beta Follitropin (Puregon™) (1 μM) prompted a depolarizing action in the membrane potential of cumulus cells. Sheep FSH depolarization was significant at 180 seconds after the hormone application and Beta Follitropin depolarization was significant at 120 seconds after its application. Both isohormones have similar depolarization patterns. A better understanding of the differences in the action of both FSH isoforms shall make it possible to develop better hormone induction protocols in fertility treatments, with less side effects for the patients. This knowledge will potencially also make it possible to improve the in vitro oocyte maturation techniques, sparing patients of the hormone treatment side effects and of the high financial costs of the exogenous gonadotrophins administration.

Submitted by Socorro Pontes (socorrop@ufersa.edu.br) on 2017-08-21T14:18:25Z No. of bitstreams: 1 KatiaRFL_TESE.pdf: 11131110 bytes, checksum: 4a75d7853dd30ba6006c604e3f17426d (MD5) / Approved for entry into archive by Vanessa Christiane (referencia@ufersa.edu.br) on 2017-08-21T16:39:15Z (GMT) No. of bitstreams: 1 KatiaRFL_TESE.pdf: 11131110 bytes, checksum: 4a75d7853dd30ba6006c604e3f17426d (MD5) / Approved for entry into archive by Vanessa Christiane (referencia@ufersa.edu.br) on 2017-08-21T16:39:30Z (GMT) No. of bitstreams: 1 KatiaRFL_TESE.pdf: 11131110 bytes, checksum: 4a75d7853dd30ba6006c604e3f17426d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-08-21T16:39:49Z (GMT). No. of bitstreams: 1 KatiaRFL_TESE.pdf: 11131110 bytes, checksum: 4a75d7853dd30ba6006c604e3f17426d (MD5) Previous issue date: 2017-06-30 / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The donkeys (Equus asinus) are individuals historically relevant for the occupation of inhospitable areas around the world, but they have been losing importance due to the modernization of urban centers and the creation of traction and cultivation technologies. Due to this fact, many donkey breeds are already extinct or passing through a rapid process of population decrease. Among these breeds, the Northeast donkey, an endemic breed in Brazil, is highlighted. One of the strategies for conservation is the use of biotechnologies that facilitate reproduction, such as the manipulation of oocytes enclosed in preantral follicles (MOEPF) that maximize the availability of oocytes for in vitro fertilization. The starting point for the use of this and other techniques are known reproductive physiology details of this breed as the characteristics of their gametes. The objective of this study was to estimate and to characterize the population of ovarian PFs derived from Northeast breed donkeys. Twenty females aging 5.1 ± 3.2 years and weighing 105.2 ± 18.6 kg were used. Animals were subjected to an ovariectomy procedure guided by laparoscopy for ovary collection. As the equines, donkey ovaries presented a kidney form and their parenchymal zone were extracted, taking the ovulation fossa as basis. Fragments of ovary were fixed in Carnoy, dehydrated in increasing Ethanol concentrations (70 to 99%), clarified using xylene and finally included in histological paraffin wax blocks. These blocks were serially sectioned on 7 μm slices at using a microtome. Every 120th slice was mounted on glass slides, stained with hematoxylin–eosin and read in inverted optical microscope. PFs presenting visible oocyte nuclei were measured at using an ocular micrometer and classified as primordial, primary or secondary. PFs were also classified and counted as morphologically normal, when containing an oocyte with regular shape and uniform cytoplasm, and organized layers of granulosa cells; or as degenerated, when the oocyte exhibited pycnotic nucleus and/or ooplasm shrinkage, and occasionally, granulosa cell layers became disorganized, detached from the basement membrane and/or included enlarged cells. The PF population was estimated by using the formula: (number of follicles × number of sections × thickness of sections)/(number of sections observed × range of oocyte nuclei diameter). The results allowed us to estimate a total population of 21,135.3 ± 10,646.1 PFs per animal. From this population, 91.3% PFs were classified as primordial, 8.2% PFs as primary, and 0.3% as secondary. multioocyte PFs were observed in all animals, and they were more frequently present in primordial follicles, representing 0.99% of total PFs counted. The estimated population was distributed between the right and left ovaries, at 54.6% and 45.4%, respectively. Most PFs were considered morphologically normal (90.2%) and the smallest, degenerate (9.8%). An inversely proportional relationship between age and follicular population was identified, similarly to the relation between weight and follicular population. In the second experiment, the ovarian tissue of animals from the same group was subjected to a vitrification procedure using dimethylsulfoxide (DMSO) and ethylene glycol (EG) as cryoprotectants in separate and associated. When comparing treatments, the use of DMSO 3M (81.7 ± 37.5%), EG 3M (83.7 ± 27.4%) and the combination of both DMSO 3M + EG 3M (81.8 ± 46.8%) allowed a greater percentage of follicular survival. When vitrified using the DMSO + EG combination, a higher percentage (62.5 ± 29.1%) of viable follicles was observed in relation to the other vitrification treatments (P <0.05). The TUNEL technique identified that all treatments tested showed DNA fragmentation in the follicular cells, except in the case of the DMSO 3M plus EG 3M treatment. When evaluating the presence of NORs, no significant differences were observed in the amount of NORs between the fresh and vitrified groups using DMSO 3M plus EG 3M (P >0.05). Thus, we concluded that the combination DMSO 3M plus EG was more efficient for the vitrification of ovarian tissue taken from Equus asinus, allowing adequate preservation of PAFS morphology, viability, DNA integrity and cell proliferative capacity. This work presented for the first time the estimate of ovarian preantral follicles in donkeys of the Northeastern breed and successful vitrification / Os jumentos (Equus asinus) são animais historicamente relevantes para a ocupação de áreas inóspitas em todo o mundo, mas tem perdido espaço devido à modernização dos centros urbanos e a mecanização agrícola e transporte motorizado. Assim, muitas raças de jumentos já foram extintas ou encontram-se em rápido processo de queda populacional, e dentre elas está a raça Nordestina, endêmica do Brasil. Uma das estratégias de conservação é o uso de biotecnologias que favoreçam a reprodução assistida, como a manipulação de oócitos inclusos em folículos pré-antrais (MOIFOPA) que maximiza a disponibilidade de oócitos para outras biotécnicas. O ponto de partida para o uso desta e outras biotécnicas é conhecer detalhes da fisiologia reprodutiva e dos gametas da espécie ou raça que se deseja manipular. O objetivo desta tese é caracterizar e conservar por meio da vitrificação a população de folículos ovarinos pré-antrais (FP) em fêmeas asininas da raça Nordestina. No primeiro experimento, dez fêmeas com idade média de 5,1 ± 3,2 anos e peso médio de 105,2 ± 18,6 kg, constituíram o grupo de estudo. As mesmas foram submetidas a procedimento de ovariectomia guiada por laparoscopia para coleta dos ovários. Assim como nos demais equídeos, os ovários das jumentas apresentam formato reniforme e suas zonas parenquimatosa, incluindo a fossa ovariana, foram extraídas. Fragmentos do ovário foram fixados com carnoy, desidratados com etanol em concentrações crescentes (70 a 99%), clarificados usando xilol e finalmente inclusos em blocos de parafina histológica. Estes blocos foram sequencialmente seccionados em micrótomo em frações de 7μm. Uma a cada 120 frações foi montada em lâminas de vidro e corada com hematoxilina-eosina e lida em microscópio ótico. Os FPs que apresentaram núcleo visível foram fotografados, mensurados com uso de software e classificados como primordiais, primários e secundários. Os FPs classificados e contados foram identificados como normais ou degenerados. A população de FPs foi estimada usando a fórmula: (número de PF observados × número total de secções × espessura das secções) dividido pelo (número de secções observadas × diâmetro médio do núcleo dos oócitos). A população média estimada foi de 21.135,3 ± 10.646,1 FPs por animal. Destes, 91,3% foram identificados como primordiais, 8,2% como folículos primários e 0,4% como secundários. Folículos com múltiplos oócitos foram observados em todos os animais, todos classificados como primordiais, representando 0,99% do total de folículos. A população de PF estimada estava distribuída entre os ovários direito e esquerdo, em 54,6% e 45,4% respectivamente. A maior parte dos PFs foi considerada morfologicamente normal (90,2%) e a menor parcela, degenerados (9,8%). Foi identificada uma relação inversamente proporcional entre a idade e a população folicular, semelhante à relação entre peso e população folicular. No segundo experimento, o tecido ovariano de jumentas foram submetidos a procedimento de vitrificação em superfície sólida usando dimetil sulfóxido (DMSO) e etileno glicol (EG), isoladamente em diferentes concentrações (3M e 6M) e associados, como agentes crioprotetores. Quando comparados aos tratamentos o uso do DMSO 3M (81,7 ± 37,5%), EG 3M (83,7 ± 27,4%) e a combinação de DMSO 3M + EG 3M (81,8 ± 46,8%) apresentaram um grande percentual de folículos morfologicamente normais. O uso do DMSO 3M + EG 3M, apresentou o maior percentual (62,5 ± 29,1%) de folículos viáveis em relação aos demais tratamentos (P <0,05). Pela técnica TUNEL, todos os tratamentos apresentaram fragmentação de DNA nas células foliculares, exceto no caso do DMSO 3M + EG 3M. Quando avaliada a presença de NORs, não foi verificada diferenças significativas entre o número de NORs no grupo controle e no tratamento DMSO 3M + EG 3M (P < 0,05). A combinação DMSO 3M e EG 3M mostrou-se mais eficiente para a vitrificação de tecido ovariano de jumentas, apresentando-se de forma adequada para a preservação da morfologia e viabilidade de folículos pré antrais, bem como a integridade do DNA e a capacidade de proliferação celular. Este trabalho apresentou de forma inédita a estimativa de folículos pré-antrais ovarianos em jumentas da raça nordestina bem como uma estratégia de criopreservação com resultados positivos / 2017-08-21

Introdução: O gene p63 é o mais ancentral membro dos integrantes da família p53 e é descrito como o responsável pela manutenção da integridade gênica e regulação do ciclo celular em células germinativas imaturas. Porém, ainda não há relatos na literatura que avaliem sua expressão em células da granulosa luteinizadas. A endometriose é uma doença crônica que está associada à infertilidade. Vários mecanismos foram propostos para explicar esta associação, mas, até o momento, nenhum deles é considerado definitivo. Objetivos: O objetivo desse estudo é avaliar a expressão do gene e da proteína p63 em células da granulosa luteinizadas de pacientes inférteis submetidas à fertilização in vitro (IVF). Além disso, verificar se pacientes com endometriose apresentam função anormal da p63. Métodos: Realizamos um estudo transversal e prospectivo. Nós coletamos células da granulosa de 28 pacientes submetidas a IVF para avaliar a expressão de p63. Depois, para estudar o efeito na endometriose dividimos em dois grupos: (1) grupo estudo (n=9): pacientes com diagnóstico videolaparoscópico de endometriose e (2) grupo controle (n=19): pacientes inférteis por outros motivos, sem endometriose. As células coletadas foram preparadas e analisadas para expressão gênica (PCR em tempo real) e expressão proteica (imunofluorescência). Os resultados foram comparados entre os grupos. Resultados: Não observamos diferença significativa de expressão do gene p63 entre os grupos estudados. A mediana do 2-ΔΔCT no grupo controle foi 0,93 (IC 95%, 0,55- 2,83) e 0,88 no grupo em estudo (IC 95%, 0,24-2,84). O resultado também mostrou que o gene p63 não é expresso nos dois grupos. Quanto à expressão da proteína p63, a imunofluorescência não demonstrou expressão em nenhum dos dois grupos. Conclusão: O gene e a proteína p63 podem ser muito importantes na manutenção da integridade gênica de folículos imaturos de reserva, não dependentes de FSH. Porém, após o recrutamento e crescimento folicular, não se observa mais sua expressão, ou seja, ele não faz parte da maturação e desenvolvimento oocitário. / Introduction: The p63 gene is the most ancient member of the components of p53 family and is described as the responsible for maintaining of genic integrity and cell cycle regulation in immature germ cells. However, there are no reports in the literature evaluating its expression in granulosa cells luteinized. Endometriosis is a chronic disease that is associated with infertility. Several mechanisms have been proposed to explain this association, but so far, none of them is considered definitive. Objectives: The purpose of this study is to evaluate the expression of the p63 gene and protein in granulosa luteinized cells of infertile patients undergoing in vitro fertilization (IVF). Also, we checked whether patients with endometriosis have abnormal function of p63. Methods: We performed a prospective cross-sectional study. We collected granulosa cells of 28 patients undergoing IVF to evaluate p63 expression. Then, to study the effect on endometriosis, they were divided into two groups: (1) study group (n = 9): patients with laparoscopic diagnosis of endometriosis and (2) control group (n = 19): infertile patients for other reasons, without endometriosis . The collected cells were prepared and analyzed for gene expression (real time PCR) and protein expression (immunofluorescence). The results were compared between the groups. Results: There was no significant difference in expression of the p63 gene between the groups. The median of 2-ΔΔCT in the the control group was 0.93 (95% CI, 0.55 to 2.83) and 0.88 in the study group (95% CI, 0.24 to 2.84). The results also showed that the p63 gene is not expressed in granulosa cells in both groups. About to the p63 protein expression, immunofluorescence showed no expression in either group. Conclusion: The p63 gene and protein can be very important in maintaining the genic integrity of immature reserve follicles, not dependent of FSH. However, after the recruitment and follicular growth is not more observed its expression, suggesting that p63 is not part of control of oocyte maturation and development.

Orientadora: Prof. Dra. Marcella Pecora Milazzotto. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2016. / A maturação de oócitos in vitro é amplamente utilizada para produção de embriões e tenta mimetizar as condições fisiológicas foliculares, permitindo a capacitação oocitária. No entanto, as condições foliculares a que os oócitos estão submetidos previamente a aspiração podem ser responsáveis por diferenças que serão refletidas no fenótipo embrionário. O objetivo deste trabalho foi quantificar marcadores metabólicos no fluido folicular (FF) e transcritos das células da granulosa (CG) de bovinos envolvidos na capacitação do oócito e sua relação com a competência embrionária (avaliada pela cinética e desenvolvimento a blastocisto). Para isso, foram aspirados individualmente complexo cumulus-oocito (COCs) e respectivos FFs e CG de folículos de 7-8mm de ovários de abatedouro comercial. As moléculas de glicose, colesterol, estradiol e piruvato foram quantificadas nos FFs por fluorimetria e os transcritos de receptor de FSH (FSH-R), receptor de angiotensina II (AngIIAT2), receptor de EGF (EGF-R) e aromatase (CYP19A) foram quantificados nas CG por RT-PCR. Os COCs foram fecundados e cultivados individualmente in vitro e os índices de clivagem e cinética embrionária foram avaliados as 40hpi e índices de blastocistos as 186hpi. Posteriormente os dados de desenvolvimento embrionário foram analisados em função dos dados dos respectivos FF e CG. Foram realizadas as seguintes comparações: não clivados x clivados (NCL x CL), clivados rápidos (> 4 células as 40hpi) x clivados lentos (< 4 células as 40hpi) (CLR x CLL), desenvolvimento a blastocisto x bloqueado (BL x NBL), clivados que se desenvolveram a blastocisto x clivados bloqueados (CLBL x CLNBL) e blastocistos derivados do grupo rápido x derivados do grupo lento (BLR x BLL). Os dados foram analisados pelo programa SAS System for Windows pelo teste t de Student, e o nível de significância de 5%. Não houve diferença entre os índices de CLR e CLL (19,2±3,8% e 25,1±3,8%, respectivamente). Da mesma forma, nenhum dos metabólitos e transcritos analisados foram distintos entre CLR x CLL, tampouco NCL x CL, a exceção do FSHR, que foi menos expresso CL, BL e CLBL quando comparados a NCL, NBL e CLNBL. O índice de BL foi (27,3±3,9%) e maior índice de blastocisto foi para BLR do que BLL (18,5±2,7% e 8,8±2,5%, respectivamente). BL e CLBL apresentaram maior quantidade de piruvato e colesterol, aumento de CYP19 e, no caso de CLBL, ainda maiores níveis de ANGII e EGF-R 2 quando comparados a NBL e CLNBL. Em relação a cinética de desenvolvimento, CLR e BLR apresentaram aumento de ANGII e estradiol. Além disso, BLR ainda apresentaram diminuição de CYP19 e EGF-R, sugerindo uma alta atividade esteroidogênica mais relacionada à secreção do que com a síntese de esteroides, provavelmente por um efeito negativo do estradiol no controle da expressão destes genes. Os dados deste estudo permitem concluir que o status folicular tem relação direta com a habilidade do oócito a se desenvolver a blastocisto. Além disso, o aumento da disponibilidade de substrato energético e da capacidade esteroidogênica parece influenciar positivamente a capacitação oocitária. Da mesma forma, embriões de cinética distinta parecem ser derivados de folículos com atividade esteroidogênica distinta. / Follicular conditions established prior to aspiration for in vitro maturation may be responsible for differences that will reflect in the embryonic phenotype. In this work, cumulus-oocyte complex (COCs) and their respective follicular fluid (FF) were individually aspirated from slaughterhouse ovaries. Metabolic biomarkers as glucose, pyruvate, cholesterol and estradiol were quantified in FF by fluorimetry. Specific granulosa cells (GC) transcripts related to oocyte capacitation and steroidogenic capacity such as aromatase (CYP19A), FSH (FSH-r), angiotensin II (ANGII AT2) and EGF (EGF-r) receptors were quantified by RT-PCR. Bovine embryos were produced in vitro following conventional protocols. Embryos were cultured individually and divided into: Fast (> 4 cells at 40 hpi) and Slow (< 4 cells at 40hpi). Blastocyst rates and embryonic competence (evaluated through developmental kinetics and blastocysts rates) were assessed at 186hpi. Embryonic development data was analyzed in function of FF and GC results by comparing: non-cleaved vs. cleaved (NCL x CL), fast vs. slow (CLF x CLS), development to blastocyst x blocked (BL x NBL), cleaved that reached blastocyst stage vs. cleaved that blocked (CLBL x CLNBL) and blastocysts originated from fast vs. slow (BLF x BLS). Embryonic development, quantification of metabolites and transcripts were compared by Student t test using SAS for Windows considering á=5%. Cleavage rates were not different between fast and slow embryos (19.2±3.8% and 25.1±3.8%, respectively). Except for FSH-r, that was less expressed in CL, BL and CLBL than their respective counterparts NCL, NBL and CLNBL, all the other metabolites and transcripts did not present any differences. Total blastocyst rate was 27.3±3.9%, being 18.5±2.7% from BLF and 8.8±2.5% from BLL groups. BL and CLBL presented higher amounts of pyruvate and cholesterol, and an increased expression of CYP19 when compared to NBL and CLNBL, respectively. Also, CLBL presented higher levels of ANGII AT2 and EGF-r than CLNBL, suggesting that BL and CLBL derived follicles have a greater steroidogenic capacity. Regarding developmental kinetics, CLR and BLR presented an increase in ANGII AT2 and estradiol and diminished levels of CYP19 and EGF-R, suggesting an elevated secretion of steroids. Therefore, BLL, with increased expression of CYP19 and EGF-r under lower levels of estradiol and ANGII AT2 are preferably directed to the synthesis than secretion of this hormone. In summary, our results show that follicular status is direct ly related to the oocytes 4 ability to develop to blastocyst. In addition, the increased availability of energy substrates and steroidogenic capacity appears to positively influence the oocyte capacitation. Likewise, embryos with distinct developmental kinetics seem to originate from follicles with distinct steroidogenic activity.

Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / The growth factor receptor-bound protein 10 (Grb10) has been extensively studied in human and has been implicated in the regulation of MAPK and PI3K pathways, activated by Insulin-like Growth Factor Receptor (IGF-IR). In cattle, it is well established that the IGF system is required for follicular dominance. On the other hand, Grb10 protein has not been studied in follicular development, dominance or deviation of any species. Then, we conducted experiments to characterize the Grb10 in ovarian follicular cells and to evaluate the regulation of Grb10 mRNA expression during follicular deviation. Cow ovaries were obtained from an abattoir, transported to the laboratory on ice and processed immediately. Granulosa and theca cells collected from follicles of 3-5 mm, 6-8 mm and > 8 mm of diameter expressed Grb10 mRNA and protein. Western blot assay from granulosa cells lysates showed a single band while three bands were observed in theca cells. The confocal study demonstrated presence of Grb10 in the cytoplasm of theca and granulosa cells. After characterize the Grb10 message and protein in follicular cells, we studied the regulation of Grb10 in follicular cells during deviation in vivo. Higher Grb10 mRNA expression was observed in subordinate follicles when compared to the dominant follicle (P < 0.05) as well as a negative correlation between Grb10 and aromatase throughout the follicular deviation (P < 0.05). To our knowledge, this is the first report of Grb10 expression in granulosa and theca cells during follicular development. Moreover, the results present strong evidence that Grb10 mRNA expression is regulated during follicle deviation and, therefore, is potentially involved in the selection of dominant follicle in cattle. / A proteína de ligação Grb10 é extensivamente estudada em humanos onde atua regulando a rotas intracelulares do MAPK e do PI3K, ativadas pelos receptors do IGF-I. Em bovinos, está bem estabelecido que o sistema IGF é indispensável para a divergência folicular e seleção do folículo dominante. Porém, a proteína Grb10 ainda não foi estudada no desenvolvimento folicular, dominância ou divergência de nenhuma espécie. Por isso, experimentos foram conduzidos para caracterizar o Grb10 em células foliculares e para avaliar a regulação da expressão do RNAm para o Grb10 durante a divergência folicular. Ovários bovinos foram obtidos a partir de abatedouro, transportado até o laboratório em gelo e imediatamente processados. Células da granulosa e da teca coletadas de folículos de 3-5 mm, 6-8 mm e >8 mm de diâmetro expressaram RNAm e proteína para o Grb10. Utilizando a técnica de Western blot, nas células da granulosa foi obtida uma banda, enquanto que nas células da teca foram verificadas três bandas. Imagens em microscópio confocal demonstraram a presença da proteína Grb10 no citoplasma das células da granulosa e da teca. Após a caracterização da mensagem e da proteína para o Grb10 nas células foliculares, nós estudamos a regulacão do Grb10 nas células foliculares durante a divergência folicular in vivo. Foi observada uma maior expressão de RNAm para o Grb10 em folículos subordinados em relação os folículos dominantes (P < 0.05) e também uma correlação negativa entre a expressão de Grb10 e aromatase durante a divergência folicular (P < 0.05). Em nosso conhecimento, este é o primeiro trabalho a demonstrar a expressão de Grb10 em células da granulosa e da teca durante o desenvolvimento folicular. Além disso, os resultados indicam fortes evidências de que a expressão de RNAm para o Grb10 é regulado durante a divergência folicular e, portanto, está potencialmente envolvido na seleção do folículo dominante em bovinos.

Introdução: O gene p63 é o mais ancentral membro dos integrantes da família p53 e é descrito como o responsável pela manutenção da integridade gênica e regulação do ciclo celular em células germinativas imaturas. Porém, ainda não há relatos na literatura que avaliem sua expressão em células da granulosa luteinizadas. A endometriose é uma doença crônica que está associada à infertilidade. Vários mecanismos foram propostos para explicar esta associação, mas, até o momento, nenhum deles é considerado definitivo. Objetivos: O objetivo desse estudo é avaliar a expressão do gene e da proteína p63 em células da granulosa luteinizadas de pacientes inférteis submetidas à fertilização in vitro (IVF). Além disso, verificar se pacientes com endometriose apresentam função anormal da p63. Métodos: Realizamos um estudo transversal e prospectivo. Nós coletamos células da granulosa de 28 pacientes submetidas a IVF para avaliar a expressão de p63. Depois, para estudar o efeito na endometriose dividimos em dois grupos: (1) grupo estudo (n=9): pacientes com diagnóstico videolaparoscópico de endometriose e (2) grupo controle (n=19): pacientes inférteis por outros motivos, sem endometriose. As células coletadas foram preparadas e analisadas para expressão gênica (PCR em tempo real) e expressão proteica (imunofluorescência). Os resultados foram comparados entre os grupos. Resultados: Não observamos diferença significativa de expressão do gene p63 entre os grupos estudados. A mediana do 2-ΔΔCT no grupo controle foi 0,93 (IC 95%, 0,55- 2,83) e 0,88 no grupo em estudo (IC 95%, 0,24-2,84). O resultado também mostrou que o gene p63 não é expresso nos dois grupos. Quanto à expressão da proteína p63, a imunofluorescência não demonstrou expressão em nenhum dos dois grupos. Conclusão: O gene e a proteína p63 podem ser muito importantes na manutenção da integridade gênica de folículos imaturos de reserva, não dependentes de FSH. Porém, após o recrutamento e crescimento folicular, não se observa mais sua expressão, ou seja, ele não faz parte da maturação e desenvolvimento oocitário. / Introduction: The p63 gene is the most ancient member of the components of p53 family and is described as the responsible for maintaining of genic integrity and cell cycle regulation in immature germ cells. However, there are no reports in the literature evaluating its expression in granulosa cells luteinized. Endometriosis is a chronic disease that is associated with infertility. Several mechanisms have been proposed to explain this association, but so far, none of them is considered definitive. Objectives: The purpose of this study is to evaluate the expression of the p63 gene and protein in granulosa luteinized cells of infertile patients undergoing in vitro fertilization (IVF). Also, we checked whether patients with endometriosis have abnormal function of p63. Methods: We performed a prospective cross-sectional study. We collected granulosa cells of 28 patients undergoing IVF to evaluate p63 expression. Then, to study the effect on endometriosis, they were divided into two groups: (1) study group (n = 9): patients with laparoscopic diagnosis of endometriosis and (2) control group (n = 19): infertile patients for other reasons, without endometriosis . The collected cells were prepared and analyzed for gene expression (real time PCR) and protein expression (immunofluorescence). The results were compared between the groups. Results: There was no significant difference in expression of the p63 gene between the groups. The median of 2-ΔΔCT in the the control group was 0.93 (95% CI, 0.55 to 2.83) and 0.88 in the study group (95% CI, 0.24 to 2.84). The results also showed that the p63 gene is not expressed in granulosa cells in both groups. About to the p63 protein expression, immunofluorescence showed no expression in either group. Conclusion: The p63 gene and protein can be very important in maintaining the genic integrity of immature reserve follicles, not dependent of FSH. However, after the recruitment and follicular growth is not more observed its expression, suggesting that p63 is not part of control of oocyte maturation and development.

Introdução: O gene p63 é o mais ancentral membro dos integrantes da família p53 e é descrito como o responsável pela manutenção da integridade gênica e regulação do ciclo celular em células germinativas imaturas. Porém, ainda não há relatos na literatura que avaliem sua expressão em células da granulosa luteinizadas. A endometriose é uma doença crônica que está associada à infertilidade. Vários mecanismos foram propostos para explicar esta associação, mas, até o momento, nenhum deles é considerado definitivo. Objetivos: O objetivo desse estudo é avaliar a expressão do gene e da proteína p63 em células da granulosa luteinizadas de pacientes inférteis submetidas à fertilização in vitro (IVF). Além disso, verificar se pacientes com endometriose apresentam função anormal da p63. Métodos: Realizamos um estudo transversal e prospectivo. Nós coletamos células da granulosa de 28 pacientes submetidas a IVF para avaliar a expressão de p63. Depois, para estudar o efeito na endometriose dividimos em dois grupos: (1) grupo estudo (n=9): pacientes com diagnóstico videolaparoscópico de endometriose e (2) grupo controle (n=19): pacientes inférteis por outros motivos, sem endometriose. As células coletadas foram preparadas e analisadas para expressão gênica (PCR em tempo real) e expressão proteica (imunofluorescência). Os resultados foram comparados entre os grupos. Resultados: Não observamos diferença significativa de expressão do gene p63 entre os grupos estudados. A mediana do 2-ΔΔCT no grupo controle foi 0,93 (IC 95%, 0,55- 2,83) e 0,88 no grupo em estudo (IC 95%, 0,24-2,84). O resultado também mostrou que o gene p63 não é expresso nos dois grupos. Quanto à expressão da proteína p63, a imunofluorescência não demonstrou expressão em nenhum dos dois grupos. Conclusão: O gene e a proteína p63 podem ser muito importantes na manutenção da integridade gênica de folículos imaturos de reserva, não dependentes de FSH. Porém, após o recrutamento e crescimento folicular, não se observa mais sua expressão, ou seja, ele não faz parte da maturação e desenvolvimento oocitário. / Introduction: The p63 gene is the most ancient member of the components of p53 family and is described as the responsible for maintaining of genic integrity and cell cycle regulation in immature germ cells. However, there are no reports in the literature evaluating its expression in granulosa cells luteinized. Endometriosis is a chronic disease that is associated with infertility. Several mechanisms have been proposed to explain this association, but so far, none of them is considered definitive. Objectives: The purpose of this study is to evaluate the expression of the p63 gene and protein in granulosa luteinized cells of infertile patients undergoing in vitro fertilization (IVF). Also, we checked whether patients with endometriosis have abnormal function of p63. Methods: We performed a prospective cross-sectional study. We collected granulosa cells of 28 patients undergoing IVF to evaluate p63 expression. Then, to study the effect on endometriosis, they were divided into two groups: (1) study group (n = 9): patients with laparoscopic diagnosis of endometriosis and (2) control group (n = 19): infertile patients for other reasons, without endometriosis . The collected cells were prepared and analyzed for gene expression (real time PCR) and protein expression (immunofluorescence). The results were compared between the groups. Results: There was no significant difference in expression of the p63 gene between the groups. The median of 2-ΔΔCT in the the control group was 0.93 (95% CI, 0.55 to 2.83) and 0.88 in the study group (95% CI, 0.24 to 2.84). The results also showed that the p63 gene is not expressed in granulosa cells in both groups. About to the p63 protein expression, immunofluorescence showed no expression in either group. Conclusion: The p63 gene and protein can be very important in maintaining the genic integrity of immature reserve follicles, not dependent of FSH. However, after the recruitment and follicular growth is not more observed its expression, suggesting that p63 is not part of control of oocyte maturation and development.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-02-15T16:26:17Z No. of bitstreams: 1 joaogabrielvianadegrazia.pdf: 1482516 bytes, checksum: cb92ddb43d93af9c01680b364e327797 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-02-26T12:26:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 joaogabrielvianadegrazia.pdf: 1482516 bytes, checksum: cb92ddb43d93af9c01680b364e327797 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-26T12:26:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 joaogabrielvianadegrazia.pdf: 1482516 bytes, checksum: cb92ddb43d93af9c01680b364e327797 (MD5) Previous issue date: 2014-02-26 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Na última década a produção in vitro de embriões tornou-se uma técnica de grande importância na reprodução de bovinos. No gado de leite, ela tem sido bastante utilizada com destaque para as raças Gir e Holandesa. Dentre outras características, essas duas raças apresentam diferenças relacionadas à fisiologia reprodutiva, com reflexo no potencial de produção de embriões no sistema in vitro. Sabendo da importância de ambas as raças para o rebanho brasileiro, é primordial entender as bases fisiológicas destas diferenças e buscar ferramentas para avaliação da qualidade e viabilidade de oócitos e embriões. O objetivo desse trabalho foi caracterizar o fenótipo “doadora” com base na produção de embriões e avaliar alguns genes como possíveis marcadores de produção nestas raças. Para isso, inicialmente foram analisados dados de um laboratório comercial de produção in vitro de embriões. Posteriormente, foi realizada a caracterização molecular e avaliação da expressão relativa de genes candidatos, utilizando-se a técnica de PCR em Tempo-Real, em amostras de células da granulosa cultivadas provenientes de animais com diferentes perfis de produção de embriões. Uma maior produção de complexos cumulus-oócito (COC) total e viáveis foi observado em doadoras da raça Gir. Da mesma forma, animais da raça Gir apresentavam maior taxa de conversão e maior produção total de embriões, independente da raça do touro utilizado para fertilização. Entretanto, nas duas raças não houve diferença na produção de COC entre animais com diferentes taxas de conversão COC/embrião. Não houve diferença nas expressão dos genes (BAX, INHA, IGFIR, LHR, STAR) entre animais com alta ou baixa produção de embriões, assim como entre raças. No entanto, o gene PRDX1 estava sobre-expresso em doadoras da raça Holandesa caracterizadas como de alta produção de embriões. Esses resultados confirmam a maior produção de COC em animais da raça Gir, quando comparados aos animais da raça Holandesa, assim como, a maior produção total de embriões no sistema in vitro, mas sugerem que nas duas raças a eficiência na produção de embriões não é determinada pela produção total de COC. A avaliação da expressão gênica de células da granulosa obtidas de cultivos para a produção in vitro de embriões não possibilitou a caracterização de marcadores com potencial para predição da produção de embriões das doadoras. / In the last years the in vitro production of embryos became a technique of great importance in the reproduction of cattle. In the dairy cattle, it has been widely used with spotlight for the Gyr and Holstein breeds. Among other features, this two breeds exhibit differences related to reproductive physiology and reflects on the potential of production of embryos in the system in vitro. Knowing the importance of both breed for the Brazilian herd, it is critical to understand the physiological basis of these differences and search tools to evaluate the quality and viability of oocytes and embryos. The aim of this study was to characterize the phenotype "donor" based on embryo production and evaluate some genes as potential markers for production in these breeds. To do this initially, data from in vitro production of embryos from a commercial laboratory were analyzed. Subsequently, the molecular characterization and evaluation of the relative expression of candidate genes was performed in samples of granulosa cells from culture of animals with different profiles of production embryos using the Real-time PCR. A higher production of total and viable oocyte-cumulus complexes (COC) was observed in donor Gyr. Likewise, animals Gyr had a higher conversion rate and higher total production of embryos, independent of breed of sire used for fertilization. However, in the two breeds there was no difference in the production of COC between animals with different conversion rates COC / embryo. There was no differences in the expression of genes (BAX, INHA, IGFIR, LHR, STAR) between animals with high or low production of embryos, as well as between breeds. However, the PRDX1 gene was overexpressed in donor Holstein characterized as high production of embryos. These datas confirm the higher production of COC in Gyr breed animals when compared to Holstein cows, as well as the highest total production of embryos in vitro system, but suggest that the two breeds efficiency in the production of embryos is not determined by the total production of COC. The assessment of gene expression of granulosa cells obtained from cultures for in vitro production of embryos did not allow the characterization of potential markers for predicting embryo production of donors.