Made available in DSpace on 2016-08-29T15:37:23Z (GMT). No. of bitstreams: 1 tese_5660_DISSERTAÇÃO - MARCUS DÓREA.pdf: 959070 bytes, checksum: b826fbc0dc1185e5661f7622a98c7491 (MD5) Previous issue date: 2012-03-30 / Objetivou-se com este estudo avaliar a taxa de folículos residuais pós-aspiração de folículos ovarianos de 8 e 12 mm de diâmetro, por meio da avaliação dos fatores endócrinos, analisando a interferência destas estruturas no desenvolvimento normal da dinâmica de crescimento. Foram selecionadas vacas da raça Holandesa (N=13) não lactantes e com dois ciclos estrais normais consecutivos; estas foram tratadas com 500mg de cloprostenol sódico (Sincrocio®) e 3 mg de norgestomet (Crestar®) (D0), 2 mg de benzoato de estradiol (Sincrodiol®) (D1), após a emergência da onda folicular foram distribuídas aleatoriamente em dois tratamentos caracterizados pela ausência ou presença de implantes de norgestomet, cada tratamento dividido em dois grupos: presença do implante e folículo de 8 mm (G1), ausência do implante e folículo de 8 mm (G2), presença do implante e folículo de 12 mm (G3) e ausência do implante e folículo de 12 mm (G4). O monitoramento ultrassonográfico (Esaote Pie Medical®) foi realizado duas vezes ao dia com intervalo de 12 horas. Os folículos ovarianos foram aspirados com 8 e 12mm e avaliados quanto à presença do resíduo ao processo de aspiração, quando residual, eram aspirados novamente. Os dados de dinâmica de crescimento folicular, perfil hormonal do plasma sanguíneo e do fluído folicular foram verificados quanto à distribuição normal, pelo teste de Shapiro-Wilk e comparadas nos diferentes tratamentos pelo teste t de student. Os dados de perfil de esteroidogênico dos folículos aspirados em diferentes diâmetros foram analisados pelo SAS GLM procedure para o principal efeito de tratamento e as comparações foram feitas pelo teste F. O nível de significância adotado foi de 5%. O tratamento com progestágeno não afetou o crescimento folicular. A taxa de folículo residual foi de 74.6%. O tratamento com progestágeno não afetou (P>0.05) o percentual de folículos residuais, independente do diâmetro do folículo, no entanto, o efeito do diâmetro folicular aproximou a significância estatística (P=0.07). Os folículos residuais cresceram cerca de 5 mm ao dia. Dos folículos residuais aproximadamente 65% se tornaram folículos ativos, 12% folículos luteinizados e 23% folículos inativos. Conclui-se que a presença de folículos residuais ocorre na maioria dos folículos aspirados com maior frequência em 12 mm e grande parte ativos e com elevada concentração de estradiol.

Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Resumo: As tecnologias de reprodução assistida ou ARTs (“Assisted Reproductive Technology”) são amplamente utilizadas na reprodução humana e animal. Para estes procedimentos, gametas e embriões são expostos a um ambiente artificial que mimetiza o trato reprodutivo. Um dos fatores mais discrepantes neste contexto é a atmosfera gasosa, visto que in vivo a concentração de O2 encontrada no trato reprodutivo é menor do que a utilizada no ambiente in vitro, sendo comumente utilizada a concentração de 20% de oxigênio neste sistema artificial. Altas concentrações deste gás provocam estresse oxidativo e aumento das concentrações de espécies reativas de oxigênio (EROs) e, consequente maior proporção de células apoptóticas em oócitos e embriões. Entretanto, pouco se sabe sobre as consequências da mudança de atmosfera gasosa durante as fases iniciais da produção in vitro de embriões e as possíveis consequências no remodelamento epigenético. Para validar a hipótese de que diferentes concentrações de oxigênio durante a maturação e a fecundação in vitro modulam a transcrição de genes envolvidos no estresse oxidativo e modeladores epigenéticos em oócitos, células do cumulus e embriões bovinos. Além disso, o estresse oxidativo gerado nos embriões exerce efeito sobre os níveis globais de metilação do DNA e marcas de histonas, cinco experimentos foram realizados com objetivo de investigar o papel da atmosfera gasosa nos passos iniciais da produção in vitro de embriões bovinos. Para diferenciar os efeit... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Mestre

O status oxidativo do espermatozoide atua sobre ele de diferentes formas, desde a capacitação até a fecundação do oócito. No entanto, as espécies reativas de oxigênio (EROs) podem ser benéficas ou prejudiciais dependendo do contexto celular. Tendo em vista a baixa proteção antioxidante do sêmen criopreservado, associado às sucessivas manipulações que antecedem a fecundação in vitro, entender como esta célula se comporta em um ambiente oxidante e os impactos deste sobre o embrião é de suma importância. Com isto, o objetivo deste trabalho foi propor um modelo dose-dependente para o estudo do estresse oxidativo sobre o espermatozoide e possível impacto no desenvolvimento embrionário. Para isto, no experimento 1, palhetas de sêmen criopreservado de touros (n=5) da raça Nelore foram submetidas à incubação por 1 hora a 38,5 ºC e 5% CO2, com doses crescentes de peróxido de hidrogênio (0; 12,5; 25; e 50 µM). Ao final da incubação, os parâmetros de motilidade foram avaliados pelo sistema Computer Assisted System Analysis (CASA). No experimento 2, foram escolhidas duas doses de peróxido de hidrogênio com base nos resultados do experimento 1: alta (50 µM), baixa (12,5 µM) e também um controle (0 µM). Os espermatozoides foram incubados com as respectivas doses de peróxido de hidrogênio por 1 hora, e ao final da incubação foram utilizados para a fecundação in vitro (D=0). Neste experimento, além das análises do CASA, foram feitas avaliações do status oxidativo (CellROX® green e 2'-7'diacetato de diclorofluoresceína - DCFH), do potencial mitocondrial (JC-1), da cromatina (LA) e da capacitação espermática (clortetraciclina). Os embriões foram avaliados com relação à taxa de clivagem rápida (30 horas pós-inseminação), taxa de clivagem (D=3), taxa de desenvolvimento (D=5) e taxa de blastocisto (D=8). Para análise estatística foi utilizado o modelo de regressão polinomial, considerando p≤0,05. Tanto no experimento 1 quanto no experimento 2 houve detrimento dose-dependente do peróxido de hidrogênio sobre o padrão de movimento e de porcentagem de células móveis. Houve aumento dose-dependente da porcentagem de células positivas para CellROX® células capacitadas e positivas para o LA. Com relação às taxas de clivagem e de blastocisto, houve diminuição da porcentagem de embriões clivados e de blastocistos, conforme a dose de peróxido de hidrogênio foi aumentada. Referente à taxa de desenvolvimento embrionário, houve bloqueio das estruturas em 2-4 células. Nestas condições, o espermatozoide quando exposto a um ambiente oxidante, apresenta alterações no padrão de motilidade, no status oxidativo e na capacitação, sendo que estas interferem de forma negativa no desenvolvimento embrionário, desde o início da clivagem até a formação do blastocisto. / Oxidative status may influence spermatozoa by distinct mechanisms, from capacitation to oocyte fertilization. However, reactive oxygen species (ROS) could be beneficial or harmful depending on cellular context. Due to the low levels of antioxidant enzymes of cryopreserved semen, associated to successive manipulations prior to in vitro fertilization (IVF), it is momentous to understand the mechanism involved on sperm status in such conditions and the further impact on embryo development. The present study aimed to assess the possible impact of a dose-dependent model for sperm oxidative stress on embryo development. In experiment 1, straws from five Nelore bulls were subjected to a 1 hour incubation at 38,5 ºC and 5% CO2, with increase doses of hydrogen peroxide (0; 12,5; 25; e 50 &microM). At the end of incubation period, motility parameters were evaluated by Computed Assisted System Analysis (CASA). Based on the results of the experiment 1, experiment 2 was designed to study a high (50 µM) and a low (12,5 µM) dose of hydrogen peroxide and also a control (0 µM). Sperm samples were incubated with each dose for 1 hour and subsequently used for in vitro fertilization (D=0). Samples were analyzed by CASA, oxidative status (CellROX® green and 2'-7' diclorofluorescein diacetate - DCFH), mitochondrial potential (JC-1), chromatin (LA) and sperm capacitation status (chlortetraciclin). Embryos were evaluated based on fast cleavage rate (30 hours pos-insemination), cleavage rate (D=3), development rate (D=5) and blastocyst rate (D=8). Statistical analysis was performed by polynomial regression model, considering significant a p≤0,05. A dose-dependent deleterious effect of hydrogen peroxide was observed on most motility variables evaluated by CASA, including the percentage of motile cells. Similarly, a dose-dependent increase was observed on the percentages of positive cells for CellROX®, capacitated sperm and also for LA. A decrease on the percentage of cleaved embryos and blastocyst was observed as hydrogen peroxide increased. Interestingly, a blockage was detected during the 2-4 cell stage. In these conditions when exposed to oxidative environment, sperm may present disabled motility characteristics, oxidative status and premature capacitation and such abnormalities result on impaired embryo development, from the first cleavage to blastocyst.

Submitted by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2014-06-09T17:14:08Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_TransporteSimuladoOocitos.pdf: 194042 bytes, checksum: e90d60d2b3fb2015816cf5c7755de51a (MD5) / Approved for entry into archive by Ana Rosa Silva (arosa@ufpa.br) on 2014-07-01T14:33:46Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_TransporteSimuladoOocitos.pdf: 194042 bytes, checksum: e90d60d2b3fb2015816cf5c7755de51a (MD5) / Made available in DSpace on 2014-07-01T14:33:46Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 23898 bytes, checksum: e363e809996cf46ada20da1accfcd9c7 (MD5) Dissertacao_TransporteSimuladoOocitos.pdf: 194042 bytes, checksum: e90d60d2b3fb2015816cf5c7755de51a (MD5) Previous issue date: 2009 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O transporte dos oócitos até ao laboratório é um fator determinante que tem limitado a difusão comercial da técnica de Produção in vitro de embriões (PIVE). Por este motivo, a utilização de um meio de transporte-maturação que forneça maior viabilidade aos oócitos durante o transporte é fundamental. O objetivo deste estudo foi avaliar a viabilidade do transporte simulado de oócitos bovinos em meio quimicamente definido, por diferentes períodos de tempo sem o controle da atmosfera gasosa, e a necessidade da adição de hormônios neste meio. Oócitos bovinos imaturos (n=989) obtidos de ovários de vacas abatidas em frigorífico, foram selecionados e distribuídos aleatoriamente em 2 experimentos. No experimento I, 649 oócitos foram distribuídos em 5 grupos. No grupo controle (0h), os oócitos foram maturados por 24h em meio de maturação, em estufa de CO2 a 38,5°C. Os oócitos foram transportados em uma incubadora portátil sem controle da atmosfera gasosa a 38,5°C, por 3, 6, 9 e 12h. Os oócitos dos grupos experimentais completaram a maturação nas mesmas condições do grupo 0h. No experimento II, 340 oócitos foram distribuídos em 5 grupos. No grupo controle (0h), os oócitos foram maturados nas mesmas condições do grupo 0h do experimento I. Nos grupos experimentais, os oócitos foram transportados nas mesmas condições do experimento I, no entanto o meio de transporte-maturação foi suplementado ou não com hormônios, e o transporte ocorreu por 3h (com e sem hormônios) e 6h (com e sem hormônios). Os oócitos dos grupos experimentais completaram a maturação nas mesmas condições do grupo 0h. A fecundação foi efetuada em meio Talp-Stock por 18 a 22h e o cultivo por 7 dias em meio SOF. No experimento I, as taxas de clivagem foram estatisticamente similares (p>0,05) para os grupos 0h (64,9%) e 3h (56,2%), porém houve uma redução destas taxas nos grupos 6h (45,8%), 9h (47,1%) e 12h (44,0%), que foram semelhantes entre si. A produção de blastocistos no experimento I, não foi estatisticamente diferente (p>0,05) para os grupos 0h (38,0%) e 3h (32,3%), porém houve uma redução nestas taxas nos grupos 6h (27,3%), 9h (24,8%) e 12h (18,9%), no entanto, as taxas de blastocistos assemelham-se entre os grupos 3, 6 e 9h. No experimento II, as taxas de clivagem foram estatisticamente similares (p>0,05) para os grupos 0h (71,4%) e 3h com hormônios (70,3%), porém houve uma redução destas taxas nos grupos 3h sem hormônios (64,8%), 6h com (56,0%) e sem (54,1%) hormônios, que foram diferentes entre si. A produção de blastocistos no experimento II, foi estatisticamente similar (p>0,05) para os grupos 0h (46,1%) e 3h com hormônios (45,8%), porém houve uma redução destas taxas nos grupos 3h sem hormônios (41,1%), 6h com (35,5%) e sem (33,5%) hormônios, que foram diferentes entre si. Esses resultados indicam a possibilidade do transporte de oócitos bovinos, em meio quimicamente definido, utilizando incubadora portátil, sem controle da atmosfera gasosa, a 38,5ºC, pelo período de até 9h, e que a adição de hormônios neste meio pode aumentar os índices de blastocistos. / The transport of the oocytes until the laboratory is a determining factor that has limited the commercial diffusion of the Production in vitro embryo technique (PIVE). For this reason, the use of a means of transport-maturation to provide greater viability to the oocytes during the transport is fundamental. The objective of this study was to evaluate the viability of the simulated transport of the bovine oocytes in chemically defined medium, by different periods of time without the gaseous atmosphere control, and the need for the addition of hormones in this medium. Immature bovine oocytes (n=989) obtained from bovine ovaries of cows slaughtered in a refrigerator, were selected and randomly distributed in 2 experiments. In experiment I, 649 oocytes were distributed into 5 groups. In the control group (0h), the oocytes were borne during 24h by means of maturation, in a CO2 incubator at 38,5ºC. The oocytes were transported in an incubator portable without gaseous atmosphere control at 38,5°C for 3, 6, 9 and 12h. The oocytes of experimental groups completed the maturation under the same conditions of the group 0h. In experiment II, 340 oocytes were distributed into 5 groups. In the control group (0h), the oocytes were matured during the same conditions of the group 0h of the experiment I. The experimental groups, the oocytes were transported under the same conditions of the experiment I, however the means of transport-maturation was supplemented or not with hormones, and the transport occurred in 3h (with and without hormones) and 6h (with and without hormones). The oocytes of experimental groups completed the maturation under the same conditions of the of the group 0h. The fertilization was performed in Talp-Stock by 18 to 22h and growing by 7 days in SOF medium. In experiment I, the rates of cleavage were statistically similar (p>0,05) to the groups 0h (64,9%) and 3h (56,2%), although there was a reduction in these rates in the groups 6h (45,8%), 9h (47,1%) and 12h (44,0%), which were similar among themselves. The production of blastocysts in experiment I, was not statistically different (p>0,05) for the groups 0h (38,0%) and 3h (32,3%), but there was a reduction in these rates in groups 6h (27,3%), 9h (24,8%) and 12h (18,9%), however, the rates of blastocysts are similar among the groups 3h, 6h and 9h. In experiment II, the rates of cleavage were statistically similar (p>0,05) to the groups 0h (71,4%) and 3h with hormones (70,3%), but there was a reduction in these rates in groups 3h without hormones (64,8%), 6h with (56,0%) and without (54,1%) hormones, which were different among themselves. The production of blastocysts in experiment II, was statistically similar (p>0.05) for the groups 0h (46,1%) and 3h with hormones (45,8%), but there was a reduction in these rates in groups 3h without hormones (41,1%), 6h with (35,5%) and without (33,5%) hormones, which were different among themselves. These results indicate the possibility of the transport of bovine oocytes, in chemically defined medium, using incubator portable, without gaseous atmosphere control, at 38,5ºC, for the period of up to 9h, and that the addition of hormones in this medium may increase the rates of blastocysts.

O status oxidativo do espermatozoide atua sobre ele de diferentes formas, desde a capacitação até a fecundação do oócito. No entanto, as espécies reativas de oxigênio (EROs) podem ser benéficas ou prejudiciais dependendo do contexto celular. Tendo em vista a baixa proteção antioxidante do sêmen criopreservado, associado às sucessivas manipulações que antecedem a fecundação in vitro, entender como esta célula se comporta em um ambiente oxidante e os impactos deste sobre o embrião é de suma importância. Com isto, o objetivo deste trabalho foi propor um modelo dose-dependente para o estudo do estresse oxidativo sobre o espermatozoide e possível impacto no desenvolvimento embrionário. Para isto, no experimento 1, palhetas de sêmen criopreservado de touros (n=5) da raça Nelore foram submetidas à incubação por 1 hora a 38,5 ºC e 5% CO2, com doses crescentes de peróxido de hidrogênio (0; 12,5; 25; e 50 µM). Ao final da incubação, os parâmetros de motilidade foram avaliados pelo sistema Computer Assisted System Analysis (CASA). No experimento 2, foram escolhidas duas doses de peróxido de hidrogênio com base nos resultados do experimento 1: alta (50 µM), baixa (12,5 µM) e também um controle (0 µM). Os espermatozoides foram incubados com as respectivas doses de peróxido de hidrogênio por 1 hora, e ao final da incubação foram utilizados para a fecundação in vitro (D=0). Neste experimento, além das análises do CASA, foram feitas avaliações do status oxidativo (CellROX® green e 2'-7'diacetato de diclorofluoresceína - DCFH), do potencial mitocondrial (JC-1), da cromatina (LA) e da capacitação espermática (clortetraciclina). Os embriões foram avaliados com relação à taxa de clivagem rápida (30 horas pós-inseminação), taxa de clivagem (D=3), taxa de desenvolvimento (D=5) e taxa de blastocisto (D=8). Para análise estatística foi utilizado o modelo de regressão polinomial, considerando p≤0,05. Tanto no experimento 1 quanto no experimento 2 houve detrimento dose-dependente do peróxido de hidrogênio sobre o padrão de movimento e de porcentagem de células móveis. Houve aumento dose-dependente da porcentagem de células positivas para CellROX® células capacitadas e positivas para o LA. Com relação às taxas de clivagem e de blastocisto, houve diminuição da porcentagem de embriões clivados e de blastocistos, conforme a dose de peróxido de hidrogênio foi aumentada. Referente à taxa de desenvolvimento embrionário, houve bloqueio das estruturas em 2-4 células. Nestas condições, o espermatozoide quando exposto a um ambiente oxidante, apresenta alterações no padrão de motilidade, no status oxidativo e na capacitação, sendo que estas interferem de forma negativa no desenvolvimento embrionário, desde o início da clivagem até a formação do blastocisto. / Oxidative status may influence spermatozoa by distinct mechanisms, from capacitation to oocyte fertilization. However, reactive oxygen species (ROS) could be beneficial or harmful depending on cellular context. Due to the low levels of antioxidant enzymes of cryopreserved semen, associated to successive manipulations prior to in vitro fertilization (IVF), it is momentous to understand the mechanism involved on sperm status in such conditions and the further impact on embryo development. The present study aimed to assess the possible impact of a dose-dependent model for sperm oxidative stress on embryo development. In experiment 1, straws from five Nelore bulls were subjected to a 1 hour incubation at 38,5 ºC and 5% CO2, with increase doses of hydrogen peroxide (0; 12,5; 25; e 50 &microM). At the end of incubation period, motility parameters were evaluated by Computed Assisted System Analysis (CASA). Based on the results of the experiment 1, experiment 2 was designed to study a high (50 µM) and a low (12,5 µM) dose of hydrogen peroxide and also a control (0 µM). Sperm samples were incubated with each dose for 1 hour and subsequently used for in vitro fertilization (D=0). Samples were analyzed by CASA, oxidative status (CellROX® green and 2'-7' diclorofluorescein diacetate - DCFH), mitochondrial potential (JC-1), chromatin (LA) and sperm capacitation status (chlortetraciclin). Embryos were evaluated based on fast cleavage rate (30 hours pos-insemination), cleavage rate (D=3), development rate (D=5) and blastocyst rate (D=8). Statistical analysis was performed by polynomial regression model, considering significant a p≤0,05. A dose-dependent deleterious effect of hydrogen peroxide was observed on most motility variables evaluated by CASA, including the percentage of motile cells. Similarly, a dose-dependent increase was observed on the percentages of positive cells for CellROX®, capacitated sperm and also for LA. A decrease on the percentage of cleaved embryos and blastocyst was observed as hydrogen peroxide increased. Interestingly, a blockage was detected during the 2-4 cell stage. In these conditions when exposed to oxidative environment, sperm may present disabled motility characteristics, oxidative status and premature capacitation and such abnormalities result on impaired embryo development, from the first cleavage to blastocyst.

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-01-26T14:14:38Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_EfeitoMeioCondicionado.pdf: 921361 bytes, checksum: 836f42e4214b67273644ea066034ca71 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-01-27T13:40:05Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_EfeitoMeioCondicionado.pdf: 921361 bytes, checksum: 836f42e4214b67273644ea066034ca71 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-27T13:40:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_EfeitoMeioCondicionado.pdf: 921361 bytes, checksum: 836f42e4214b67273644ea066034ca71 (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 / As células tronco são conhecidas por suas propriedades de auto-renovação, diferenciação em diversas linhagem celulares e capacidades imunomoduladores, além de expressarem um grande número de moléculas de adesão, as proteínas de matriz extracelular, citocinas e receptores para fatores de crescimento, permitindo interações com demais células. Podem ser isoladas de vários tecidos, porém as células-tronco adultas derivadas do estroma do tecido adiposo (MSC-ad) apresentam como vantagens a facilidade de isolamento, alto rendimento e baixa morbidade. Baseado nisso, a hipótese deste trabalho é verificar se o uso de meio condicionado pelas MSC-ad na maturação in vitro tem efeito sobre a as taxas de desenvolvimento de embriões bovinos. Para tanto, foi feito o isolamento e em seguida o cultivo de MSC-ad de origem bovina que se estendeu até a passagem três (P3) em meio de cultivo DMEM, suplementado com bicarbonato de sódio, 10% Soro fetal bovino (SFB), 50μl/mL de gentamicina. Quando os cultivos atingiram a confluência de 70% o meio foi substituído por TCM199 suplementado com 0.2 mM de piruvato, 50 μl/ml de gentamicina e 10% de SFB (meio de MIV). As MSC-ad foram condicionadas com meio TCM199 suplementado pelo período de 0 (Grupo CONTROLE), 24 (grupo COND-24h), 48 (grupo COND-48h) e 72 horas (grupo COND-72h), sendo que ao fim de cada período, o meio sobrenadante foi retirado, filtrado, aliquotado e congelado a -200 C. O meio foi descongelado somente no dia da MIV, e suplementado com 0,5 μl de PMSG (concentração 7UI/Ml) e 0,5 μl de HCG. Ovários de abatedouro foram puncionados para obtenção de complexos cumulus oophurus (CCOs) que foram maturados por 24 horas em microgotas de meios condicionados sob óleo mineral e incubados em estufa a 5% de CO2 com 38,5° C. A avaliação da maturação nuclear foi feita com 22 horas, em seguida realizada a ativação partenogenética somente dos oócitos que exibiam corpúsculo polar com concentração em 50 μM de ionomicina por 5 minutos, inativação com TCM199-Hepes saturado com 0,03g de BSA, seguida de incubação por 3 horas em microgotas de 2mM de 6-DMAP. Após esse período as partenogêneses foram transferidas para migrogotas de meio de cultivo in vitro. As taxas de desenvolvimento foram avaliadas no segundo e sétimo dia após a ativação. Os resultados foram analisados por ANOVA e pós-teste de Fisher adotando nível de significância de 5%. Para os grupos experimentais CONTROLE, COND-24h, COND-48h e COND-72h, obtivemos os seguinte 14 resultados, respectivamente: 83.7, 77.7, 81,4 e 76.1% de maturação nuclear; 87.5, 86,9, 74 e 80.3% de clivagem e 23.8, 27.5, 18 e 19.6% de formação de blastocisto. Não houve diferença estatística entre os grupos experimentais condicionados (p>0.05). Porém, as taxas de blastocisto foram menores quando comparadas ao meio de MIV fresco (42.1%) (p<0.05). Isto sugere que o condicionamento ou o congelamento do meio afetou a sua eficiência. Estudos futuros deverão ser realizados para avaliar os níveis dos fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas secretadas no meio de MIV. / Stem cells are known for their property of self-renewal, differentiation into various cell lineages and immunomodulatory capabilities, in addition to express a large number of adhesion molecules, extracellular matrix proteins, cytokines and growth factor recptors, allowing interactions with other cells. They can be isolated from various tissues, but adult stem cells derived from adipose tissue stroma (MSC-d) have the advantage of being easely isolated, high yield and low morbidity. Based on this, the study hypothesis is to verify the effect of MSC-ad conditioned medium use in in vitro maturation on development rates of bovine embryos. To this end, bovine MSC ad were isolated then cultivated until the passage three (P3) in DMEM culture medium, supplemented with sodium bicarbonate, 10% fetal bovine serum (FBS), 50mL / mL gentamicin. When cultures reached 70% confluency, the medium was replaced with TCM199 supplemented with 0.2 mM pyruvate, 50 ul / ml gentamicin and 10% FBS (IVM medium). The MSC-ad were conditioned with medium TCM199 supplemented for a period of 0 (Control Group), 24 (COND-24 group), 48 (COND-48h group) and 72 hours (COND group-72h), wherein the end of each period, the supernatant medium was removed, filtered, aliquoted and frozen at -20 0 C. The medium was thawed only on MIV day, and supplemented with 0.5 uL of PMSG (concentration 7 IU / ml) and 0.5 uL of HCG. Slaughterhouse ovaries were punctured to obtain oophurus cumulus complexes (COCs) were matured for 24 hours in microdrops of conditioned mediums under mineral oil them incubated in an incubator at 5% CO 2 at 38.5 ° C. Nuclear maturation assessment was performed with 22 hours, then held 15 parthenogenetic activation of only oocytes that exhibited polar body concentration of at least 50 uM ionomycin for 5 minutes, inactivation with TCM199-Hepes 0.03g saturated with BSA, followed by incubation for 3 hours microdroplets 2mM 6-DMAP. After this period, the parthenogenesis were transferred as microdrops to a culture medium in vitro. development rates were evaluated in the second and seventh days after activation. The results were analyzed by ANOVA and Fisher's post-test adopting a significance level of 5%. For groups: Experimental CONTROL, COND-24, COND-48h and 72h-COND, we obtained the following results respectively: 83.7, 77.7, 81.4 and 76.1% of nuclear maturation; 87.5, 86.9, 74 and 80.3 and 23.8% cleavage, 27.5, 18 and 19.6% of blastocyst formation. There was no statistical difference between condinioned experimental groups (p<0.05). However, blastocyst rates were lower when compared with fresh IVM medium (42.1%) (p<0.05). This suggests that the efficiency was affected by the conditioning of the medium or freezing. Future studies should be conducted to assess the levels of growth factors, cytokines and chemokines secreted in IVM medium.

Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-02-15T16:26:17Z No. of bitstreams: 1 joaogabrielvianadegrazia.pdf: 1482516 bytes, checksum: cb92ddb43d93af9c01680b364e327797 (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-02-26T12:26:02Z (GMT) No. of bitstreams: 1 joaogabrielvianadegrazia.pdf: 1482516 bytes, checksum: cb92ddb43d93af9c01680b364e327797 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-02-26T12:26:02Z (GMT). No. of bitstreams: 1 joaogabrielvianadegrazia.pdf: 1482516 bytes, checksum: cb92ddb43d93af9c01680b364e327797 (MD5) Previous issue date: 2014-02-26 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Na última década a produção in vitro de embriões tornou-se uma técnica de grande importância na reprodução de bovinos. No gado de leite, ela tem sido bastante utilizada com destaque para as raças Gir e Holandesa. Dentre outras características, essas duas raças apresentam diferenças relacionadas à fisiologia reprodutiva, com reflexo no potencial de produção de embriões no sistema in vitro. Sabendo da importância de ambas as raças para o rebanho brasileiro, é primordial entender as bases fisiológicas destas diferenças e buscar ferramentas para avaliação da qualidade e viabilidade de oócitos e embriões. O objetivo desse trabalho foi caracterizar o fenótipo “doadora” com base na produção de embriões e avaliar alguns genes como possíveis marcadores de produção nestas raças. Para isso, inicialmente foram analisados dados de um laboratório comercial de produção in vitro de embriões. Posteriormente, foi realizada a caracterização molecular e avaliação da expressão relativa de genes candidatos, utilizando-se a técnica de PCR em Tempo-Real, em amostras de células da granulosa cultivadas provenientes de animais com diferentes perfis de produção de embriões. Uma maior produção de complexos cumulus-oócito (COC) total e viáveis foi observado em doadoras da raça Gir. Da mesma forma, animais da raça Gir apresentavam maior taxa de conversão e maior produção total de embriões, independente da raça do touro utilizado para fertilização. Entretanto, nas duas raças não houve diferença na produção de COC entre animais com diferentes taxas de conversão COC/embrião. Não houve diferença nas expressão dos genes (BAX, INHA, IGFIR, LHR, STAR) entre animais com alta ou baixa produção de embriões, assim como entre raças. No entanto, o gene PRDX1 estava sobre-expresso em doadoras da raça Holandesa caracterizadas como de alta produção de embriões. Esses resultados confirmam a maior produção de COC em animais da raça Gir, quando comparados aos animais da raça Holandesa, assim como, a maior produção total de embriões no sistema in vitro, mas sugerem que nas duas raças a eficiência na produção de embriões não é determinada pela produção total de COC. A avaliação da expressão gênica de células da granulosa obtidas de cultivos para a produção in vitro de embriões não possibilitou a caracterização de marcadores com potencial para predição da produção de embriões das doadoras. / In the last years the in vitro production of embryos became a technique of great importance in the reproduction of cattle. In the dairy cattle, it has been widely used with spotlight for the Gyr and Holstein breeds. Among other features, this two breeds exhibit differences related to reproductive physiology and reflects on the potential of production of embryos in the system in vitro. Knowing the importance of both breed for the Brazilian herd, it is critical to understand the physiological basis of these differences and search tools to evaluate the quality and viability of oocytes and embryos. The aim of this study was to characterize the phenotype "donor" based on embryo production and evaluate some genes as potential markers for production in these breeds. To do this initially, data from in vitro production of embryos from a commercial laboratory were analyzed. Subsequently, the molecular characterization and evaluation of the relative expression of candidate genes was performed in samples of granulosa cells from culture of animals with different profiles of production embryos using the Real-time PCR. A higher production of total and viable oocyte-cumulus complexes (COC) was observed in donor Gyr. Likewise, animals Gyr had a higher conversion rate and higher total production of embryos, independent of breed of sire used for fertilization. However, in the two breeds there was no difference in the production of COC between animals with different conversion rates COC / embryo. There was no differences in the expression of genes (BAX, INHA, IGFIR, LHR, STAR) between animals with high or low production of embryos, as well as between breeds. However, the PRDX1 gene was overexpressed in donor Holstein characterized as high production of embryos. These datas confirm the higher production of COC in Gyr breed animals when compared to Holstein cows, as well as the highest total production of embryos in vitro system, but suggest that the two breeds efficiency in the production of embryos is not determined by the total production of COC. The assessment of gene expression of granulosa cells obtained from cultures for in vitro production of embryos did not allow the characterization of potential markers for predicting embryo production of donors.

Os programas de melhoramento genético objetivam a seleção de animais geneticamente e fenotipicamente superiores. Dentre as características selecionadas para aumentar o ganho genético do rebanho, o perímetro escrotal destaca-se por sua alta herdabilidade e correlação com precocidade sexual, peso do animal e morfologia espermática. A seleção fenotípica para perímetro escrotal pode ser auxiliada pela junção da DEP PE 365 (diferença esperada na progênie para perímetro escrotal aos 365 dias) com a biotecnologia reprodutiva PIVE (produção in vitro de embriões), e tecnologias moleculares como o uso de marcadores do tipo SNPs (Single Nucleotide Polymorphism) e marcadores bioquímicos (proteínas). Desta forma, o presente trabalho teve por objetivo: verificar se os SNPs presentes nos genes atuantes na maturação sexual B4GALT1 (Beta 1,4- galactosyltransferase), FSHR (Follicle-stimulating hormone), LHR (Luteinizing hormone receptor) e IGF2 (Insulin-like growth factor 2) podem estar associados a maiores valores de DEP PE 365 em touros da raça Nelore; fazer o estudo global de proteínas no sêmen de touros da raça Nelore que possam ser indicativas de maior DEP PE 365 e verificar se a DEP PE 365 interfere negativamente ou positivamente nos resultados da PIVE. Para as análises de SNP, 178 touros foram divididos em dois grupos, sendo um com 104 animais de DEP PE 365 negativa e outro com 74 animais com DEP positiva. O DNA foi extraído do sangue destes animais e a região genômica de interesse foi amplificada e analisada por RFLP (restriction fragment lengh polymorphism). No caso da proteômica, dois pools de sêmen foram comparados entre si quanto aos seus perfis protéicos por LCMS (Liquid chromatographymass spectrometry): um proveninete de três touros que produzem em média 17,6% de embriões/oócito in vitro e DEP PE 365 média de -0,3 (inferiores) e outro pool proveniente de três touros que produzem em média 34,25% de embriões/oócito, com DEP PE 365 média de 1,07 (superiores). Para verificar se a DEP PE 365 de touros utilizados na PIVE influencia na quantidade e cinética de embriões produzidos, 48 touros foram divididos em três grupos (superior, neutro e inferior) por meio da amplitude total de suas DEPs PE 365 e então utilizados na PIVE. Então, observou-se a quantidade e os tipos de blastocistos gerados por cada um dos grupos. Os resultados do presente trabalho mostraram: o genótipo CC no SNP analisado no gene LHR, e o genótipo TT no SNP analisado no gene IGF2 podem estar relacionados a animais de maiores DEP PE 365 (p 0.05); proteínas envolvidas em vias metabólicas foram predominantes no grupo dos touros superiores e portanto podem ser prováveis marcadores bioquímicos de reprodutores com maiores DEP PE 365; touros com maiores DEPs PE 365 resultam na maior PIV de embriões favoráveis para serem transferidos para vacas receptoras (Bl e Bx; blastocisto e blastocisto expandido; p 0.05). Tais resultados apresentam informações que podem auxiliar na seleção de animais com melhores dados fenotípicos de DEP PE 365 e, portanto, melhores reprodutores. / The breeding programs aim the selection of phenotypically and genetically superior animals . Among the selected characteristics to increase genetic gain in the herd, scrotal circumference stands out for its high heritability and correlation with sexual precocity, animal weight and morphology . Phenotypic selection for scrotal circumference may be aided by the addition of EPD SC 365 (expected progeny difference for scrotal circumference at 365 days ) to IVPE (in vitro production of embryos) reproductive biotechnology and molecular technologies such as the use of molecular markers like SNPs (Single Nucleotide Polymorphism ) and biochemical markers (proteins). Thus, this study aimed to: determine whether the SNPs present in genes B4GALT1 (Beta 1,4 - galactosyltransferase), FSHR (Follicle - stimulating hormone), LHR (Luteinizing hormone receptor) and IGF2 (Insulin- like growth factor 2) may be associated with higher values of EPD SC 365 in Nelore bulls; make global study of proteins in semen from Nelore bulls that may be indicative of greater EPD SC 365 and check if EPD SC 365 interferes negatively or positively on the results of IVPE. For the analysis of SNP, 178 bulls were divided into two groups, one with 104 animals of 365 negative EPD SC 365 and another with 74 animals with positive EPD SC 365. DNA was extracted from blood of these animals and genomic region of interest was amplified and analyzed by RFLP (restriction fragment polymorphism lengh). In the case of proteomics, two pools of semen were compared in respect to their protein profiles by LCMS (Liquid chromatography - mass spectrometry): One from three bulls that produce on average 17.6 % of in vitro embryo/oocyte and with EPD SC 365 average -0.3 (lower) and another pool from three bulls that produce on average 34.25% of in vitro embryo/oocyte with EPD SC 365 average of 1.07 (upper). To check if EPD SC 365 bulls used in IVPE influences the amount and kinetics of embryos, 48 bulls were divided into three groups (upper, lower and neutral ) through the full range of their EPDs SC 365 and then used in IVPE. Then, it was observed the amount and types of blastocysts generated by each group. The results of this study showed: the CC genotype at SNP analyzed in LHR gene, and the TT genotype at SNP analyzed in the IGF2 gene may be related to larger EPD SC 365 animals (p 0.05); proteins involved in metabolic pathways were predominant in group of senior bulls and can therefore be likely biochemical markers of breeding with larger EPD SC 365; bulls with larger EPD SC 365 used in IVPE result in greater favor of embryos to be transferred to recipient cows (Bl and Bx; blastocyst and expanded blastocyst, p 0:05). These results provide information that can assist in the selection of animals with improved phenotypic data EPS SC 365 and, therefore, the best breeders.

Os resultados da produção in vitro de embriões (PIVE) sofrem variações que podem ser decorrentes do efeito do touro utilizado. Fatores paternos afetam o desenvolvimento embrionário desde as primeiras clivagens até após a ativação do genoma embrionário (AGE). Pouco se sabe sobre os mecanismos que promovem a diferença de fertilidade in vitro entre touros, muito menos as consequências no desenvolvimento do embrião. Por tanto, o objetivo do presente trabalho foi identificar o momento em que ocorre divergência entre embriões oriundos de touros com diferença de fertilidade e as causas para tal divergência. Para isto, 10 touros (Alta fertilidade, AF, n=5, Baixa fertilidade, BF n=5) foram retrospectivamente selecionados a partir de um banco de dados de 3 anos de um laboratório comercial de PIVE, com aproximadamente 140 touros, baseados nas taxas de desenvolvimento embrionário (taxa de blastocistos/taxa de clivagem). Embriões produzidos com o sêmen de cada um dos touros foram avaliados e classificados de acordo com o estágio de desenvolvimento (não clivados, 2 células, 3-4 células, 6 células, 8 células) às 24, 36, 48, 60, 72 horas pós inseminação (hpi) para estabelecer a cinética de desenvolvimento embrionário. A avaliação da taxa de fecundação foi feita a partir da contagem dos pronucleos, a taxa de clivagem foi realizada no dia 3 (D3) de cultivo in vitro, e as taxas de desenvolvimento embrionário e a taxa de blastocisto (Grau I e Grau II, GI e GII respectivamente) foram avaliadas no dia 7 (D7). Embriões no estágio de 8 células e blastocistos foram coletados de cada touro e manipulação para avaliação da abundância de 96 transcritos. Além disso, blastocistos foram avaliados quanto a contagem total de células e a fragmentação de DNA (TUNEL). Não foram encontradas diferenças em relação à cinética de desenvolvimento nos momentos observados (p&gt;0,05), nem na taxa de clivagem (AF=86,7%; BF= 84,9%; p= 0,25), entretanto, o grupo de alta fertilidade apresentou maior taxa de fecundação (72%) do grupo de baixa (62%) e também menor taxa de poliespermia (AF=16,2% BF=29,2%). Como esperado, a taxa de blastocisto (AF=29,4%; BF= 16,0%; p&lt;0,0001), e a taxa de desenvolvimento embrionário (AF=33,9 % BF= 18,9%; p&lt;0,0001) foram maiores no grupo de alta fertilidade. No estágio de oito células, 30 transcritos foram diferencialmente representados entre os grupos experimentais (p&lt;0,10). Apenas PGK1, PPIA e TFAM tiveram maior representação no grupo de alta fertilidade. Genes relacionados a estresse embrionário (9/27, 33%), proliferação celular (8/27, 30 %), metabolismo lipídico (6/27, 22%), e outras funções celulares (4/27, 15%) foram mais representados no grupo de baixa fertilidade. Blastocistos apresentaram apenas 12 genes diferencialmente representados (p&lt;0,10), sendo apenas ACSL3, ELOV1, IFNT mais representados no grupo de alta fertilidade. Não foram encontradas diferenças entre os grupos na contagem de células totais, fragmentação de DNA ou porcentagem de blastocistos GI (p&lt;0,05). Os resultados demonstraram que mesmo não sendo observados efeitos paternos na cinética embrionária inicial, a fertilidade in vitro dos touros influencia a abundância de transcritos no estágio de oito células e blastocisto, sendo desde último, em menor proporção. Um aumento da representação de genes relacionados a estresse oxidativo e apoptose no momento de AGE sugere que o desenvolvimento do embrião é prejudicado no grupo de baixa fertilidade, consequentemente resultando em uma menor taxa de blastocistos. / The use of different sires influences in vitro embryo production (IVP) outcome. Paternal effects are observed from the first cleavages until after embryonic genome activation (EGA). Little is known about the mechanisms that promote in vitro fertility differences, even less about the consequences on embryo development. Therefore, the objective of the present work was to identify divergence moment between embryos from high and low fertility bulls and identify the causes for this divergency. For that, ten bulls were retrospectively selected in high (HF; n=5) and low (LF; n=5) in vitro fertility from a database of approximately 140 bulls used in commercial IVP ranked based on embryo development rate (blastocyst/cleaved rate). IVP embryos from 5 manipulations were classified by their stage of development (2 cell, 3-4 cell, 6 cell, 8 cell), at 24, 36, 48, 60, 72 hpi, to evaluate embryo kinetics. Pronuclei were evaluated 24 hpi, cleavage rate was assessed on day 3 (D3) of in vitro culture, development rate and blastocyst rate (Grade I and II) were assessed on day 7 (D7). Abundance of 96 transcripts was analyzed in embryos at 8-cell stage and blastocysts from each bull and each manipulation. Total cell counting, and DNA fragmentation were assessed on blastocysts as well. There was no difference in early embryo kinetics (p&gt;0.05), and cleavage rate (HF=86.7%; LF= 84.9%; p= 0.25). However, fertilization rate was higher on high fertility group (72%) than low fertility (62%) and polyspermy rate was lower on high fertility compared to low fertility group (HF:16,2% LF:29,2%). As expected, blastocyst rate (HF=29.4%; LF= 16.0%; p&lt;0.0001) and development rate (HF=33.9 % LF= 18.9%; p&lt;0.0001) were higher in the high fertility group than in the low fertility. At 8 cell stage, 30 transcripts were differentially represented (p&lt;0.10) between the two groups. Only PGK1, PPIA and TFAM levels were higher in high fertility group. Stress related genes (9/27, 33%), cell proliferation (8/27, 30 %), lipid metabolism genes (6/27, 22%), and other cellular functions (4/27, 15%) were highly expressed on low fertility embryos. Blastocysts had only 12 differentially represented transcripts (plt;0.10); only ACSL3, ELOV1 and IFNT were higher in high fertility. Lipid metabolism genes (3/9, 33%) and other cellular functions (6/9, 67%) were higher in low fertility group. Results demonstrate that although there was no paternal effect on early in vitro embryo kinetics, sire in vitro fertility influences the content of transcripts at 8-cell stage and at blastocyst stage, but at a lower extent. An increase in apoptotic and oxidative stress genes at EGA stage suggest that embryo development is impaired in LF group causing reduction of blastocyst rate.

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:35:10Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2011-07-15Bitstream added on 2014-06-13T18:46:17Z : No. of bitstreams: 1 lucio_ac_dr_jabo.pdf: 8403632 bytes, checksum: 32d25390bda4a085595ac038827009d8 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo do presente estudo foi verificar se existem diferenças no desenvolvimento de embriões produzidos com sêmen sexado por centrifugação em gradiente de densidade e por citometria de fluxo e também quantificar a expressão relativa de genes importantes para o desenvolvimento embrionário. Após a sexagem os espermatozóides foram submetidos a produção de embriões in vitro. Foram avaliadas as taxas de clivagem e blastocisto para verificar a influência do método de sexagem no desenvolvimento in vitro de embriões. Os blastocistos foram coletados nos dias 7 e 8 de desenvolvimento, e submetidos a extração de RNA para a avaliação da expressão de genes relacionados a qualidade do embrião: AKR1B1, COX2, IGF2R, PLAC8 (desenvolvimento de placenta e reconhecimento da gestação), MnSOD e GPX1 (estresse oxidativo), SCL2A1 (metabolismo) e TP53 (apoptose). Os resultados não mostraram diferenças no desenvolvimento in vitro de embriões (taxas de clivagem e blastocisto) produzidos com sêmen sexado. Em relação ao padrão de expressão, a citometria de fluxo reduz os níveis de mRNA dos genes AKR1B1(P=0,023), COX2 (P=0,016). A centrifugação em gradiente de densidade aumentou os níveis de transcritos dos genes PLAC8 (P=0,007), MnSOD (P=0,013) e GLUT1 (P=0,028). Ambas as técnicas reduzem os níveis de expressão do gene TP53 (P<0,05). A técnica de sexagem por citometria de fluxo altera a expressão de genes envolvidos no processo de implantação, prejudicando o nascimento de uma cria viável. A sexagem produz embriões que não possuem alterações prejudiciais em genes envolvidos no reconhecimento da gestação e formação da placenta, os quais são muito importantes para o processo de implantação; aumenta o padrão de expressão dos genes envolvidos no processo de resposta da célula ao estresse... / The purpose of this work was evaluate differences on development of embryos produced in vitro using sorted semen by density gradient centrifugation and flow cytometry, and differences in relative abundance of important genes for embryo development. Cleavage and blastocyst rates were used to evaluate the influence of the sorting procedure on embryo development. Blastocysts of day 7 and 8 of development were collected, and expression levels quantification AKR1B1, COX2, IGF2R, PLAC8, MnSOD, GPX1, SCL2A1 and TP53, genes related to embryo quality were evaluated. The results showed no differences between the experimental groups in terms of embryo development (cleavage and blastocyst rates). In the expression pattern, flow citometry methodology reduced mRNA abundance of AKR1B1 (P=0.023) and COX2 (P=0.016). Density gradient centrifugation increased the transcripts levels of PLAC8 (P=0.007), MnSOD (P=0.013) and GLUT1 (P=0.028). Both sorting process reduced mRNA of TP53 (P<0.05). Flow citometry affects the expression pattern of genes involved in pregnancy recognition and placenta formation, resulting in poor quality embryo. Density gradient centrifugation methodology do not alter the expression of genes involved in embryo implantation, increases the expression pattern of genes related to oxidative response and metabolism, resulting in viable embryos. These results suggesting that density gradient centrifugation can be an alternative to flow citometry, for produce viable embryos