Orientadora: Profa. Dra. Marcella Pecora Milazzotto / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2014. / Atualmente, diversas tecnologias vêm sendo exploradas e têm sido sugeridas para evidenciar diferenças metabólicas entre embriões que resultem na identificação daqueles mais aptos a gerarem prenhes. Na produção in vitro de embriões bovinos podemos observar diferentes velocidades de desenvolvimento embrionário que apresentam características diferencias em relação ao metabolismo energético, o que se reflete na viabilidade destes embriões. Além disso, por se desenvolverem diferencialmente e apresentarem características metabólicas diferentes, esses embriões também poderão secretar e consumir diferencialmente moléculas no meio de cultivo que serviriam como biomarcadores da viabilidade embrionária. O objetivo principal deste trabalho foi é a identificação de biomarcadores relacionados ao metabolismo energético e sua possível relação com a qualidade embrionária. Para isso, embriões foram classificados, de acordo com sua cinética de clivagem, em embriões rápidos (4 ou mais células) e embriões lentos (2 ou 3 células) às 22 horas após o início do cultivo in vitro (40hpi). Desta forma, foi gerado dois grupos (rápido e lento) que foram avaliados nos estágios de clivagem (40hpi), mórula (96hpi) e blastocisto (168hpi). Em cada momento de análise os grupos foram avaliados em relação a quantidade de glicose, piruvato, lactato e glutamato no meio de cultivo, quantidade de glicogênio intracelular e expressão dos genes candidatos GLUT1, GLUT3, G6PD e GSK3. Como resultado embriões dos grupos rápido e lento variaram em relação ao consumo de glutamato, piruvato e glicose no meio de cultivo, sugerindo uma maior atividade metabólica dos embriões do grupo rápido. O estoque de glicogênio, apesar de similar entre os grupos nas fases de clivagem e mórula, na fase de blastocisto apenas embriões do grupo lento o apresentaram. Embriões de desenvolvimento rápido e lento apresentam diferenças em relação ao padrão de expressão de genes relacionados ao metabolismo energético em algumas das fases analisadas. De acordo com os dados obtidos, nenhum dos metabolitos parece ser um biomarcador que reflita relação com a qualidade embrionária. No entanto, os padrões encontrados associados com dados de expressão gênica obtidos pelo nosso grupo sugerem que embriões lentos são mais próximos do que seria o padrão in vivo.

Os resultados da produção in vitro de embriões (PIVE) sofrem variações que podem ser decorrentes do efeito do touro utilizado. Fatores paternos afetam o desenvolvimento embrionário desde as primeiras clivagens até após a ativação do genoma embrionário (AGE). Pouco se sabe sobre os mecanismos que promovem a diferença de fertilidade in vitro entre touros, muito menos as consequências no desenvolvimento do embrião. Por tanto, o objetivo do presente trabalho foi identificar o momento em que ocorre divergência entre embriões oriundos de touros com diferença de fertilidade e as causas para tal divergência. Para isto, 10 touros (Alta fertilidade, AF, n=5, Baixa fertilidade, BF n=5) foram retrospectivamente selecionados a partir de um banco de dados de 3 anos de um laboratório comercial de PIVE, com aproximadamente 140 touros, baseados nas taxas de desenvolvimento embrionário (taxa de blastocistos/taxa de clivagem). Embriões produzidos com o sêmen de cada um dos touros foram avaliados e classificados de acordo com o estágio de desenvolvimento (não clivados, 2 células, 3-4 células, 6 células, 8 células) às 24, 36, 48, 60, 72 horas pós inseminação (hpi) para estabelecer a cinética de desenvolvimento embrionário. A avaliação da taxa de fecundação foi feita a partir da contagem dos pronucleos, a taxa de clivagem foi realizada no dia 3 (D3) de cultivo in vitro, e as taxas de desenvolvimento embrionário e a taxa de blastocisto (Grau I e Grau II, GI e GII respectivamente) foram avaliadas no dia 7 (D7). Embriões no estágio de 8 células e blastocistos foram coletados de cada touro e manipulação para avaliação da abundância de 96 transcritos. Além disso, blastocistos foram avaliados quanto a contagem total de células e a fragmentação de DNA (TUNEL). Não foram encontradas diferenças em relação à cinética de desenvolvimento nos momentos observados (p>0,05), nem na taxa de clivagem (AF=86,7%; BF= 84,9%; p= 0,25), entretanto, o grupo de alta fertilidade apresentou maior taxa de fecundação (72%) do grupo de baixa (62%) e também menor taxa de poliespermia (AF=16,2% BF=29,2%). Como esperado, a taxa de blastocisto (AF=29,4%; BF= 16,0%; p<0,0001), e a taxa de desenvolvimento embrionário (AF=33,9 % BF= 18,9%; p<0,0001) foram maiores no grupo de alta fertilidade. No estágio de oito células, 30 transcritos foram diferencialmente representados entre os grupos experimentais (p<0,10). Apenas PGK1, PPIA e TFAM tiveram maior representação no grupo de alta fertilidade. Genes relacionados a estresse embrionário (9/27, 33%), proliferação celular (8/27, 30 %), metabolismo lipídico (6/27, 22%), e outras funções celulares (4/27, 15%) foram mais representados no grupo de baixa fertilidade. Blastocistos apresentaram apenas 12 genes diferencialmente representados (p<0,10), sendo apenas ACSL3, ELOV1, IFNT mais representados no grupo de alta fertilidade. Não foram encontradas diferenças entre os grupos na contagem de células totais, fragmentação de DNA ou porcentagem de blastocistos GI (p<0,05). Os resultados demonstraram que mesmo não sendo observados efeitos paternos na cinética embrionária inicial, a fertilidade in vitro dos touros influencia a abundância de transcritos no estágio de oito células e blastocisto, sendo desde último, em menor proporção. Um aumento da representação de genes relacionados a estresse oxidativo e apoptose no momento de AGE sugere que o desenvolvimento do embrião é prejudicado no grupo de baixa fertilidade, consequentemente resultando em uma menor taxa de blastocistos. / The use of different sires influences in vitro embryo production (IVP) outcome. Paternal effects are observed from the first cleavages until after embryonic genome activation (EGA). Little is known about the mechanisms that promote in vitro fertility differences, even less about the consequences on embryo development. Therefore, the objective of the present work was to identify divergence moment between embryos from high and low fertility bulls and identify the causes for this divergency. For that, ten bulls were retrospectively selected in high (HF; n=5) and low (LF; n=5) in vitro fertility from a database of approximately 140 bulls used in commercial IVP ranked based on embryo development rate (blastocyst/cleaved rate). IVP embryos from 5 manipulations were classified by their stage of development (2 cell, 3-4 cell, 6 cell, 8 cell), at 24, 36, 48, 60, 72 hpi, to evaluate embryo kinetics. Pronuclei were evaluated 24 hpi, cleavage rate was assessed on day 3 (D3) of in vitro culture, development rate and blastocyst rate (Grade I and II) were assessed on day 7 (D7). Abundance of 96 transcripts was analyzed in embryos at 8-cell stage and blastocysts from each bull and each manipulation. Total cell counting, and DNA fragmentation were assessed on blastocysts as well. There was no difference in early embryo kinetics (p>0.05), and cleavage rate (HF=86.7%; LF= 84.9%; p= 0.25). However, fertilization rate was higher on high fertility group (72%) than low fertility (62%) and polyspermy rate was lower on high fertility compared to low fertility group (HF:16,2% LF:29,2%). As expected, blastocyst rate (HF=29.4%; LF= 16.0%; p<0.0001) and development rate (HF=33.9 % LF= 18.9%; p<0.0001) were higher in the high fertility group than in the low fertility. At 8 cell stage, 30 transcripts were differentially represented (p<0.10) between the two groups. Only PGK1, PPIA and TFAM levels were higher in high fertility group. Stress related genes (9/27, 33%), cell proliferation (8/27, 30 %), lipid metabolism genes (6/27, 22%), and other cellular functions (4/27, 15%) were highly expressed on low fertility embryos. Blastocysts had only 12 differentially represented transcripts (plt;0.10); only ACSL3, ELOV1 and IFNT were higher in high fertility. Lipid metabolism genes (3/9, 33%) and other cellular functions (6/9, 67%) were higher in low fertility group. Results demonstrate that although there was no paternal effect on early in vitro embryo kinetics, sire in vitro fertility influences the content of transcripts at 8-cell stage and at blastocyst stage, but at a lower extent. An increase in apoptotic and oxidative stress genes at EGA stage suggest that embryo development is impaired in LF group causing reduction of blastocyst rate.