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The objectives of this thesis were to investigate some physiological, cellular and molecular changes from genetic selection, flock age and egg storage on embryonic metabolism, cell viability and gene expression in poultry species. Embryonic heat production (EHP), the parameter used to evaluate metabolic status of two turkey genetic strains (Nicholas and Hybrid) and four flock ages (30 wk, 34 wk, 55 wk, 60 wk) were determined. The results showed that embryos of older flocks had higher EHP than all other flock ages. The higher metabolism can cause overheating in embryos from older flocks during the later part of incubation. The EHP values can assist incubator manufacturers and hatchery managers to manage incubation temperatures to increase embryo survival. The EHP was also determined in two Ross 308 broiler breeder egg storage durations (4 d and 14 d) to assess the impact of long-term egg storage on embryonic metabolism. The embryos from 4 d stored eggs had higher body weight and EHP than embryos from 14 d stored eggs. To investigate what could be the fundamental reasons for the metabolic differences, blastoderms from eggs in these egg storage treatments were isolated, dissociated into single cells, stained with fluorescent dyes and subjected to flow cytometry analysis to differentiate between viable (live), apoptotic and necrotic cell populations. Quantitative real time PCR analysis was then used to compare the expression of selected apoptotic genes (Bak, Bax, Bok, Bcl-2, Bcl-xL) in blastoderms and embryos from 6 d incubated eggs. While percentage of viable cells decreased significantly, an unregulated amount of apoptosis increased with egg storage duration (p < 0.0001). Expression of pro-apoptotic genes (Bak, Bax, and Bok) were up regulated as storage duration increased at the blastodermal level but all genes were down regulated after 6 d of incubation. This suggests that an increment in egg storage duration can cause activation of apoptotic cell death mechanisms at the blastodermal level, which can be one of the molecular mechanisms that led to the reduced daily embryonic growth and metabolism observed in 14 d stored eggs. The thesis suggests there are molecular and cellular implications of egg storage. / Animal Science

Orientador: Vera Fernanda Martins Hossepian de Lima / Coorientador: Alfonso Gutiérrez Ádan / Banca: Simone Cristina Méo Niciura / Banca Beatriz da Costa Aguiar Alves Reis / Banca: Flávia Lombardi Lopes / Banca: Janete Apparecida Desidério / Resumo: O objetivo do presente estudo foi verificar se existem diferenças no desenvolvimento de embriões produzidos com sêmen sexado por centrifugação em gradiente de densidade e por citometria de fluxo e também quantificar a expressão relativa de genes importantes para o desenvolvimento embrionário. Após a sexagem os espermatozóides foram submetidos a produção de embriões in vitro. Foram avaliadas as taxas de clivagem e blastocisto para verificar a influência do método de sexagem no desenvolvimento in vitro de embriões. Os blastocistos foram coletados nos dias 7 e 8 de desenvolvimento, e submetidos a extração de RNA para a avaliação da expressão de genes relacionados a qualidade do embrião: AKR1B1, COX2, IGF2R, PLAC8 (desenvolvimento de placenta e reconhecimento da gestação), MnSOD e GPX1 (estresse oxidativo), SCL2A1 (metabolismo) e TP53 (apoptose). Os resultados não mostraram diferenças no desenvolvimento in vitro de embriões (taxas de clivagem e blastocisto) produzidos com sêmen sexado. Em relação ao padrão de expressão, a citometria de fluxo reduz os níveis de mRNA dos genes AKR1B1(P=0,023), COX2 (P=0,016). A centrifugação em gradiente de densidade aumentou os níveis de transcritos dos genes PLAC8 (P=0,007), MnSOD (P=0,013) e GLUT1 (P=0,028). Ambas as técnicas reduzem os níveis de expressão do gene TP53 (P<0,05). A técnica de sexagem por citometria de fluxo altera a expressão de genes envolvidos no processo de implantação, prejudicando o nascimento de uma cria viável. A sexagem produz embriões que não possuem alterações prejudiciais em genes envolvidos no reconhecimento da gestação e formação da placenta, os quais são muito importantes para o processo de implantação; aumenta o padrão de expressão dos genes envolvidos no processo de resposta da célula ao estresse... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The purpose of this work was evaluate differences on development of embryos produced in vitro using sorted semen by density gradient centrifugation and flow cytometry, and differences in relative abundance of important genes for embryo development. Cleavage and blastocyst rates were used to evaluate the influence of the sorting procedure on embryo development. Blastocysts of day 7 and 8 of development were collected, and expression levels quantification AKR1B1, COX2, IGF2R, PLAC8, MnSOD, GPX1, SCL2A1 and TP53, genes related to embryo quality were evaluated. The results showed no differences between the experimental groups in terms of embryo development (cleavage and blastocyst rates). In the expression pattern, flow citometry methodology reduced mRNA abundance of AKR1B1 (P=0.023) and COX2 (P=0.016). Density gradient centrifugation increased the transcripts levels of PLAC8 (P=0.007), MnSOD (P=0.013) and GLUT1 (P=0.028). Both sorting process reduced mRNA of TP53 (P<0.05). Flow citometry affects the expression pattern of genes involved in pregnancy recognition and placenta formation, resulting in poor quality embryo. Density gradient centrifugation methodology do not alter the expression of genes involved in embryo implantation, increases the expression pattern of genes related to oxidative response and metabolism, resulting in viable embryos. These results suggesting that density gradient centrifugation can be an alternative to flow citometry, for produce viable embryos / Doutor

Introdução. A fertilização in vitro (FIV) é uma opção de tratamento para pacientes inférteis com endometriose (EDT), e a escolha dos embriões a serem transferidos é um passo fundamental para o sucesso do processo. A endometriose é capaz de interferir em todas as etapas do processo de FIV, a qual pode estar associada à foliculogênese anormal, a defeitos de implantação e à qualidade oocitária inferior, bem como a alterações na receptividade endometrial. Em estágios mais severos da doença, pode-se observar um importante substrato anatômico associado. O Escore de Graduação Embrionário (GES) é uma classificação baseada numa combinação da morfologia pronuclear, clivagem precoce e morfologia no terceiro dia após a fertilização que permite avaliar quais embriões terão maiores chances de implantação/gestação. Ainda não há, na literatura, relatos de comparação do GES com pacientes portadoras de endometriose. Objetivo. Determinar o escore de graduação embrionário médio entre as pacientes inférteis com endometriose submetidas à fertilização in vitro e comparar com pacientes inférteis sem endometriose. Métodos. Foram comparados, através de uma coorte prospectiva, 706 embriões (162 pacientes), sendo 472 embriões pertencentes às pacientes do grupo controle sem endometriose (n=109; infertilidade tubária ou por fator masculino) e 234 embriões de pacientes com endometriose (n=53). Todas as pacientes foram submetidas à fertilização in vitro, utilizando o protocolo de indução da ovulação com antagonista do GnRH. Todos os embriões foram transferidos no dia 3 após fertilização. O escore de graduação embrionário (GES) foi realizado através de avaliação de todos os embriões por 3 vezes, nos tempos: 16 – 18 horas, 25 – 27 horas e 64 – 67 horas, sempre pelo mesmo embriologista. Para pontuação do GES, avaliaram-se: citoplasma, morfologia pronuclear, fragmentação, alinhamento nucleolar, posição do corpo polar, número de blastômeros/morfologia e simetria. Consideramos escore médio a soma dos escores embrionários dividida pelo número de embriões obtidos; e o escore embrionário médio transferido como a soma dos GES dividido pelo número de embriões transferidos. Foi considerado estatisticamente significativo quando P < 0,05 utilizando-se os testes t Student e qui-quadrado. Resultados. Os grupos foram comparados quanto à idade, índice de massa corporal, perfil obstétrico (infertilidade primária, secundária, paridade, abortamentos) e perfil hormonal, não sendo encontrada diferença estatisticamente significativa. Apesar de o número de embriões transferidos ser maior em pacientes com endometriose quando comparadas ao grupo controle (2,38 ± 0,66 versus 2,15 ± 0,54, respectivamente; P=0,001), não se observou diferença no escore de graduação embrionário médio entre os grupos de estudo e controle (71 ± 19,8 versus 71,9 ± 23,5, respectivamente; P=0,881). Quanto às taxas de fertilização, houve semelhança entre os grupos, correspondendo a 61% nas pacientes com endometriose e 59% naquelas do grupo controle (P=0,511). Também não houve diferença estatisticamente significativa quando os grupos foram comparados quanto às taxas de implantação (21% versus 22%, respectivamente; P=0,989) e gestação (26,4% versus 28,4%, respectivamente; P=0,989). Para estes parâmetros de avaliação, os diferentes graus de severidade da endometriose não interferiram significativamente nos resultados. Conclusão. A presença de endometriose não impactou significativamente na qualidade embrionária. Da mesma forma, não foram observadas diferenças nos desfechos reprodutivos avaliados entre pacientes inférteis com e sem endometriose. / Objective. To determine embryo quality (Mean Graduated Embryo Score, MGES) in infertile patients with endometriosis submitted to in vitro fertilization (IVF-ET). Design. Prospective cohort. Setting. Private Human Reproduction Center. Patients. We compared 706 embryos (162 patients) divided in two groups: 472 embryos derived from patients without endometriosis (n=109, infertile patients with tubal or male infertility) and 234 embryos from patients in study group (n=53, infertile patients with endometriosis). Interventions. All patients were submitted to IVF using an estradiol-antagonist-recombinant FSH protocol for ovarian stimulation. MGES was performed evaluating all embryos three times: 16 – 18 hours, 25 – 27 hours and 64 – 67 hours, by the same embryologist. Embryo evaluation was performed according to the following parameters: fragmentation, nucleolar alignment, polar body apposition, blastomere number/morphology and symmetry. Main Outcome Measures. MGES scores, fertilization, implantation and pregnancy rates. Results. Groups were compared for age, body mass index (BMI), past ob/gyn characteristics (primary or secondary infertility, parity, abortions) and hormonal profile. Although the number of embryos transferred was greater in patients with endometriosis than in the control group (2.38 ± 0.66 versus 2.15 ± 0.54, respectively; P = 0.001), the MGES was similar in both groups (71 ± 19.8 versus 71.9 ± 23.5, respectively; P = 0.881). Likewise, fertilization rate was similar in groups, 61% in patients with endometriosis and 59% in control group (P=0,511). Moreover, no significant differences were found in implantation rates (21% versus 22%, respectively [P=0,989]) and in pregnancy rates (26,4% versus 28,4%, respectively [P=0,989]). The severity of endometriosis did not influence the results. Conclusions. Embryo quality measured by MGES was not influenced by endometriosis. Likewise, the reproductive outcomes evaluated were similar between infertile patients with and without endometriosis.

Introdução: A taxa da prevalência da infertilidade em casais com idade reprodutiva atinge 8-10%. A fim de tentar contornar esse problema, esses casais optam pela reprodução assistida. Em muitos dos casos, os resultados das técnicas de reprodução assistida (TRA) são bem sucedidos ao realizarem a fertilização in vitro (FIV), em outros não são satisfatórios ou ocorrem gestações múltiplas que aumenta o risco de morbidade a essas gestantes. Diante deste quadro, estudam-se formas de aperfeiçoar as TRA no que se refere à seleção do embrião. O hormônio anti-Mülleriano (AMH) já desempenha este papel ao refletir a reserva ovariana na rotina das clínicas de FIV. Os antígenos leucocitários humanos-G solúveis (sHLA-G) vêm sendo investigado no seu papel em refletir a qualidade embrionária. A existência da associação entre as concentrações de HLA-G mensuradas em fluido folicular e a qualidade embrionária avaliada pelo critério de pontuação Graduated Embryo Score (GES) poderia caracterizar o sHLA-G como um possível biomarcador de qualidade embrionária. Objetivos: Investigar a associação entre as concentrações do sHLA-G no fluido folicular (FF) e a pontuação dos embriões gerados avaliados pelo critério GES em ciclos de mulheres submetidas à fertilização in vitro (FIV). Métodos: Um estudo transversal foi realizado. Avaliaram-se setenta e três mulheres com idade ≤ 39 anos, submetidas à FIV pelas seguintes causas: fator tubário, fator masculino e/ou endometriose, com ambos os ovários e níveis hormonais de TSH, FSH e PRL dentro dos valores de referência. Não foram elegíveis ao estudo mulheres com síndrome de hiperestimulação ovariana no ciclo avaliado, com doença auto-imune, com síndrome dos ovários policísticos, com luteinização precoce e/ou endometrioma. Realizou-se a mensuração de sHLA-G por ELISA no FF de um pool de folículos puncionados das mulheres submetidas à indução de ovulação para a FIV. Os embriões obtidos após fertilização foram classificados segundo o critério GES. As outras variáveis necessárias foram transcritas dos prontuários das pacientes participantes no estudo. Resultados: A associação entre as concentrações de sHLA-G e o escore médio dos embriões gerados não foi observada. Observou-se uma sensibilidade aumentada do teste ELISA, quando comprada aos estudos da literatura, com detecção em mais de 98% das amostras analisadas. Foi encontrada uma associação significativa entre o AMH e a idade (r=-0,38; p=0,003), entre AMH e total de oócitos ( r=0,53; p<0,05) e idade e total de oócitos (r= -0,31, p=0,009). A mensuração de sHLA-G em mulheres com endometriose e sem endometriose (fator tubário e masculino) não mostrou diferença significativa (p=0,57). Conclusão: Não houve associação entre a qualidade embrionária e dosagens de sHLA-G. Diante destes resultados, ainda está controverso o uso de sHLA-G mensurado em FF como marcador prognóstico de qualidade de embrião embrionária avaliada pelo critério GES. Os resultados encontrados referentes ao AMH corroboram com a literatura. / Background: The prevalence of infertility rate in the couples in reproductive age reaches 8-10%. In order to solve this problem, these couples opt for assisted reproduction. In many cases, the results of assisted reproduction techniques (ART) are successful in performing the in vitro fertilization (IVF), while in others they are not satisfactory or occur multiple pregnancy that increase morbidity risk to these pregnant women. In this context, several studies attempt new forms for to improve the ART in the selection the embryo. The anti-Müllerian hormone (AMH) already plays this role to reflect the ovarian reserve in IVF clinics routine. Soluble human leukocyte antigen-G (sHLA-G) has been investigated its role to reflect the embryo quality. The existence of the association between the sHLA-G concentrations measured in follicular fluid and embryo quality based on Graduated Embryo Score (GES) criteria could characterize the sHLA-G as a possible biomarker of embryo quality. Objectives: Our study investigated the association between the sHLA-G concentrations in follicular fluid (FF) and the score of embryo evaluated by Graduated Embryo Score (GES) criteria in women cycles treated by in vitro fertilization (IVF). Methods: A cross-sectional study was conducted. Evaluated a total of seventy-three women aged ≤ 39 years, undergoing IVF because of tubal factor, male factor and / or endometriosis, with both ovaries and hormone levels of TSH, FSH and PRL within the range of reference. It was not eligible to study women with ovarian hyperstimulation syndrome in the evaluated cycle, autoimmune disease, polycystic ovary syndrome, with early luteinization and / or endometrioma. In this study was measured the sHLA-G by ELISA in FF from a pool of follicles punctured of women undergoing ovulation induction for IVF. The embryos after fertilization were classified by GES criteria. The other study variables were transcribed from medical records of patients. Results: The association between concentrations of sHLA-G and the average score of the generated embryos was not observed. Sensitivity of the ELISA was observed with detection by more than 98% of the samples. Significant association was found between AMH and age (r = -0.38; p = 0.003), between AMH and total oocytes (r = 0.53; p <0.05) and age and total oocytes (r = -0.31, p = 0.009). The results of sHLA-G in women with endometriosis and without endometriosis (tubal and male factor) showed no significant difference (p = 0.57). Conclusion: There was no association between embryo quality and the dosages of sHLA-G. Considering these results, the use of sHLA-G measured in FF as a prognostic marker of quality embryo based on GES criteria is still controversial. The results for the AMH corroborate with the literature.

Introdução. A fertilização in vitro (FIV) é uma opção de tratamento para pacientes inférteis com endometriose (EDT), e a escolha dos embriões a serem transferidos é um passo fundamental para o sucesso do processo. A endometriose é capaz de interferir em todas as etapas do processo de FIV, a qual pode estar associada à foliculogênese anormal, a defeitos de implantação e à qualidade oocitária inferior, bem como a alterações na receptividade endometrial. Em estágios mais severos da doença, pode-se observar um importante substrato anatômico associado. O Escore de Graduação Embrionário (GES) é uma classificação baseada numa combinação da morfologia pronuclear, clivagem precoce e morfologia no terceiro dia após a fertilização que permite avaliar quais embriões terão maiores chances de implantação/gestação. Ainda não há, na literatura, relatos de comparação do GES com pacientes portadoras de endometriose. Objetivo. Determinar o escore de graduação embrionário médio entre as pacientes inférteis com endometriose submetidas à fertilização in vitro e comparar com pacientes inférteis sem endometriose. Métodos. Foram comparados, através de uma coorte prospectiva, 706 embriões (162 pacientes), sendo 472 embriões pertencentes às pacientes do grupo controle sem endometriose (n=109; infertilidade tubária ou por fator masculino) e 234 embriões de pacientes com endometriose (n=53). Todas as pacientes foram submetidas à fertilização in vitro, utilizando o protocolo de indução da ovulação com antagonista do GnRH. Todos os embriões foram transferidos no dia 3 após fertilização. O escore de graduação embrionário (GES) foi realizado através de avaliação de todos os embriões por 3 vezes, nos tempos: 16 – 18 horas, 25 – 27 horas e 64 – 67 horas, sempre pelo mesmo embriologista. Para pontuação do GES, avaliaram-se: citoplasma, morfologia pronuclear, fragmentação, alinhamento nucleolar, posição do corpo polar, número de blastômeros/morfologia e simetria. Consideramos escore médio a soma dos escores embrionários dividida pelo número de embriões obtidos; e o escore embrionário médio transferido como a soma dos GES dividido pelo número de embriões transferidos. Foi considerado estatisticamente significativo quando P < 0,05 utilizando-se os testes t Student e qui-quadrado. Resultados. Os grupos foram comparados quanto à idade, índice de massa corporal, perfil obstétrico (infertilidade primária, secundária, paridade, abortamentos) e perfil hormonal, não sendo encontrada diferença estatisticamente significativa. Apesar de o número de embriões transferidos ser maior em pacientes com endometriose quando comparadas ao grupo controle (2,38 ± 0,66 versus 2,15 ± 0,54, respectivamente; P=0,001), não se observou diferença no escore de graduação embrionário médio entre os grupos de estudo e controle (71 ± 19,8 versus 71,9 ± 23,5, respectivamente; P=0,881). Quanto às taxas de fertilização, houve semelhança entre os grupos, correspondendo a 61% nas pacientes com endometriose e 59% naquelas do grupo controle (P=0,511). Também não houve diferença estatisticamente significativa quando os grupos foram comparados quanto às taxas de implantação (21% versus 22%, respectivamente; P=0,989) e gestação (26,4% versus 28,4%, respectivamente; P=0,989). Para estes parâmetros de avaliação, os diferentes graus de severidade da endometriose não interferiram significativamente nos resultados. Conclusão. A presença de endometriose não impactou significativamente na qualidade embrionária. Da mesma forma, não foram observadas diferenças nos desfechos reprodutivos avaliados entre pacientes inférteis com e sem endometriose. / Objective. To determine embryo quality (Mean Graduated Embryo Score, MGES) in infertile patients with endometriosis submitted to in vitro fertilization (IVF-ET). Design. Prospective cohort. Setting. Private Human Reproduction Center. Patients. We compared 706 embryos (162 patients) divided in two groups: 472 embryos derived from patients without endometriosis (n=109, infertile patients with tubal or male infertility) and 234 embryos from patients in study group (n=53, infertile patients with endometriosis). Interventions. All patients were submitted to IVF using an estradiol-antagonist-recombinant FSH protocol for ovarian stimulation. MGES was performed evaluating all embryos three times: 16 – 18 hours, 25 – 27 hours and 64 – 67 hours, by the same embryologist. Embryo evaluation was performed according to the following parameters: fragmentation, nucleolar alignment, polar body apposition, blastomere number/morphology and symmetry. Main Outcome Measures. MGES scores, fertilization, implantation and pregnancy rates. Results. Groups were compared for age, body mass index (BMI), past ob/gyn characteristics (primary or secondary infertility, parity, abortions) and hormonal profile. Although the number of embryos transferred was greater in patients with endometriosis than in the control group (2.38 ± 0.66 versus 2.15 ± 0.54, respectively; P = 0.001), the MGES was similar in both groups (71 ± 19.8 versus 71.9 ± 23.5, respectively; P = 0.881). Likewise, fertilization rate was similar in groups, 61% in patients with endometriosis and 59% in control group (P=0,511). Moreover, no significant differences were found in implantation rates (21% versus 22%, respectively [P=0,989]) and in pregnancy rates (26,4% versus 28,4%, respectively [P=0,989]). The severity of endometriosis did not influence the results. Conclusions. Embryo quality measured by MGES was not influenced by endometriosis. Likewise, the reproductive outcomes evaluated were similar between infertile patients with and without endometriosis.

Introdução: A taxa da prevalência da infertilidade em casais com idade reprodutiva atinge 8-10%. A fim de tentar contornar esse problema, esses casais optam pela reprodução assistida. Em muitos dos casos, os resultados das técnicas de reprodução assistida (TRA) são bem sucedidos ao realizarem a fertilização in vitro (FIV), em outros não são satisfatórios ou ocorrem gestações múltiplas que aumenta o risco de morbidade a essas gestantes. Diante deste quadro, estudam-se formas de aperfeiçoar as TRA no que se refere à seleção do embrião. O hormônio anti-Mülleriano (AMH) já desempenha este papel ao refletir a reserva ovariana na rotina das clínicas de FIV. Os antígenos leucocitários humanos-G solúveis (sHLA-G) vêm sendo investigado no seu papel em refletir a qualidade embrionária. A existência da associação entre as concentrações de HLA-G mensuradas em fluido folicular e a qualidade embrionária avaliada pelo critério de pontuação Graduated Embryo Score (GES) poderia caracterizar o sHLA-G como um possível biomarcador de qualidade embrionária. Objetivos: Investigar a associação entre as concentrações do sHLA-G no fluido folicular (FF) e a pontuação dos embriões gerados avaliados pelo critério GES em ciclos de mulheres submetidas à fertilização in vitro (FIV). Métodos: Um estudo transversal foi realizado. Avaliaram-se setenta e três mulheres com idade ≤ 39 anos, submetidas à FIV pelas seguintes causas: fator tubário, fator masculino e/ou endometriose, com ambos os ovários e níveis hormonais de TSH, FSH e PRL dentro dos valores de referência. Não foram elegíveis ao estudo mulheres com síndrome de hiperestimulação ovariana no ciclo avaliado, com doença auto-imune, com síndrome dos ovários policísticos, com luteinização precoce e/ou endometrioma. Realizou-se a mensuração de sHLA-G por ELISA no FF de um pool de folículos puncionados das mulheres submetidas à indução de ovulação para a FIV. Os embriões obtidos após fertilização foram classificados segundo o critério GES. As outras variáveis necessárias foram transcritas dos prontuários das pacientes participantes no estudo. Resultados: A associação entre as concentrações de sHLA-G e o escore médio dos embriões gerados não foi observada. Observou-se uma sensibilidade aumentada do teste ELISA, quando comprada aos estudos da literatura, com detecção em mais de 98% das amostras analisadas. Foi encontrada uma associação significativa entre o AMH e a idade (r=-0,38; p=0,003), entre AMH e total de oócitos ( r=0,53; p<0,05) e idade e total de oócitos (r= -0,31, p=0,009). A mensuração de sHLA-G em mulheres com endometriose e sem endometriose (fator tubário e masculino) não mostrou diferença significativa (p=0,57). Conclusão: Não houve associação entre a qualidade embrionária e dosagens de sHLA-G. Diante destes resultados, ainda está controverso o uso de sHLA-G mensurado em FF como marcador prognóstico de qualidade de embrião embrionária avaliada pelo critério GES. Os resultados encontrados referentes ao AMH corroboram com a literatura. / Background: The prevalence of infertility rate in the couples in reproductive age reaches 8-10%. In order to solve this problem, these couples opt for assisted reproduction. In many cases, the results of assisted reproduction techniques (ART) are successful in performing the in vitro fertilization (IVF), while in others they are not satisfactory or occur multiple pregnancy that increase morbidity risk to these pregnant women. In this context, several studies attempt new forms for to improve the ART in the selection the embryo. The anti-Müllerian hormone (AMH) already plays this role to reflect the ovarian reserve in IVF clinics routine. Soluble human leukocyte antigen-G (sHLA-G) has been investigated its role to reflect the embryo quality. The existence of the association between the sHLA-G concentrations measured in follicular fluid and embryo quality based on Graduated Embryo Score (GES) criteria could characterize the sHLA-G as a possible biomarker of embryo quality. Objectives: Our study investigated the association between the sHLA-G concentrations in follicular fluid (FF) and the score of embryo evaluated by Graduated Embryo Score (GES) criteria in women cycles treated by in vitro fertilization (IVF). Methods: A cross-sectional study was conducted. Evaluated a total of seventy-three women aged ≤ 39 years, undergoing IVF because of tubal factor, male factor and / or endometriosis, with both ovaries and hormone levels of TSH, FSH and PRL within the range of reference. It was not eligible to study women with ovarian hyperstimulation syndrome in the evaluated cycle, autoimmune disease, polycystic ovary syndrome, with early luteinization and / or endometrioma. In this study was measured the sHLA-G by ELISA in FF from a pool of follicles punctured of women undergoing ovulation induction for IVF. The embryos after fertilization were classified by GES criteria. The other study variables were transcribed from medical records of patients. Results: The association between concentrations of sHLA-G and the average score of the generated embryos was not observed. Sensitivity of the ELISA was observed with detection by more than 98% of the samples. Significant association was found between AMH and age (r = -0.38; p = 0.003), between AMH and total oocytes (r = 0.53; p <0.05) and age and total oocytes (r = -0.31, p = 0.009). The results of sHLA-G in women with endometriosis and without endometriosis (tubal and male factor) showed no significant difference (p = 0.57). Conclusion: There was no association between embryo quality and the dosages of sHLA-G. Considering these results, the use of sHLA-G measured in FF as a prognostic marker of quality embryo based on GES criteria is still controversial. The results for the AMH corroborate with the literature.

Introdução: A taxa da prevalência da infertilidade em casais com idade reprodutiva atinge 8-10%. A fim de tentar contornar esse problema, esses casais optam pela reprodução assistida. Em muitos dos casos, os resultados das técnicas de reprodução assistida (TRA) são bem sucedidos ao realizarem a fertilização in vitro (FIV), em outros não são satisfatórios ou ocorrem gestações múltiplas que aumenta o risco de morbidade a essas gestantes. Diante deste quadro, estudam-se formas de aperfeiçoar as TRA no que se refere à seleção do embrião. O hormônio anti-Mülleriano (AMH) já desempenha este papel ao refletir a reserva ovariana na rotina das clínicas de FIV. Os antígenos leucocitários humanos-G solúveis (sHLA-G) vêm sendo investigado no seu papel em refletir a qualidade embrionária. A existência da associação entre as concentrações de HLA-G mensuradas em fluido folicular e a qualidade embrionária avaliada pelo critério de pontuação Graduated Embryo Score (GES) poderia caracterizar o sHLA-G como um possível biomarcador de qualidade embrionária. Objetivos: Investigar a associação entre as concentrações do sHLA-G no fluido folicular (FF) e a pontuação dos embriões gerados avaliados pelo critério GES em ciclos de mulheres submetidas à fertilização in vitro (FIV). Métodos: Um estudo transversal foi realizado. Avaliaram-se setenta e três mulheres com idade ≤ 39 anos, submetidas à FIV pelas seguintes causas: fator tubário, fator masculino e/ou endometriose, com ambos os ovários e níveis hormonais de TSH, FSH e PRL dentro dos valores de referência. Não foram elegíveis ao estudo mulheres com síndrome de hiperestimulação ovariana no ciclo avaliado, com doença auto-imune, com síndrome dos ovários policísticos, com luteinização precoce e/ou endometrioma. Realizou-se a mensuração de sHLA-G por ELISA no FF de um pool de folículos puncionados das mulheres submetidas à indução de ovulação para a FIV. Os embriões obtidos após fertilização foram classificados segundo o critério GES. As outras variáveis necessárias foram transcritas dos prontuários das pacientes participantes no estudo. Resultados: A associação entre as concentrações de sHLA-G e o escore médio dos embriões gerados não foi observada. Observou-se uma sensibilidade aumentada do teste ELISA, quando comprada aos estudos da literatura, com detecção em mais de 98% das amostras analisadas. Foi encontrada uma associação significativa entre o AMH e a idade (r=-0,38; p=0,003), entre AMH e total de oócitos ( r=0,53; p<0,05) e idade e total de oócitos (r= -0,31, p=0,009). A mensuração de sHLA-G em mulheres com endometriose e sem endometriose (fator tubário e masculino) não mostrou diferença significativa (p=0,57). Conclusão: Não houve associação entre a qualidade embrionária e dosagens de sHLA-G. Diante destes resultados, ainda está controverso o uso de sHLA-G mensurado em FF como marcador prognóstico de qualidade de embrião embrionária avaliada pelo critério GES. Os resultados encontrados referentes ao AMH corroboram com a literatura. / Background: The prevalence of infertility rate in the couples in reproductive age reaches 8-10%. In order to solve this problem, these couples opt for assisted reproduction. In many cases, the results of assisted reproduction techniques (ART) are successful in performing the in vitro fertilization (IVF), while in others they are not satisfactory or occur multiple pregnancy that increase morbidity risk to these pregnant women. In this context, several studies attempt new forms for to improve the ART in the selection the embryo. The anti-Müllerian hormone (AMH) already plays this role to reflect the ovarian reserve in IVF clinics routine. Soluble human leukocyte antigen-G (sHLA-G) has been investigated its role to reflect the embryo quality. The existence of the association between the sHLA-G concentrations measured in follicular fluid and embryo quality based on Graduated Embryo Score (GES) criteria could characterize the sHLA-G as a possible biomarker of embryo quality. Objectives: Our study investigated the association between the sHLA-G concentrations in follicular fluid (FF) and the score of embryo evaluated by Graduated Embryo Score (GES) criteria in women cycles treated by in vitro fertilization (IVF). Methods: A cross-sectional study was conducted. Evaluated a total of seventy-three women aged ≤ 39 years, undergoing IVF because of tubal factor, male factor and / or endometriosis, with both ovaries and hormone levels of TSH, FSH and PRL within the range of reference. It was not eligible to study women with ovarian hyperstimulation syndrome in the evaluated cycle, autoimmune disease, polycystic ovary syndrome, with early luteinization and / or endometrioma. In this study was measured the sHLA-G by ELISA in FF from a pool of follicles punctured of women undergoing ovulation induction for IVF. The embryos after fertilization were classified by GES criteria. The other study variables were transcribed from medical records of patients. Results: The association between concentrations of sHLA-G and the average score of the generated embryos was not observed. Sensitivity of the ELISA was observed with detection by more than 98% of the samples. Significant association was found between AMH and age (r = -0.38; p = 0.003), between AMH and total oocytes (r = 0.53; p <0.05) and age and total oocytes (r = -0.31, p = 0.009). The results of sHLA-G in women with endometriosis and without endometriosis (tubal and male factor) showed no significant difference (p = 0.57). Conclusion: There was no association between embryo quality and the dosages of sHLA-G. Considering these results, the use of sHLA-G measured in FF as a prognostic marker of quality embryo based on GES criteria is still controversial. The results for the AMH corroborate with the literature.

Introdução. A fertilização in vitro (FIV) é uma opção de tratamento para pacientes inférteis com endometriose (EDT), e a escolha dos embriões a serem transferidos é um passo fundamental para o sucesso do processo. A endometriose é capaz de interferir em todas as etapas do processo de FIV, a qual pode estar associada à foliculogênese anormal, a defeitos de implantação e à qualidade oocitária inferior, bem como a alterações na receptividade endometrial. Em estágios mais severos da doença, pode-se observar um importante substrato anatômico associado. O Escore de Graduação Embrionário (GES) é uma classificação baseada numa combinação da morfologia pronuclear, clivagem precoce e morfologia no terceiro dia após a fertilização que permite avaliar quais embriões terão maiores chances de implantação/gestação. Ainda não há, na literatura, relatos de comparação do GES com pacientes portadoras de endometriose. Objetivo. Determinar o escore de graduação embrionário médio entre as pacientes inférteis com endometriose submetidas à fertilização in vitro e comparar com pacientes inférteis sem endometriose. Métodos. Foram comparados, através de uma coorte prospectiva, 706 embriões (162 pacientes), sendo 472 embriões pertencentes às pacientes do grupo controle sem endometriose (n=109; infertilidade tubária ou por fator masculino) e 234 embriões de pacientes com endometriose (n=53). Todas as pacientes foram submetidas à fertilização in vitro, utilizando o protocolo de indução da ovulação com antagonista do GnRH. Todos os embriões foram transferidos no dia 3 após fertilização. O escore de graduação embrionário (GES) foi realizado através de avaliação de todos os embriões por 3 vezes, nos tempos: 16 – 18 horas, 25 – 27 horas e 64 – 67 horas, sempre pelo mesmo embriologista. Para pontuação do GES, avaliaram-se: citoplasma, morfologia pronuclear, fragmentação, alinhamento nucleolar, posição do corpo polar, número de blastômeros/morfologia e simetria. Consideramos escore médio a soma dos escores embrionários dividida pelo número de embriões obtidos; e o escore embrionário médio transferido como a soma dos GES dividido pelo número de embriões transferidos. Foi considerado estatisticamente significativo quando P < 0,05 utilizando-se os testes t Student e qui-quadrado. Resultados. Os grupos foram comparados quanto à idade, índice de massa corporal, perfil obstétrico (infertilidade primária, secundária, paridade, abortamentos) e perfil hormonal, não sendo encontrada diferença estatisticamente significativa. Apesar de o número de embriões transferidos ser maior em pacientes com endometriose quando comparadas ao grupo controle (2,38 ± 0,66 versus 2,15 ± 0,54, respectivamente; P=0,001), não se observou diferença no escore de graduação embrionário médio entre os grupos de estudo e controle (71 ± 19,8 versus 71,9 ± 23,5, respectivamente; P=0,881). Quanto às taxas de fertilização, houve semelhança entre os grupos, correspondendo a 61% nas pacientes com endometriose e 59% naquelas do grupo controle (P=0,511). Também não houve diferença estatisticamente significativa quando os grupos foram comparados quanto às taxas de implantação (21% versus 22%, respectivamente; P=0,989) e gestação (26,4% versus 28,4%, respectivamente; P=0,989). Para estes parâmetros de avaliação, os diferentes graus de severidade da endometriose não interferiram significativamente nos resultados. Conclusão. A presença de endometriose não impactou significativamente na qualidade embrionária. Da mesma forma, não foram observadas diferenças nos desfechos reprodutivos avaliados entre pacientes inférteis com e sem endometriose. / Objective. To determine embryo quality (Mean Graduated Embryo Score, MGES) in infertile patients with endometriosis submitted to in vitro fertilization (IVF-ET). Design. Prospective cohort. Setting. Private Human Reproduction Center. Patients. We compared 706 embryos (162 patients) divided in two groups: 472 embryos derived from patients without endometriosis (n=109, infertile patients with tubal or male infertility) and 234 embryos from patients in study group (n=53, infertile patients with endometriosis). Interventions. All patients were submitted to IVF using an estradiol-antagonist-recombinant FSH protocol for ovarian stimulation. MGES was performed evaluating all embryos three times: 16 – 18 hours, 25 – 27 hours and 64 – 67 hours, by the same embryologist. Embryo evaluation was performed according to the following parameters: fragmentation, nucleolar alignment, polar body apposition, blastomere number/morphology and symmetry. Main Outcome Measures. MGES scores, fertilization, implantation and pregnancy rates. Results. Groups were compared for age, body mass index (BMI), past ob/gyn characteristics (primary or secondary infertility, parity, abortions) and hormonal profile. Although the number of embryos transferred was greater in patients with endometriosis than in the control group (2.38 ± 0.66 versus 2.15 ± 0.54, respectively; P = 0.001), the MGES was similar in both groups (71 ± 19.8 versus 71.9 ± 23.5, respectively; P = 0.881). Likewise, fertilization rate was similar in groups, 61% in patients with endometriosis and 59% in control group (P=0,511). Moreover, no significant differences were found in implantation rates (21% versus 22%, respectively [P=0,989]) and in pregnancy rates (26,4% versus 28,4%, respectively [P=0,989]). The severity of endometriosis did not influence the results. Conclusions. Embryo quality measured by MGES was not influenced by endometriosis. Likewise, the reproductive outcomes evaluated were similar between infertile patients with and without endometriosis.

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Metodologias que utilizam whole genome amplification (WGA) vêm sendo desenvolvidas. Utilizando este método é possível gerar microgramas de DNA partindo de pequenas quantidades de DNA. Então, o objetivo deste estudo foi avaliar o desenvolvimento de embriões bovinos submetidos à biópsia nos estádios de 8-16 células e o uso da técnica de amplificação de todo o genoma nos blastômeros retirados, para posterior identificação do sexo através do PCR. Um grupo de 706 complexos cumulus-ovócitos (CCOs) de bovinos foram maturados e fertilizados in vitro, em estufa incubadora a 38,8 °C, 95% de umidade e 5% de CO2. Os prováveis zigotos foram semi-desnudados e cultivados no meio CR2aa sob as mesmas condições da fertilização. No quarto dia após a fertilização, embriões bovinos com 8-16 células foram aleatoriamnte distribuídos entre dois grupos: controle (n=103) e biópsia (n=92). O número de células removidas correspondeu à quarta parte do embrião. Os blastômeros retirados foram submetidos à amplificação de todo o genoma seguido por PCR. Os embriões retornaram ao meio de cultivo para avaliação do desenvolvimento embrionário. Avaliou-se pelo teste do qui-quadrado a produção de blastocisto no oitavo dia de cultivo, a taxa de eclosão no décimo dia de cultivo, a eficiência da amplificação de todo o genoma e da identificação do sexo nos blastômeros removidos. O número de células embrionárias foi analisado por análise de variância ANOVA (Instituto SAS, Inc., Cary, NC, USA). A proporção de blastocisto no oitavo dia de cultivo foi avaliada pelo teste de Wilcoxon. Diferenças foram consideradas significantes se P<0,05. Um total de 92 embriões bovinos foi utilizado para realização da técnica de biópsia e apresentaram produção de blastocisto de 53,3%, com 44,9% de taxa de eclosão. Essas taxas foram semelhantes (P>0,05) às dos 103 embriões do grupo controle (66,0% e 42,6%, respectivamente). Não houve variação no número de células embrionárias entre os grupos e também não ocorreu diferença na proporção de blastocisto entre os grupos controle e biópsia no oitavo dia de cultivo (P>0,05). Os blastômeros retirados foram submetidos à amplificação de todo o genoma, com 98,2% de eficiência. Entretanto, só foi possível identificar o sexo em 59% das amostras. Conclui-se que a técnica de biópsia realizada em embriões bovinos de 816 células não afetou o desenvolvimento embrionário subseqüente nem a qualidade embrionária dos embriões. A utilização do kit de amplificação de todo o genoma mostrou-se eficiente nos blastômeros retirados, sendo possível identificar o sexo em mais da metade dos embriões. . / The impact of biopsy technique on posterior embryo development is still poorly studied and there is no single universally practiced protocol for implementing PGD. Another thing to consider is the small amount of genomic DNA available to perform the genetic study, due to the reduced number of cells obtained from the biopsy. Alternatively, methodologies using whole genome amplification (WGA) have been developed. Using these methods, it is possible to generate microgram quantities of DNA starting with a little genomic DNA. The aim of this study was to evaluate the effect of biopsy at 8-to 16-cell bovine embryos on subsequent development and WGA on removed blastomeres. A group of 706 complexes cumulus oocytes (CCOs) obtained from local slaughterhouse ovaries were matured and fertilized in vitro, in incubator at 38.8°C with 95% humidified air and 5% of CO2. The zygotes were semidenuded and cultured in CR2aa medium under the same conditions as with in vitro fertilization. On the fourth day after fertilization the 8-to 16-cell embryos were distributed randomly across two groups: control (n=103) and biopsy (n=92). The amount of cells removed cells was one-fourth the embryo of blastomeres. The removed blastomeres were submitted to whole genome amplification (WGA) followed by PCR. The embryos were returned to culture for development evaluation. The chisquare test was used for statistic evaluation of the results of blastocyst rate on the eight day after fertilization and hatching rate on tenth day between biopsy and control group, to test the WGA efficiency and to determine the sex proportion of biopsied samples submitted to PCR. The number of cell per embryo was analyzed by ANOVA with SAS (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA). The blastocyst proportion was evaluated with Wilcoxon test. Differences were considered significant if P<0.05. A total of 92 embryos were submitted to biopsy technique. The blastocyst production was 53.3%, with 44.9% of hatching rate. This rate was similar to control group (66.0% and 42.6%) found on 103 embryos. Overall, no impact was detected on embryo quality in blastocyst cell number between the two groups. The proportion of blastocyst in different stages of development on the 8th day did not differ among groups (P>0.05). Removed blastomeres were submitted to WGA, resulting in 98.2% of efficiency. However, only 59% of samples were sexed by PCR. In conclusion biopsy of 8-to 16-cell bovine embryos did not affect subsequent development. WGA was successful in removed blastomeres and was possible to determinate the sex in the samples.