Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-10-13T11:36:18Z No. of bitstreams: 1 julianapolisseni.pdf: 645848 bytes, checksum: 5362a586a32461dda31a0e7f5d2e9fef (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-10-22T12:55:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 julianapolisseni.pdf: 645848 bytes, checksum: 5362a586a32461dda31a0e7f5d2e9fef (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-22T12:55:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 julianapolisseni.pdf: 645848 bytes, checksum: 5362a586a32461dda31a0e7f5d2e9fef (MD5) Previous issue date: 2008-08-29 / O impacto da técnica de biópsia sobre o desenvolvimento embrionário posterior ainda foi pouco estudado e também não foi estabelecido um protocolo único e universal para o PGD. Outro ponto a considerar é a pequena quantidade de DNA genômico disponível para se realizar os estudos genéticos, pelo número reduzido de células obtidas pela técnica de biópsia. Metodologias que utilizam whole genome amplification (WGA) vêm sendo desenvolvidas. Utilizando este método é possível gerar microgramas de DNA partindo de pequenas quantidades de DNA. Então, o objetivo deste estudo foi avaliar o desenvolvimento de embriões bovinos submetidos à biópsia nos estádios de 8-16 células e o uso da técnica de amplificação de todo o genoma nos blastômeros retirados, para posterior identificação do sexo através do PCR. Um grupo de 706 complexos cumulus-ovócitos (CCOs) de bovinos foram maturados e fertilizados in vitro, em estufa incubadora a 38,8 °C, 95% de umidade e 5% de CO2. Os prováveis zigotos foram semi-desnudados e cultivados no meio CR2aa sob as mesmas condições da fertilização. No quarto dia após a fertilização, embriões bovinos com 8-16 células foram aleatoriamnte distribuídos entre dois grupos: controle (n=103) e biópsia (n=92). O número de células removidas correspondeu à quarta parte do embrião. Os blastômeros retirados foram submetidos à amplificação de todo o genoma seguido por PCR. Os embriões retornaram ao meio de cultivo para avaliação do desenvolvimento embrionário. Avaliou-se pelo teste do qui-quadrado a produção de blastocisto no oitavo dia de cultivo, a taxa de eclosão no décimo dia de cultivo, a eficiência da amplificação de todo o genoma e da identificação do sexo nos blastômeros removidos. O número de células embrionárias foi analisado por análise de variância ANOVA (Instituto SAS, Inc., Cary, NC, USA). A proporção de blastocisto no oitavo dia de cultivo foi avaliada pelo teste de Wilcoxon. Diferenças foram consideradas significantes se P<0,05. Um total de 92 embriões bovinos foi utilizado para realização da técnica de biópsia e apresentaram produção de blastocisto de 53,3%, com 44,9% de taxa de eclosão. Essas taxas foram semelhantes (P>0,05) às dos 103 embriões do grupo controle (66,0% e 42,6%, respectivamente). Não houve variação no número de células embrionárias entre os grupos e também não ocorreu diferença na proporção de blastocisto entre os grupos controle e biópsia no oitavo dia de cultivo (P>0,05). Os blastômeros retirados foram submetidos à amplificação de todo o genoma, com 98,2% de eficiência. Entretanto, só foi possível identificar o sexo em 59% das amostras. Conclui-se que a técnica de biópsia realizada em embriões bovinos de 816 células não afetou o desenvolvimento embrionário subseqüente nem a qualidade embrionária dos embriões. A utilização do kit de amplificação de todo o genoma mostrou-se eficiente nos blastômeros retirados, sendo possível identificar o sexo em mais da metade dos embriões. . / The impact of biopsy technique on posterior embryo development is still poorly studied and there is no single universally practiced protocol for implementing PGD. Another thing to consider is the small amount of genomic DNA available to perform the genetic study, due to the reduced number of cells obtained from the biopsy. Alternatively, methodologies using whole genome amplification (WGA) have been developed. Using these methods, it is possible to generate microgram quantities of DNA starting with a little genomic DNA. The aim of this study was to evaluate the effect of biopsy at 8-to 16-cell bovine embryos on subsequent development and WGA on removed blastomeres. A group of 706 complexes cumulus oocytes (CCOs) obtained from local slaughterhouse ovaries were matured and fertilized in vitro, in incubator at 38.8°C with 95% humidified air and 5% of CO2. The zygotes were semidenuded and cultured in CR2aa medium under the same conditions as with in vitro fertilization. On the fourth day after fertilization the 8-to 16-cell embryos were distributed randomly across two groups: control (n=103) and biopsy (n=92). The amount of cells removed cells was one-fourth the embryo of blastomeres. The removed blastomeres were submitted to whole genome amplification (WGA) followed by PCR. The embryos were returned to culture for development evaluation. The chisquare test was used for statistic evaluation of the results of blastocyst rate on the eight day after fertilization and hatching rate on tenth day between biopsy and control group, to test the WGA efficiency and to determine the sex proportion of biopsied samples submitted to PCR. The number of cell per embryo was analyzed by ANOVA with SAS (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA). The blastocyst proportion was evaluated with Wilcoxon test. Differences were considered significant if P<0.05. A total of 92 embryos were submitted to biopsy technique. The blastocyst production was 53.3%, with 44.9% of hatching rate. This rate was similar to control group (66.0% and 42.6%) found on 103 embryos. Overall, no impact was detected on embryo quality in blastocyst cell number between the two groups. The proportion of blastocyst in different stages of development on the 8th day did not differ among groups (P>0.05). Removed blastomeres were submitted to WGA, resulting in 98.2% of efficiency. However, only 59% of samples were sexed by PCR. In conclusion biopsy of 8-to 16-cell bovine embryos did not affect subsequent development. WGA was successful in removed blastomeres and was possible to determinate the sex in the samples.

Submitted by Daniele Amaral (daniee_ni@hotmail.com) on 2016-10-20T19:44:51Z No. of bitstreams: 1 TeseRACS.pdf: 3547391 bytes, checksum: fe9bc399d15d41ee702720017aabc920 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-11-08T18:43:52Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseRACS.pdf: 3547391 bytes, checksum: fe9bc399d15d41ee702720017aabc920 (MD5) / Approved for entry into archive by Marina Freitas (marinapf@ufscar.br) on 2016-11-08T18:44:01Z (GMT) No. of bitstreams: 1 TeseRACS.pdf: 3547391 bytes, checksum: fe9bc399d15d41ee702720017aabc920 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-11-08T18:44:08Z (GMT). No. of bitstreams: 1 TeseRACS.pdf: 3547391 bytes, checksum: fe9bc399d15d41ee702720017aabc920 (MD5) Previous issue date: 2016-03-07 / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / The hatchery is now the main obstacle of aquaculture. Live food, especially zooplankton, is essential in the first life stages of fish. However, there are difficulties in obtaining sufficient biomass. The Anostraca Dendrocephalus brasiliensis, known as “branconeta”, has great potential for use in national aquaculture. In this study, experiments were conducted in controlled conditions in order to obtain: I) the best conditions for hatching of resistant cysts, evaluating the cyst density in the sediment, temperature and pH of the water, and cysts dehydration time; II) identification of the early stages of life, focusing on the length and time to maturity, and we also investigate the main factors that influence the development of the early stages and; III) semiintensive production, the organisms were grown during winter and summer, with two different diets and subsequent analysis of the biochemical composition of organisms grown in these conditions. Hatching occurs in low proportions, and is mainly influenced by the density of cysts present in the sediment, and show some tolerance to different levels of temperature and pH. The average time to reach adulthood was ten days and during the early stages, we observed that some individuals have delayed hatching. Among the environmental variables, temperature and conductivity play a major role in the growth during this period, along with the food, which must be provided from the third day. In semi-intensive farming conditions, we found that large amounts of food promote greater growth in length, both in summer and winter, however, during the winter, low amounts of food provide greater survival. In biochemical analysis, individuals grown with a low amount of food had higher proportion of protein, values higher than those found in Artemia sp. We also detected the presence of polyunsaturated fatty acids, which are of great interest in organisms to be used as live food for fish. In general, D. brasiliensis can be regarded as a suitable species for use in aquaculture due to: ease handling of cysts, since cysts present in the sediment are sufficient for obtaining large populations; growth rate and high tolerance to ambient changes, not requiring great efforts in keeping the culture medium and; nutritional quality, with high concentration of proteins and the presence of polyunsaturated fatty acids. / A larvicultura é hoje o principal entrave da aquicultura. O alimento vivo, em especial zooplanctônico, é essencial nas fases jovens de peixes. No entanto, há dificuldades em se obter biomassa suficiente. O Anostraca Dendrocephalus brasiliensis, conhecido como branconeta, tem grande potencial de utilização na aquicultura nacional. No presente estudo, foram realizados experimentos controlados a fim de se obter: I) melhores condições para eclosão dos cistos de resistência, avaliando a densidade de cistos no sedimento, temperatura e pH da água, e tempo de desidratação dos cistos; II) identificação dos estágios iniciais de vida, com enfoque no comprimento e tempo até a maturidade, além de investigarmos os principais fatores que influenciam o desenvolvimento das fases iniciais e; III) produção semi-intensiva, com cultivos realizados durante o inverno e o verão, com dois regimes alimentares distintos e posterior análise da composição bioquímica dos organismos cultivados nestas condições. A eclosão ocorre em baixas proporções e é influenciada principalmente pela densidade de cistos presente no sedimento, tendo certa tolerância a diferentes níveis de temperatura e pH. O tempo médio para se atingir a idade adulta foi de dez dias e durante as fases inicias, observamos que alguns indivíduos apresentam eclosão tardia. Dentre as variáveis ambientais estudadas, temperatura e condutividade desempenham papel principal no crescimento durante esse período, juntamente com a alimentação, a qual deve ser fornecida a partir do terceiro dia. Em condições de cultivo semi-intensivo, constatamos que grandes quantidades de alimento promovem maior crescimento em comprimento, tanto no verão quanto no inverno, contudo, durante o inverno, baixas quantidades de alimento conferem maior sobrevivência. Na análise bioquímica, os indivíduos cultivados em regime com baixa quantidade de alimento apresentaram maior proporção de proteínas, valores estes maiores do que aqueles encontrados em Artemia sp. Também detectamos a presença de ácidos graxos poliinsaturados, que são de grande interesse em organismos a serem utilizados como alimento vivo para peixes. De modo geral, D. brasiliensis pode ser considerada uma espécie propícia ao uso na aquicultura, devido à: facilidade no manejo de cistos, uma vez que cistos presentes no sedimento são suficientes para obtenção de grandes populações; alta taxa de crescimento e tolerância às variações ambientes, não exigindo grandes esforços na manutenção do meio de cultivo e; qualidade nutricional, com alta concentração de proteínas e presença de ácidos graxos poliinsaturados. / 2008/02078-9