Submitted by Renata Lopes (renatasil82@gmail.com) on 2016-10-13T11:36:18Z No. of bitstreams: 1 julianapolisseni.pdf: 645848 bytes, checksum: 5362a586a32461dda31a0e7f5d2e9fef (MD5) / Approved for entry into archive by Adriana Oliveira (adriana.oliveira@ufjf.edu.br) on 2016-10-22T12:55:07Z (GMT) No. of bitstreams: 1 julianapolisseni.pdf: 645848 bytes, checksum: 5362a586a32461dda31a0e7f5d2e9fef (MD5) / Made available in DSpace on 2016-10-22T12:55:07Z (GMT). No. of bitstreams: 1 julianapolisseni.pdf: 645848 bytes, checksum: 5362a586a32461dda31a0e7f5d2e9fef (MD5) Previous issue date: 2008-08-29 / O impacto da técnica de biópsia sobre o desenvolvimento embrionário posterior ainda foi pouco estudado e também não foi estabelecido um protocolo único e universal para o PGD. Outro ponto a considerar é a pequena quantidade de DNA genômico disponível para se realizar os estudos genéticos, pelo número reduzido de células obtidas pela técnica de biópsia. Metodologias que utilizam whole genome amplification (WGA) vêm sendo desenvolvidas. Utilizando este método é possível gerar microgramas de DNA partindo de pequenas quantidades de DNA. Então, o objetivo deste estudo foi avaliar o desenvolvimento de embriões bovinos submetidos à biópsia nos estádios de 8-16 células e o uso da técnica de amplificação de todo o genoma nos blastômeros retirados, para posterior identificação do sexo através do PCR. Um grupo de 706 complexos cumulus-ovócitos (CCOs) de bovinos foram maturados e fertilizados in vitro, em estufa incubadora a 38,8 °C, 95% de umidade e 5% de CO2. Os prováveis zigotos foram semi-desnudados e cultivados no meio CR2aa sob as mesmas condições da fertilização. No quarto dia após a fertilização, embriões bovinos com 8-16 células foram aleatoriamnte distribuídos entre dois grupos: controle (n=103) e biópsia (n=92). O número de células removidas correspondeu à quarta parte do embrião. Os blastômeros retirados foram submetidos à amplificação de todo o genoma seguido por PCR. Os embriões retornaram ao meio de cultivo para avaliação do desenvolvimento embrionário. Avaliou-se pelo teste do qui-quadrado a produção de blastocisto no oitavo dia de cultivo, a taxa de eclosão no décimo dia de cultivo, a eficiência da amplificação de todo o genoma e da identificação do sexo nos blastômeros removidos. O número de células embrionárias foi analisado por análise de variância ANOVA (Instituto SAS, Inc., Cary, NC, USA). A proporção de blastocisto no oitavo dia de cultivo foi avaliada pelo teste de Wilcoxon. Diferenças foram consideradas significantes se P<0,05. Um total de 92 embriões bovinos foi utilizado para realização da técnica de biópsia e apresentaram produção de blastocisto de 53,3%, com 44,9% de taxa de eclosão. Essas taxas foram semelhantes (P>0,05) às dos 103 embriões do grupo controle (66,0% e 42,6%, respectivamente). Não houve variação no número de células embrionárias entre os grupos e também não ocorreu diferença na proporção de blastocisto entre os grupos controle e biópsia no oitavo dia de cultivo (P>0,05). Os blastômeros retirados foram submetidos à amplificação de todo o genoma, com 98,2% de eficiência. Entretanto, só foi possível identificar o sexo em 59% das amostras. Conclui-se que a técnica de biópsia realizada em embriões bovinos de 816 células não afetou o desenvolvimento embrionário subseqüente nem a qualidade embrionária dos embriões. A utilização do kit de amplificação de todo o genoma mostrou-se eficiente nos blastômeros retirados, sendo possível identificar o sexo em mais da metade dos embriões. . / The impact of biopsy technique on posterior embryo development is still poorly studied and there is no single universally practiced protocol for implementing PGD. Another thing to consider is the small amount of genomic DNA available to perform the genetic study, due to the reduced number of cells obtained from the biopsy. Alternatively, methodologies using whole genome amplification (WGA) have been developed. Using these methods, it is possible to generate microgram quantities of DNA starting with a little genomic DNA. The aim of this study was to evaluate the effect of biopsy at 8-to 16-cell bovine embryos on subsequent development and WGA on removed blastomeres. A group of 706 complexes cumulus oocytes (CCOs) obtained from local slaughterhouse ovaries were matured and fertilized in vitro, in incubator at 38.8°C with 95% humidified air and 5% of CO2. The zygotes were semidenuded and cultured in CR2aa medium under the same conditions as with in vitro fertilization. On the fourth day after fertilization the 8-to 16-cell embryos were distributed randomly across two groups: control (n=103) and biopsy (n=92). The amount of cells removed cells was one-fourth the embryo of blastomeres. The removed blastomeres were submitted to whole genome amplification (WGA) followed by PCR. The embryos were returned to culture for development evaluation. The chisquare test was used for statistic evaluation of the results of blastocyst rate on the eight day after fertilization and hatching rate on tenth day between biopsy and control group, to test the WGA efficiency and to determine the sex proportion of biopsied samples submitted to PCR. The number of cell per embryo was analyzed by ANOVA with SAS (SAS Institute, Inc., Cary, NC, USA). The blastocyst proportion was evaluated with Wilcoxon test. Differences were considered significant if P<0.05. A total of 92 embryos were submitted to biopsy technique. The blastocyst production was 53.3%, with 44.9% of hatching rate. This rate was similar to control group (66.0% and 42.6%) found on 103 embryos. Overall, no impact was detected on embryo quality in blastocyst cell number between the two groups. The proportion of blastocyst in different stages of development on the 8th day did not differ among groups (P>0.05). Removed blastomeres were submitted to WGA, resulting in 98.2% of efficiency. However, only 59% of samples were sexed by PCR. In conclusion biopsy of 8-to 16-cell bovine embryos did not affect subsequent development. WGA was successful in removed blastomeres and was possible to determinate the sex in the samples.

Objetivou-se avaliar a influencia da suplementação de ácidos graxos &#969;3 e &#969;6, sobre desempenho produtivo, perfil metabólico, qualidade oocitária e embrionária, função imune em vacas leiteiras no período de transição e inicio de lactação. Foram selecionadas 42 vacas da raça holandesa, multíparas e gestantes, com parto previsto para 35 dias após o início da avaliação e fornecimento das dietas experimentais. As vacas foram alojadas em estábulo tipo &#147;free-stall&#148;, providos de baias individuais. Os animais foram distribuídos aleatoriamente para receber uma das quatro dietas experimentais fornecidas a partir de 35 dias antes da data prevista para o parto até 84 dias do pós-parto: controle (n=11) (C): dieta sem adição de gordura; semente de linhaça (n=10) (SL): inclusão de 60 a 80 g/kg de MS (fonte de ômega 3); grão de soja cru e integral (n=11) (GS): inclusão de 120 a 160 g/kg de MS (fonte de ômega 6); sais de cálcio de ácidos graxos insaturados (n=11) (SC): inclusão de 24 a 32 g/kg de MS (fonte de ômega 6). As dietas experimentais tiveram a mesma concentração de ácidos graxos insaturados, porém o perfil de ácidos graxos das fontes foi diferente. Os animais foram arraçoados de acordo com o consumo de matéria seca no dia anterior, de forma a ser mantido porcentual de sobras das dietas, diariamente, entre 5 e 10%. As amostras dos alimentos e sobras foram coletadas diariamente e armazenadas a -20ºC. Semanalmente as amostras coletadas diariamente foram misturadas e foi retirada uma amostra composta referente a um período de uma semana, a fim de mensurar o consumo de matéria seca e nutrientes. Amostras de fezes foram coletadas nos dias -28, -14, 21, 42 e 84 dias em relação ao parto, com o propósito de mensurar a digestibilidade da matéria seca e nutrientes. A produção de leite foi mensurada diariamente e para a composição dos teores de gordura, proteína, lactose e perfil de ácidos graxos foram coletados amostras semanalmente e analisadas a fresco. Amostras de sangue foram coletadas nos dias -21, -14, -7, parto (até 24 horas), 7, 14, 21, 42 e 84 dias em relação ao parto, a fim de mensuração a concentração dos metabólitos plasmáticos e função imune. O scaneamento das estruturas ovarianas por ultrassonografia foi realizada do 14° ao 72° dia de lactação a fim de analisar a dinâmica folicular dos animais. Aspirações foliculares foram realizadas nos dia 35±7 e 65±7, com o objetivo de avaliar a quantidade e qualidade oocitária e embrionária, por fertilização&#148; in vitro&#148;. Foi observado maior CMS para a dieta SL em relação às dietas GS e SC no pré-parto. No pós-parto não foi observado diferenças no CMS. Foi observado maior consumo de EE para as dietas SL, GS e SC no pré e pós-parto em relação à dieta C. Não foi observado diferença na digestibilidade da matéria seca no pré e pós-parto entre as dietas experimentais. Foi obtido maior digestibilidade do EE para a dieta SL em relação às dietas GS e SC no pós-parto. Não foi observada diferença no balanço de energia no pré-parto. No entanto no período pós-parto foi observado melhor balanço de energia para as dietas SL, GS e SC em relação à dieta C. Não foi observada diferença para o balanço de nitrogênio nos períodos pré e pós-parto entre as dietas avaliadas. Foi observado maior teor e produção de gordura no leite para a dieta GS em relação às dietas SL e SC, porém não foi observado diferença para a produção de leite entre as dietas experimentais. No perfil de ácidos graxos do leite foi obtido maior concentração de C18: 1 trans e CLA cis-9 trans-11 para a dieta SC em relação as demais dietas experimentais, maior concentração de C18:2 para a dieta GS e SC em relação a dieta SL e C18:3 para a dieta SL em relação as dietas GS e SC. Não foi observada diferença no escore de condição corporal e peso corporal no pré e pós-parto. Foi observada maior concentração de glicose no pré e pós-parto para a dieta SL em relação às dietas GS e SC. Foi observado maior concentração de colesterol total para as dietas SL, GS e SC em relação a dieta C no pós-parto. Não foi observadas diferenças nas concentrações de ácidos graxos não esterificados e &#946;-hidroxibutirato no pré e pós-parto. Foi observado menor número total de folículos e folículos de classe1 para a dieta C em relação as dietas SL, GS e SC. Foi observado maior número de oócitos viáveis na aspiração dos 65±7 dias em relação a dos 35±7 dias de lactação. Foi obtido maior número e porcentagem de embriões viáveis para a dieta SL em relação às dietas GS e SC. Foi observada maior porcentagem de leucócitos e monócitos positivos a fagocitose para as dietas SL, GS e SC em relação à dieta C, no pré e pós-parto, para os neutrófilos no pré e pós-parto e monócitos no pós-parto foi observado maior porcentagem de células positivas para a dieta SL em relação às dietas SC e GS. Foi observado maior expressão das células de adesão CD4+, CD8+, CD25+ e CD62L para as dietas SL, GS e SC em relação as dieta C, para o CD14+ foi observado maior expressão para as dietas GS e SC em relação à dieta SL. A suplementação de ácidos graxos &#969;3 e &#969;6 melhorou o balanço energético, e não influenciou negativamente os parâmetros produtivos, melhorou a qualidade oocitária e embrionária, bem como a função imune de imune de vacas leiteiras em período de transição e inicio de lactação. / The objective was to evaluate the influence of &#969;3 and &#969;6 fatty acid supplementation, on productive performance, metabolic profile, oocyte and embryo quality, immune system function in dairy cows during the transition period and early lactation. Were selected forty-two Holstein cows, and multiparous pregnant with calving provided for 35 days after the beginning of the evaluation and supply of experimental diets. The cows were housed in stable type \"free-stall\", provided with individual stalls. The animals were randomly assigned to one of four experimental treatments provided from 35 before the expected date of calving up to 84 days postpartum: control (n = 11) (C) diet without added fat; flaxseed whole (n = 10) (FW): inclusion of 60 to 80 g / kg DM (source of omega 3); whole raw soybean raw (n = 11) (WS) including 120-160 g / kg MS (source of omega 6), calcium salts of insatured fatty acids (n = 11) (CS): inclusion 24-32 g / kg DM (source of omega 6). The experimental diets had the same concentration of unsaturated fatty acids, but the fatty acid profile of the sources was different. The animals were fed according to the dry matter intake the day before, so as to be maintained orts a percentage of the diet every day, between 5 and 10%. Samples of feeds and orts were collected daily and stored at -20 º C. Weekly samples were collected daily mixed and a sample was taken corresponding to a period of a week in order to measure the intake of dry matter and nutrients. Feces samples were collected on days -28, -14, 21, 42 and 84 days in relation at calving, in order to measure the digestibility of dry matter and nutrients. Milk yield was measured daily and the composition of fat, protein and lactose samples were collected weekly and analyzed fresh. For the fatty acid profile of milk samples were collected weekly and were grouped for analysis of the week 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, totaling 4 points of analysis. The measurement of body weight and body condition score were measured weekly. Blood samples were collected on days -21, -14, -7, calving (+24 hours), 7, 14, 21, 42 and 84 days in relation at calving in order to measure the concentration of plasma metabolites and immune function. The scanning of ovarian structures by ultrasonography was performed from 14th to 72nd day of lactation in order to analyze the dynamics of follicular animals. Follicular aspirations were performed on day 35 ± 7 and 65 ± 7, in order to assess the quantity and quality oocyte and embryo by fertilization \"in vitro\". It was observed higher DMI for the diet FW in relation to CS and WS diets pre-partum. Postpartum was not observed differences in DMI. It was observed higher intake of fat to the FW, WS and CS in the pre and postpartum compared to C diet. There was no difference in dry matter digestibility in pre-and postpartum. It was obtain the highest digestibility of fat to the diet FW in relation to WS and CS diets postpartum. There was no difference in the balance of energy in prepartum. Postpartum was observed better energy balance for diets FW, WS and CS in relation to the C diet. No differences were observed for nitrogen balance in the pre-and postpartum between diets evaluated. It was observed a higher content and yield of milk fat for diet WS in relation to FW and CS, but no difference was observed for milk yield. In the fatty acid profile of milk was obtained higher concentration of C18: 1 trans and CLA cis-9 trans-11 for diet CS in relation the others and higher concentration of C18: 2 for diet WS and CS in relation FW and and C18: 3 for FW diet in relation diets WS and CS. There was no difference in body condition score and body weight in pre-and postpartum. Higher value was observed of glucose in the pre and postpartum diet for FW in relation to CS and WS. It was observed higher concentrations of total cholesterol to the diets FW, WS and CS in relation to Cl diet in postpartum. There was no difference in concentrations of nonesterified fatty acids and &#946;-hydroxybutyrate in pre and postpartum. It was observed a shorter total number of follicles and follicles class1 to the C diet compared with diets FW, WS and CS. It was observed a higher number of viable oocytes in aspiration of 65 ± 7 days compared to the 35 ± 7 days of lactation. Obtained the highest number and percentage of viable embryos for FW diet compared to diets CS and WS. There was a higher percentage of leukocytes and monocytes positive for phagocytosis for diets FW, WS and CS compared to the C diet, in pre and postpartum, for neutrophils in pre and postpartum and postpartum monocytes was observed higher percentage of positive cells for FW diet compared to diets CS and WS. It was observed increased expression of cell adhesion CD4 +, CD8 +, CD25 + and CD62L for diets FW, WS and CS in relation to the C diet. For CD14 + was observed increased expression for diets WS and CS in relation to diet FW. The fatty acid supplementation &#969;3 and &#969;6 improved energy balance, and did not influence the performance, improved oocyte and embryo quality and immune function of dairy cows in the transition period and early lactation

Objetivou-se avaliar a influencia da suplementação de ácidos graxos &#969;3 e &#969;6, sobre desempenho produtivo, perfil metabólico, qualidade oocitária e embrionária, função imune em vacas leiteiras no período de transição e inicio de lactação. Foram selecionadas 42 vacas da raça holandesa, multíparas e gestantes, com parto previsto para 35 dias após o início da avaliação e fornecimento das dietas experimentais. As vacas foram alojadas em estábulo tipo &#147;free-stall&#148;, providos de baias individuais. Os animais foram distribuídos aleatoriamente para receber uma das quatro dietas experimentais fornecidas a partir de 35 dias antes da data prevista para o parto até 84 dias do pós-parto: controle (n=11) (C): dieta sem adição de gordura; semente de linhaça (n=10) (SL): inclusão de 60 a 80 g/kg de MS (fonte de ômega 3); grão de soja cru e integral (n=11) (GS): inclusão de 120 a 160 g/kg de MS (fonte de ômega 6); sais de cálcio de ácidos graxos insaturados (n=11) (SC): inclusão de 24 a 32 g/kg de MS (fonte de ômega 6). As dietas experimentais tiveram a mesma concentração de ácidos graxos insaturados, porém o perfil de ácidos graxos das fontes foi diferente. Os animais foram arraçoados de acordo com o consumo de matéria seca no dia anterior, de forma a ser mantido porcentual de sobras das dietas, diariamente, entre 5 e 10%. As amostras dos alimentos e sobras foram coletadas diariamente e armazenadas a -20ºC. Semanalmente as amostras coletadas diariamente foram misturadas e foi retirada uma amostra composta referente a um período de uma semana, a fim de mensurar o consumo de matéria seca e nutrientes. Amostras de fezes foram coletadas nos dias -28, -14, 21, 42 e 84 dias em relação ao parto, com o propósito de mensurar a digestibilidade da matéria seca e nutrientes. A produção de leite foi mensurada diariamente e para a composição dos teores de gordura, proteína, lactose e perfil de ácidos graxos foram coletados amostras semanalmente e analisadas a fresco. Amostras de sangue foram coletadas nos dias -21, -14, -7, parto (até 24 horas), 7, 14, 21, 42 e 84 dias em relação ao parto, a fim de mensuração a concentração dos metabólitos plasmáticos e função imune. O scaneamento das estruturas ovarianas por ultrassonografia foi realizada do 14° ao 72° dia de lactação a fim de analisar a dinâmica folicular dos animais. Aspirações foliculares foram realizadas nos dia 35±7 e 65±7, com o objetivo de avaliar a quantidade e qualidade oocitária e embrionária, por fertilização&#148; in vitro&#148;. Foi observado maior CMS para a dieta SL em relação às dietas GS e SC no pré-parto. No pós-parto não foi observado diferenças no CMS. Foi observado maior consumo de EE para as dietas SL, GS e SC no pré e pós-parto em relação à dieta C. Não foi observado diferença na digestibilidade da matéria seca no pré e pós-parto entre as dietas experimentais. Foi obtido maior digestibilidade do EE para a dieta SL em relação às dietas GS e SC no pós-parto. Não foi observada diferença no balanço de energia no pré-parto. No entanto no período pós-parto foi observado melhor balanço de energia para as dietas SL, GS e SC em relação à dieta C. Não foi observada diferença para o balanço de nitrogênio nos períodos pré e pós-parto entre as dietas avaliadas. Foi observado maior teor e produção de gordura no leite para a dieta GS em relação às dietas SL e SC, porém não foi observado diferença para a produção de leite entre as dietas experimentais. No perfil de ácidos graxos do leite foi obtido maior concentração de C18: 1 trans e CLA cis-9 trans-11 para a dieta SC em relação as demais dietas experimentais, maior concentração de C18:2 para a dieta GS e SC em relação a dieta SL e C18:3 para a dieta SL em relação as dietas GS e SC. Não foi observada diferença no escore de condição corporal e peso corporal no pré e pós-parto. Foi observada maior concentração de glicose no pré e pós-parto para a dieta SL em relação às dietas GS e SC. Foi observado maior concentração de colesterol total para as dietas SL, GS e SC em relação a dieta C no pós-parto. Não foi observadas diferenças nas concentrações de ácidos graxos não esterificados e &#946;-hidroxibutirato no pré e pós-parto. Foi observado menor número total de folículos e folículos de classe1 para a dieta C em relação as dietas SL, GS e SC. Foi observado maior número de oócitos viáveis na aspiração dos 65±7 dias em relação a dos 35±7 dias de lactação. Foi obtido maior número e porcentagem de embriões viáveis para a dieta SL em relação às dietas GS e SC. Foi observada maior porcentagem de leucócitos e monócitos positivos a fagocitose para as dietas SL, GS e SC em relação à dieta C, no pré e pós-parto, para os neutrófilos no pré e pós-parto e monócitos no pós-parto foi observado maior porcentagem de células positivas para a dieta SL em relação às dietas SC e GS. Foi observado maior expressão das células de adesão CD4+, CD8+, CD25+ e CD62L para as dietas SL, GS e SC em relação as dieta C, para o CD14+ foi observado maior expressão para as dietas GS e SC em relação à dieta SL. A suplementação de ácidos graxos &#969;3 e &#969;6 melhorou o balanço energético, e não influenciou negativamente os parâmetros produtivos, melhorou a qualidade oocitária e embrionária, bem como a função imune de imune de vacas leiteiras em período de transição e inicio de lactação. / The objective was to evaluate the influence of &#969;3 and &#969;6 fatty acid supplementation, on productive performance, metabolic profile, oocyte and embryo quality, immune system function in dairy cows during the transition period and early lactation. Were selected forty-two Holstein cows, and multiparous pregnant with calving provided for 35 days after the beginning of the evaluation and supply of experimental diets. The cows were housed in stable type \"free-stall\", provided with individual stalls. The animals were randomly assigned to one of four experimental treatments provided from 35 before the expected date of calving up to 84 days postpartum: control (n = 11) (C) diet without added fat; flaxseed whole (n = 10) (FW): inclusion of 60 to 80 g / kg DM (source of omega 3); whole raw soybean raw (n = 11) (WS) including 120-160 g / kg MS (source of omega 6), calcium salts of insatured fatty acids (n = 11) (CS): inclusion 24-32 g / kg DM (source of omega 6). The experimental diets had the same concentration of unsaturated fatty acids, but the fatty acid profile of the sources was different. The animals were fed according to the dry matter intake the day before, so as to be maintained orts a percentage of the diet every day, between 5 and 10%. Samples of feeds and orts were collected daily and stored at -20 º C. Weekly samples were collected daily mixed and a sample was taken corresponding to a period of a week in order to measure the intake of dry matter and nutrients. Feces samples were collected on days -28, -14, 21, 42 and 84 days in relation at calving, in order to measure the digestibility of dry matter and nutrients. Milk yield was measured daily and the composition of fat, protein and lactose samples were collected weekly and analyzed fresh. For the fatty acid profile of milk samples were collected weekly and were grouped for analysis of the week 1-3, 4-6, 7-9, 10-12, totaling 4 points of analysis. The measurement of body weight and body condition score were measured weekly. Blood samples were collected on days -21, -14, -7, calving (+24 hours), 7, 14, 21, 42 and 84 days in relation at calving in order to measure the concentration of plasma metabolites and immune function. The scanning of ovarian structures by ultrasonography was performed from 14th to 72nd day of lactation in order to analyze the dynamics of follicular animals. Follicular aspirations were performed on day 35 ± 7 and 65 ± 7, in order to assess the quantity and quality oocyte and embryo by fertilization \"in vitro\". It was observed higher DMI for the diet FW in relation to CS and WS diets pre-partum. Postpartum was not observed differences in DMI. It was observed higher intake of fat to the FW, WS and CS in the pre and postpartum compared to C diet. There was no difference in dry matter digestibility in pre-and postpartum. It was obtain the highest digestibility of fat to the diet FW in relation to WS and CS diets postpartum. There was no difference in the balance of energy in prepartum. Postpartum was observed better energy balance for diets FW, WS and CS in relation to the C diet. No differences were observed for nitrogen balance in the pre-and postpartum between diets evaluated. It was observed a higher content and yield of milk fat for diet WS in relation to FW and CS, but no difference was observed for milk yield. In the fatty acid profile of milk was obtained higher concentration of C18: 1 trans and CLA cis-9 trans-11 for diet CS in relation the others and higher concentration of C18: 2 for diet WS and CS in relation FW and and C18: 3 for FW diet in relation diets WS and CS. There was no difference in body condition score and body weight in pre-and postpartum. Higher value was observed of glucose in the pre and postpartum diet for FW in relation to CS and WS. It was observed higher concentrations of total cholesterol to the diets FW, WS and CS in relation to Cl diet in postpartum. There was no difference in concentrations of nonesterified fatty acids and &#946;-hydroxybutyrate in pre and postpartum. It was observed a shorter total number of follicles and follicles class1 to the C diet compared with diets FW, WS and CS. It was observed a higher number of viable oocytes in aspiration of 65 ± 7 days compared to the 35 ± 7 days of lactation. Obtained the highest number and percentage of viable embryos for FW diet compared to diets CS and WS. There was a higher percentage of leukocytes and monocytes positive for phagocytosis for diets FW, WS and CS compared to the C diet, in pre and postpartum, for neutrophils in pre and postpartum and postpartum monocytes was observed higher percentage of positive cells for FW diet compared to diets CS and WS. It was observed increased expression of cell adhesion CD4 +, CD8 +, CD25 + and CD62L for diets FW, WS and CS in relation to the C diet. For CD14 + was observed increased expression for diets WS and CS in relation to diet FW. The fatty acid supplementation &#969;3 and &#969;6 improved energy balance, and did not influence the performance, improved oocyte and embryo quality and immune function of dairy cows in the transition period and early lactation

Introdução. A criopreservação de oócitos é importante, tanto para a tentativa de preservação da fertilidade feminina, como nos tratamentos de reprodução assistida. Hipotetizamos que novas formulações de meios crioprotetores, contendo biomoléculas que participam da estrutura e funcionalidade celular, em particular da função mitocondrial e da dinâmica do sistema de membranas, poderiam melhorar a criotolerância e segurança da vitrificação. Objetivos. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos do meio padrão de vitrificação (T4) e T4 suplementado com L-carnitina (LC), LC-ácidos graxos (T4-AG) e LC-AGfosfatidilcolina (T4-PC) sobre a sobrevida e qualidade de oócitos criopreservados, mensurada por parâmetros do desenvolvimento in vitro de embriões, como número de núcleos totais (NT), de células na massa celular interna (MCI) e trofectoderma (TE) dos blastocistos oriundos de oócitos vitrificados nestes meios, assim como sobre os padrões de atividade mitocondrial oocitária. Materiais e métodos. Estudo experimental usando o camundongo da cepa C57BL/6 como modelo. Oócitos maturados in vivo, foram distribuídos em 5 grupos: controle a fresco (CT) e 4 grupos vitrificados: T4, T4-LC, T4-AG e T4-PC. Após a desvitrificação, foi analisada a sobrevida oocitária e os oócitos viáveis foram submetidos a fertilização in vitro ou utilizados para análise da atividade mitocondrial, por meio da análise de espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelular por Intensidade de Fluorescência emitida pelo diacetato de 2,7- diclorodihidrofluoresceína, metabolismo oxidativo pela autofluorescência de dois fluoróforos endógenos [dinucleótideo de flavina adenina oxidado e o dinucleotideo reduzido de nicotinamida adenina (fosfato)] e potencial de membrana mitocondrial por Intensidade de Fluorescência (IF) emitida pelo JC1. Os oócitos dos 5 grupos submetidos a FIV foram cultivados por 96 horas, sendo comparados entre os grupos: taxa de fertilização e formação de blastocisto, assim como o número de NT, células MCI e TE e tamanho dos blastocistos. Resultados. A taxa de sobrevivência dos oócitos vitrificados em T4 foi superior a dos demais grupos T4-LC, T4-AG e T4-PC (respectivamente 100%, 97,07%, 96,75% e 97,95%). A taxa de fertilização do grupo CT (77,5%) foi superior a dos grupos T4, T4-LC e T4-PC, não diferindo do grupo T4-AG. Não foram evidenciadas diferenças estatisticamente significativas nas taxas de formação de blastocistos entre os grupos CT, T4, T4-LC, T4-AG e T4-PC (58,07%, 48,05%, 47,44%, 57,89% e 51,06%,respectivamente). Comparando-se o número NT e de células do TE dos blastocistos, observou-se que o os valores do grupo controle foram maiores do que o dos outros 4 grupos, que não apresentaram diferenças entre si. O número de células da MCI dos blastocistos do grupo controle foi superior ao dos grupos T4 e T4-LC e similar ao dos grupos T4-AG e T4- PC. Para o perfil de atividade mitocondrial, foram analisados 15 oócitos/grupo. Os níveis de EROs foram maiores no grupo CT comparado ao grupo T4 e menor quando comparado aos grupos T4-LC e T4-AG, mas sem diferença significativa em relação ao grupo T4-PC. Para Resumo analise do estado redox, o grupo CT teve maiores valores do que a dos grupos T4, T4-LC e T4- AG e o grupo T4-PC foi maior do que a dos outros quatro grupos. Para o potencial de membrana mitocondrial, o grupo CT teve maiores valores do que a do grupo T4-LC, menor do que a do grupo T4 e sem diferença estatisticamente significativa com a dos grupos T4-AG e T4-PC. Conclusão. O número de NT, células do TE e tamanho do blastocistos foram inferiores nos grupos vitrificados/desvitrificados em meio padrão e suplementados comparados ao controle. Porém, o número de células da MCI não foi diferente entre o grupo controle e os vitrificados T4- AG e T4-PC, sugerindo que a suplementação dos meios padrão com LC, AG e PC possa melhorar a competência do oócito e a subsequente qualidade embrionária, o que precisa ser melhor investigado antes da aplicação clínica dos novos meios. Apesar dos oócitos vitrificados no meio T4 terem apresentado taxa de sobrevivência estatisticamente superior a dos demais grupos, sugerimos que estas diferenças não apresentariam potencial relevância clínica. Os resultados de atividade mitocondrial revelam que há uma diferença importante entre oócitos controle e vitrificados com ou sem suplementos na eficiência da função mitocondrial, regulação do estado redox e controle intracelular das EROs, demonstrando que mais trabalhos são necessários para entender esta via metabólica e os diferentes efeitos dos meios de vitrificação. / Introduction. Cryopreservation of oocytes is important, both for the attempt to preserve female fertility and for assisted reproduction treatments. We hypothesize that novel cryoprotective formulations containing biomolecules that participate in cellular structure and functionality, particularly mitochondrial function and membrane system dynamics, could improve cryotolerance and safety of vitrification. Objeticve. The objective of this study was to investigate the effects of the standard vitrification medium (T4) and T4 supplemented with L-carnitine (LC), LC-fatty acids (T4-AG) and LC-AGphosphatidylcholine (T4-PC) on survival and quality of cryopreserved oocytes, measured by in vitro embryo development parameters, such as number of total nuclei (NT), cells in the internal cell mass (ICM) and trophoectoderma (TE) of the blastocysts derived from vitrified oocytes in these media, as well as on the patterns of oocyte mitochondrial activity. Materials and methods. Experimental study using the C57BL/6 mouse as a model. Matured in vivo oocytes were distributed into 5 groups: fresh (CT) control and four vitrified groups: T4, T4-LC, T4-AG and T4-PC. After devitrification, oocyte survival was analyzed and viable oocytes were submitted to in vitro fertilization or used for analysis of mitochondrial activity, through the analysis of intracellular reactive oxygen species (ROS) by Fluorescence Intensity emitted by diacetate of 2, 7-dichlorodihydrofluorescein, oxidative metabolism by the autofluorescence of two endogenous fluorophores [oxidized flavin adenine dinucleotide and the reduced dinucleotide of nicotinamide adenine (phosphate)] and mitochondrial membrane potential by Fluorescence Intensity (FI) emitted by JC1. The oocytes of the 5 groups submitted to IVF were cultured for 96 hours, being compared between the groups: fertilization rate and blastocyst formation, as well as number of NT, MCI and TE cells and size of blastocysts. Results. The survival rate of vitrified oocytes in T4 was higher than in the other groups T4-LC, T4-AG and T4-PC (respectively 100%, 97.07%, 96.75% and 97.95%). The fertilization rate of the CT group (77.5%) was higher than that of the T4, T4-LC and T4-PC groups, not differing from the T4-AG group. There were no statistically significant differences in the rates of blastocyst formation between the groups CT, T4, T4-LC, T4-AG and T4-PC (58.07%, 48.05%, 47.44%, 57.89% and 51.06%, respectively). Comparing the NT and TE cells of the blastocysts, it was observed that the values of the control group were higher than that of the other 4 groups, which did not present differences between them. The number of MCI cells from the blastocysts of the control group was higher than that of the T4 and T4-LC groups and similar to that of the T4-AG and T4-PC groups. For the mitochondrial activity profile, 15 oocytes/group were analysed. The levels of EROs were higher in the CT group compared to the T4 group and lower when compared to the T4-LC and T4-AG groups, but without significant difference in relation to the T4-PC group. For the analysis of the redox state, the CT group had higher values than the T4, T4-LC and T4-AG groups and the T4-PC group was higher than the other four groups. For the mitochondrial membrane potential, the CT group had higher values than the T4-LC group, lower than the T4 group and without a statistically significant difference with the T4-AG and T4-PC groups. Conclusion. The number of NT, TE cells and blastocyst size were lower in the vitrified/devitrified groups in standard medium and supplemented compared to control. However, the MCI cell number was not different between the control group and the vitrified T4-AG and T4-PC, suggesting that the supplementation of the standard media with LC, GA and CP could improve oocyte competence and subsequent embryo quality, which needs to be better investigated before the clinical application of the new media. Although vitrified oocytes in the T4 medium had a statistically higher survival rate than the other groups, we suggested that these differences would not present potential clinical relevance. The results of mitochondrial activity reveal that there is an important difference between control and vitrified oocytes with or without supplements in the efficiency of mitochondrial function, regulation of the redox state and intracellular control of ROS, demonstrating that more work is needed to understand this metabolic pathway and the different effects of the vitrification media.

Introdução. A criopreservação de oócitos é importante, tanto para a tentativa de preservação da fertilidade feminina, como nos tratamentos de reprodução assistida. Hipotetizamos que novas formulações de meios crioprotetores, contendo biomoléculas que participam da estrutura e funcionalidade celular, em particular da função mitocondrial e da dinâmica do sistema de membranas, poderiam melhorar a criotolerância e segurança da vitrificação. Objetivos. Este estudo teve como objetivo investigar os efeitos do meio padrão de vitrificação (T4) e T4 suplementado com L-carnitina (LC), LC-ácidos graxos (T4-AG) e LC-AGfosfatidilcolina (T4-PC) sobre a sobrevida e qualidade de oócitos criopreservados, mensurada por parâmetros do desenvolvimento in vitro de embriões, como número de núcleos totais (NT), de células na massa celular interna (MCI) e trofectoderma (TE) dos blastocistos oriundos de oócitos vitrificados nestes meios, assim como sobre os padrões de atividade mitocondrial oocitária. Materiais e métodos. Estudo experimental usando o camundongo da cepa C57BL/6 como modelo. Oócitos maturados in vivo, foram distribuídos em 5 grupos: controle a fresco (CT) e 4 grupos vitrificados: T4, T4-LC, T4-AG e T4-PC. Após a desvitrificação, foi analisada a sobrevida oocitária e os oócitos viáveis foram submetidos a fertilização in vitro ou utilizados para análise da atividade mitocondrial, por meio da análise de espécies reativas de oxigênio (EROs) intracelular por Intensidade de Fluorescência emitida pelo diacetato de 2,7- diclorodihidrofluoresceína, metabolismo oxidativo pela autofluorescência de dois fluoróforos endógenos [dinucleótideo de flavina adenina oxidado e o dinucleotideo reduzido de nicotinamida adenina (fosfato)] e potencial de membrana mitocondrial por Intensidade de Fluorescência (IF) emitida pelo JC1. Os oócitos dos 5 grupos submetidos a FIV foram cultivados por 96 horas, sendo comparados entre os grupos: taxa de fertilização e formação de blastocisto, assim como o número de NT, células MCI e TE e tamanho dos blastocistos. Resultados. A taxa de sobrevivência dos oócitos vitrificados em T4 foi superior a dos demais grupos T4-LC, T4-AG e T4-PC (respectivamente 100%, 97,07%, 96,75% e 97,95%). A taxa de fertilização do grupo CT (77,5%) foi superior a dos grupos T4, T4-LC e T4-PC, não diferindo do grupo T4-AG. Não foram evidenciadas diferenças estatisticamente significativas nas taxas de formação de blastocistos entre os grupos CT, T4, T4-LC, T4-AG e T4-PC (58,07%, 48,05%, 47,44%, 57,89% e 51,06%,respectivamente). Comparando-se o número NT e de células do TE dos blastocistos, observou-se que o os valores do grupo controle foram maiores do que o dos outros 4 grupos, que não apresentaram diferenças entre si. O número de células da MCI dos blastocistos do grupo controle foi superior ao dos grupos T4 e T4-LC e similar ao dos grupos T4-AG e T4- PC. Para o perfil de atividade mitocondrial, foram analisados 15 oócitos/grupo. Os níveis de EROs foram maiores no grupo CT comparado ao grupo T4 e menor quando comparado aos grupos T4-LC e T4-AG, mas sem diferença significativa em relação ao grupo T4-PC. Para Resumo analise do estado redox, o grupo CT teve maiores valores do que a dos grupos T4, T4-LC e T4- AG e o grupo T4-PC foi maior do que a dos outros quatro grupos. Para o potencial de membrana mitocondrial, o grupo CT teve maiores valores do que a do grupo T4-LC, menor do que a do grupo T4 e sem diferença estatisticamente significativa com a dos grupos T4-AG e T4-PC. Conclusão. O número de NT, células do TE e tamanho do blastocistos foram inferiores nos grupos vitrificados/desvitrificados em meio padrão e suplementados comparados ao controle. Porém, o número de células da MCI não foi diferente entre o grupo controle e os vitrificados T4- AG e T4-PC, sugerindo que a suplementação dos meios padrão com LC, AG e PC possa melhorar a competência do oócito e a subsequente qualidade embrionária, o que precisa ser melhor investigado antes da aplicação clínica dos novos meios. Apesar dos oócitos vitrificados no meio T4 terem apresentado taxa de sobrevivência estatisticamente superior a dos demais grupos, sugerimos que estas diferenças não apresentariam potencial relevância clínica. Os resultados de atividade mitocondrial revelam que há uma diferença importante entre oócitos controle e vitrificados com ou sem suplementos na eficiência da função mitocondrial, regulação do estado redox e controle intracelular das EROs, demonstrando que mais trabalhos são necessários para entender esta via metabólica e os diferentes efeitos dos meios de vitrificação. / Introduction. Cryopreservation of oocytes is important, both for the attempt to preserve female fertility and for assisted reproduction treatments. We hypothesize that novel cryoprotective formulations containing biomolecules that participate in cellular structure and functionality, particularly mitochondrial function and membrane system dynamics, could improve cryotolerance and safety of vitrification. Objeticve. The objective of this study was to investigate the effects of the standard vitrification medium (T4) and T4 supplemented with L-carnitine (LC), LC-fatty acids (T4-AG) and LC-AGphosphatidylcholine (T4-PC) on survival and quality of cryopreserved oocytes, measured by in vitro embryo development parameters, such as number of total nuclei (NT), cells in the internal cell mass (ICM) and trophoectoderma (TE) of the blastocysts derived from vitrified oocytes in these media, as well as on the patterns of oocyte mitochondrial activity. Materials and methods. Experimental study using the C57BL/6 mouse as a model. Matured in vivo oocytes were distributed into 5 groups: fresh (CT) control and four vitrified groups: T4, T4-LC, T4-AG and T4-PC. After devitrification, oocyte survival was analyzed and viable oocytes were submitted to in vitro fertilization or used for analysis of mitochondrial activity, through the analysis of intracellular reactive oxygen species (ROS) by Fluorescence Intensity emitted by diacetate of 2, 7-dichlorodihydrofluorescein, oxidative metabolism by the autofluorescence of two endogenous fluorophores [oxidized flavin adenine dinucleotide and the reduced dinucleotide of nicotinamide adenine (phosphate)] and mitochondrial membrane potential by Fluorescence Intensity (FI) emitted by JC1. The oocytes of the 5 groups submitted to IVF were cultured for 96 hours, being compared between the groups: fertilization rate and blastocyst formation, as well as number of NT, MCI and TE cells and size of blastocysts. Results. The survival rate of vitrified oocytes in T4 was higher than in the other groups T4-LC, T4-AG and T4-PC (respectively 100%, 97.07%, 96.75% and 97.95%). The fertilization rate of the CT group (77.5%) was higher than that of the T4, T4-LC and T4-PC groups, not differing from the T4-AG group. There were no statistically significant differences in the rates of blastocyst formation between the groups CT, T4, T4-LC, T4-AG and T4-PC (58.07%, 48.05%, 47.44%, 57.89% and 51.06%, respectively). Comparing the NT and TE cells of the blastocysts, it was observed that the values of the control group were higher than that of the other 4 groups, which did not present differences between them. The number of MCI cells from the blastocysts of the control group was higher than that of the T4 and T4-LC groups and similar to that of the T4-AG and T4-PC groups. For the mitochondrial activity profile, 15 oocytes/group were analysed. The levels of EROs were higher in the CT group compared to the T4 group and lower when compared to the T4-LC and T4-AG groups, but without significant difference in relation to the T4-PC group. For the analysis of the redox state, the CT group had higher values than the T4, T4-LC and T4-AG groups and the T4-PC group was higher than the other four groups. For the mitochondrial membrane potential, the CT group had higher values than the T4-LC group, lower than the T4 group and without a statistically significant difference with the T4-AG and T4-PC groups. Conclusion. The number of NT, TE cells and blastocyst size were lower in the vitrified/devitrified groups in standard medium and supplemented compared to control. However, the MCI cell number was not different between the control group and the vitrified T4-AG and T4-PC, suggesting that the supplementation of the standard media with LC, GA and CP could improve oocyte competence and subsequent embryo quality, which needs to be better investigated before the clinical application of the new media. Although vitrified oocytes in the T4 medium had a statistically higher survival rate than the other groups, we suggested that these differences would not present potential clinical relevance. The results of mitochondrial activity reveal that there is an important difference between control and vitrified oocytes with or without supplements in the efficiency of mitochondrial function, regulation of the redox state and intracellular control of ROS, demonstrating that more work is needed to understand this metabolic pathway and the different effects of the vitrification media.

This retrospective study compared rates of fertilization, cleavage and quality of human embryos obtained by intracytoplasmic sperm injection (ICSI), with sperm from ejaculate, epididymis and testis. A total of 398 cycles of patients with some kind of male infertility were included and 3991 oocytes were inseminated. The spermatozoa from epididymis and testis were surgically obtained. Fertilization and cleavage rates with sperm from ejaculate (75% and 73%, respectively) were higher (P<0,0001) than those with sperm from the testis (59,7% e 56,8%, respectively) and from epididymis (61,9% e 59,3%). The production of viable embryos (grade I and II) was higher (P=0,0135) when the oocytes where inseminated with ejaculate sperm (89,4%) in relation to sperm from epididymis (82,9%) and testis (85,7%).The percentages of pregnancy were not different among groups (37,8% EJAC group, 27,6% EPID and 36,8% TEST group). In conclusion, sperm from ejaculate have a higher production of viable embryos. However, when sperm from the testis and epididymis are used for ICSI, the production of viable embryos is also considerable and can be seen as success in the assisted reproduction techniques. / Este estudo retrospectivo avaliou as taxas de fertilização, clivagem e qualidade de embriões humanos obtidos através da injeção intracitoplasmática (ICSI) de espermatozóides provenientes do ejaculado, epidídimo ou testículo. Foram incluídos 398 ciclos de pacientes que apresentaram algum tipo de infertilidade masculina, sendo inseminados 3991 oócitos. Os espermatozóides do epidídimo e do testículo foram recuperados cirurgicamente. As taxas de fertilização e de clivagem com espermatozóides do ejaculado (74,5% e 73%, respectivamente) foram maiores (P<0,0001) do que as do testículo (59,7% e 56,8%, respectivamente) e do epidídimo (61,9% e 59,3%). A produção de embriões viáveis (grau I e II) foi maior (P = 0,0135) quando os oócitos foram inseminados com espermatozóides do ejaculado (89,4%), em relação ao epidídimo (82,9%) e testículo (85,7%). As taxas de gestação não foram diferentes entre os grupos (37,8% no grupo EJAC, 27,6% EPID e 36,8% no grupo TEST). Em conclusão, espermatozóides do ejaculado produzem um maior número de embriões viáveis, com maiores taxas de fertilização e de clivagem. Entretanto, quando utilizados espermatozóides do epidídimo e do testículo na ICSI, a produção de embriões viáveis é considerável, obtendo êxito nas técnicas de reprodução assistida.