Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-12-02Bitstream added on 2014-06-13T19:38:31Z : No. of bitstreams: 1 sudano_mj_me_botfmvz.pdf: 7109768 bytes, checksum: 58bfc3ebf81e7505118cc8f8b907a3a3 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi avaliar a suplementação de diferentes concentrações de soro fetal bovino (SFB) e do etossulfato de fenazina (PES), no meio de cultivo durante a produção in vitro (PIV) de embriões bovinos. Em um experimento fatorial 4x3, quatro concentrações de SFB (0%, 2,5%, 5% e 10%), e três períodos de exposição ao PES (Controle, a partir do 60 horas – PES D2,5, e a partir 96 horas – PES D4, de cultivo) foram avaliados sobre o desenvolvimento, acúmulo lipídico, criotolerância, e apoptose celular de embriões frescos e aquecidos. Tomando a fertilização in vitro como referência (D0), no D7 uma amostra dos embriões foi submetida a coloração de Sudan Black B (quantificação do conteúdo lipídico, n=15-60), e a técnica de TUNEL (apoptose, n=15-134). Os demais embriões (n=2647) foram vitrificados, para posterior aquecimento e re-cultivo em SOFaa a 10% de SFB por 12 horas. Passado este período, os embriões aquecidos foram avaliados quanto a re-expansão da blastocele e submetidos a técnica de TUNEL. Para a análise estatística, foi realizada ANOVA seguida do teste de Tukey, ou Kruskal-Wallis seguido do teste de Dunn. Para análise da correlação foi utilizado o teste de correlação linear de Pearson. Foi adotado o nível de significância de 5%. A elevação da suplementação do SFB no meio de cultivo embrionário aumentou (P<0,05) o número de gotas lipídicas citoplasmáticas pequenas, médias e grandes. Além disso, esta elevação do SFB reduziu (P<0,05) a taxa de re-expansão dos embriões vitrificados e aumentou (P<0,05) a taxa de apoptose dos embriões frescos e aquecidos. A adição do PES ao meio de cultivo a partir do D2,5 e a partir do D4 reduziram (P<0,05) o acúmulo lipídico nos embriões bovinos PIV. O uso do PES a partir do D2,5 prejudicou (P<0,05) o desenvolvimento embrionário e não favoreceu (P>0,05) a criotolerância... / The objective of this study was to evaluate the effect of four FCS concentrations and the use of phenazine ethosulfate (PES) in the culture media during in vitro production (IVP) of bovine embryos. In a 4x3 factorial experimental design, four FCS concentrations (0%, 2,5%, 5% and 10%), and three PES exposure periods (control, after 60 hours - PES D2,5, and after 96 hours - PES D4, of embryo culture) were evaluated by embryo development, lipid accumulation, cryotolerance, and fresh and warmed apoptosis. Taking the in vitro fertilization as reference (D0), a sample of D7 embryos was submitted to Sudan Black B stain (lipid content, n=15-60), and to TUNEL reaction (apoptosis, n=15-134). The remaining embryos (n=2647) were vitrified / warmed and re-cultured in SOFaa with 10% of FCS for 12 hours. After this period, re-expansion and warmed apoptosis rate were determined. For statistical analysis, data were tested using ANOVA followed by Tukey´s test, or Kruskal-Wallis followed by Dunn´s test. For correlation analysis Pearson correlation test was used. It was adopted the significance level of 5%. The raise of FCS concentration increased (P<0.05) the number of small, medium and large cytoplasmic lipid droplets. Moreover, this raise of FCS reduced (P<0.05) the re-expansion rate and increased (P<0.05) the fresh and warmed apoptosis rate. The addition of PES in the culture media from D2,5 and D4 reduced (P<0.05) the lipid accumulation. The use of PES from D2,5 affected (P<0.05) embryo development and did not improve (P>0.05) cryotolerance. However, the PES treatment that started at D4 did not affect (P>0.05) embryo development and increased (P<0.05) embryo survival after vitrification. The increase of lipid accumulation had a strong and a moderate correlation with fresh and warmed apoptosis, respectively. However, the fresh apoptosis rate had a very strong correlation with the warmed apoptosis... (Complete abstract, click electronic access below)

Orientador: Paulo Henrique Franceschini / Banca: Francisco Guilherme Leite / Banca: Erika da Silva Carvalho Morani / Resumo: A transferência de embrião é uma biotecnologia muito utilizada na atualidade, mas pouco se sabe sobre o local ideal para se depositar o embrião no corno uterino ipsilateral ao corpo lúteo (CL) e se há alguma alteração morfofuncional ao longo desse corno que possa comprometer ou favorecer o ambiente uterino. Os objetivos do presente experimento foram: avaliar as taxas de concepção após inovulação nos terços cranial, médio e caudal do corno uterino ipsilateral ao CL; analisar a morfologia desses três segmentos tanto do corno uterino adjacente quanto ao oposto ao CL através da microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura; estabelecer uma relação entre as taxas de concepção e as características morfofuncionais para indicar o local ideal de inovulação. Para isso, 600 embriões produzidos in vivo (frescos e congelados/descongelados) e 315 produzidos in vitro, foram transferidos para receptoras holandesas e mestiças, respectivamente. O estudo morfológico analisou os úteros de 9 novilhas mestiças abatidas aproximadamente no sétimo dia do ciclo estral, ou seja, simulando uma receptora no dia da inovulação. Os resultados obtidos mostraram que no verão o local de inovulação não influenciou (P>0,05) as taxas de concepção das receptoras que receberam embriões produzidos in vivo. No inverno melhores taxas de concepção (P<0,05) foram alcançadas quando os embriões foram depositados na porção caudal em relação à cranial. Para os embriões produzidos in vitro, o local de inovulação (P>0,05) não interferiu nos resultados reprodutivos. Por meio da histologia e microscopia eletrônica de varredura foi observado um padrão morfológico similar entre as três porções do corno uterino ipsilateral ao CL. No entanto, a contagem de vasos sanguíneos mostrou... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Nowadays the embryo transfer is a biotechnology widely used, however not much is know about the best place to put embryos into the uterine horn ipsilateral to the corpus luteum (CL). In addition, not much is known about the morphological characteristics thorough the uterine horn and if it could improve or damage the uterine environment. The aims of this study were: to investigate the effect of the site of embryo placement (cranial, medial or caudal) into the uterine horn adjacent to the CL on pregnancy rates; to analyze the morphology from these tree portions of the both uterine horns adjacent and opposite to CL using histology and scanning electron microscopy; and establish the relation between pregnancy rates and morphofunctions characteristics to indicate the best place to transfer embryos. In this study 600 in vivo produced embryos (fresh and frozen-thawed) and 315 in vitro produced embryos were transferred to Holstein and crossbred recipients, in order. Nine crossbred heifers were slaughtered approximately seven days after estrus and the uterus were studied to analyze its morphology at the same time that the embryos have been transferred. The results showed that the site of embryo placement did not influence (P>0.05) the pregnancy rates in recipients receiving fresh embryos during summertime. During the winter, the pregnancy rates were greater (P<0.05) for fresh embryos transferred into the caudal portion of the uterus horn than cranial portion. For animals that received in vitro produced embryo, the site of embryo placement did not interfere (P>0.05) in the pregnancy rates. Morphophological characteristics observed by histology and scanning electron microscopy was similar in all parts of the uterine horn ipsilateral to the CL studied. However, the average number of blood vessels counted was lower in the contralateral... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2004Bitstream added on 2014-06-13T20:19:20Z : No. of bitstreams: 1 leal_ls_me_botfmvz.pdf: 1475432 bytes, checksum: 51e04a53c075c65b9b187c96415fdb1f (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP)

Orientador : Eunice Oba / Mestre

Orientador: Maria Luiza Silveira Mello / Dissertação (mestrado) - Universidade Estadual de Campinas, Instituto de Biologia / Made available in DSpace on 2018-07-24T12:20:47Z (GMT). No. of bitstreams: 1 Randi_MarcoAntonioFerreira_M.pdf: 9133002 bytes, checksum: 9d0606f3199f06a59a67b7a86a3f9552 (MD5) Previous issue date: 1990 / Resumo: Culturas de mioblastos de embrião de galinha com 9 dias de idade, mantidas por 20 horas a '37 GRAUS C' e submetidas a um choque de temperatura de '44 GRAUS C' por 1h30min, foram estudadas quanto a suas propriedades de basofilia (afinidade pelo azul de toluidina e pelo acridine orange), frequência de fenótipos nucleares, índices mitóticos e micronucleação. Estas características foram também investigadas em culturas retornadas por 8h as condições controle após o choque hipertérmico. Constatou-se que a basofilia nuclear e citoplasmática, incluindo-se a distribuição global de RNA, não apareceu visualmente alterada. Isto indica, de um lado, não ter havido, com o choque, modificação na disponibilidade de grupos fosfato do DNA na cromatina. De outro lado, parece indicar pouca sensibilidade do método, nas condições de observação e no material utilizados, para constatar alterações mais sutis em tipos e/ou conteúdo de RNA. Com o choque foram promovidas alterações na frequência de alguns fenótipos nucleares dos mioblastos. Isto sugere uma tendência modificação nos processos de diferenciação celular, incluindo-se um possível aumento em poliploidia. Esse fenômeno, no entanto, não chegou a afetar a cinética de ciclo celular, visto não terem sido encontradas diferenças em índices mitóticos com o choque e/ou recuperação pós-choque. Houve uma diminuição na frequência de micronúcleos nas culturas submetidas à recuperação pós-choque em relação às submetidas ao choque, salientando assim um retorno a melhores condições ambientais para o crescimento celular e talvez um aumento da estabilidade celular que pode ser consequência do choque / Abstract: Nine-day-old chicken embryo myoblast cultures carried out 20h at '37 DEGREE C' and exposed to a '44 DEGREE C' thermal shock for 1h30min were studied with the aim of detecting their properties of basophilia (toluidine blue and acridine orange binding), frequency of nuclear phenotypes, mitotic rates, and micronucleation. These characteristics were also investigated in cultures that were returned to control conditions for 8h after the thermal shock. There was visual evidence that nuclear and cytoplasmic basophilia, including RNA entire distributions, were not changed. This demonstrated that no modification on the availabiliy of DNA phosphate groups ocurred in the chromatin with the thermal shock. In addition, it may indicate a less sensitivity of the method, under the conditions used in this investigation, to verify light changes in RNA types and/or content. The thermal shock promoted alterations in the frequency of some nuclear phenotypes of the myoblasts. This suggests a tendency to changes increase in cellular differentiation processes, including a the cell polyploidy. This phenomenon, however, possible did not apparently affect the cell cycle kinetics, since no differences in the mitotic rates were found in heat-shocked cells and/or cells under recovering conditipns. There was a decrease in the micronucleation frequency in the cultures subjected to recovery after the heat-shock, when compared to that of cells exposed to hyperthermia, which is assumed to be due to an improvement in enviromental conditions for cell growth and possibly, increase in cell stabiliy as a consequence of the temperature shock / Mestrado / Biologia Celular / Mestre em Ciências Biológicas

Submitted by Marco Antônio de Ramos Chagas (mchagas@ufv.br) on 2017-07-12T13:17:17Z No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 488547 bytes, checksum: a7fbaa314f939c6c53e6e3f9fb18a826 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-07-12T13:17:17Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.PDF: 488547 bytes, checksum: a7fbaa314f939c6c53e6e3f9fb18a826 (MD5) Previous issue date: 2001-09-04 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / Devido à necessidade de se obter melhores taxas de prenhez após transferência de embriões pelo método não-cirúrgico, técnicas alternativas têm sido testadas, porém com resultados poucos satisfatórios. Dentro desse contexto, o presente estudo foi conduzido com o intuito de investigar a eficiência da técnica ultra-sonográfica de injeção intra-uterina via transvaginal “in vitro”, para validação da mesma e posterior utilização como técnica alternativa na transferência de embriões na espécie eqüina. Para isso, foram desenvolvidos três experimentos, utilizando-se genitálias de éguas provenientes de frigorífico (Experimentos 1, 2 e 3) e oócitos (Experimento 3) obtidos de folículos de ovários de genitálias e, ou aspirados de folículos de éguas “in vivo” por meio da técnica ultra-sonográfica. No Experimento 1, a alta taxa de sucesso (88%, 879/1000) na inserção de agulha e de tubo de teflon no lume do útero, por meio da técnica ultra-sonográfica de injeção intra-uterina via transvaginal, sugere a viabilidade do procedimento, o qual foi caracterizado por reduzido número de tentativas (1,04 ± 0,2) e mínimo tempo gasto (21,7 ± 0,3 seg) por injeção, quando o procedimento resultou em sucesso. Além disso, o emprego de um sistema de escores para determinar o grau de certeza do posicionamento da agulha e do tubo no lume uterino, visualizados no monitor do ultra-som, permitiu maior eficiência da técnica. principal objetivo foi determinar No Experimento 2, o o volume mínimo de fluido injetado no lume uterino de genitálias, capaz de ser visualizado na tela do ultra-som durante e após a injeção do veículo (tinta guache branca). Verificou-se que os volumes de 0,5 e 1,0 mL resultaram em taxas de sucesso de 88,5% (261/295) e 91,2% (269/295), respectivamente. Porém, o volume de 1,0 mL mostrou ser mais adequado para a visualização do fluido no momento da injeção, enquanto o volume de 0,5 mL foi mais fácil de ser visualizado após a injeção. No Experimento 3, a eficiência da técnica foi testada na deposição de oócitos no lume uterino. A taxa de sucesso foi menor (75%, 45/60) quando comparada aos experimentos anteriores. No entanto, a taxa de sucesso baseou-se na recuperação de pelo menos um oócito, após duas lavagens uterinas e não no sucesso em depositar os oócitos de forma adequada no lume uterino. Sendo assim, provavelmente, outros fatores tenham afetado a recuperação dos oócitos, o que interferiu nas taxas de sucesso deste experimento. Com base nos resultados do presente estudo, com taxas de sucesso variando de 75,0 a 89,8%, pode-se sugerir que a técnica ultra-sonográfica de injeção intra-uterina via transvaginal “in vitro” é um procedimento viável. O reduzido número de tentativas/injeção e o mínimo tempo gasto para a execução da técnica representam papel importante para que esse procedimento seja utilizado “in vivo”. técnica testada nesse experimento pode tornar-se mais uma Finalmente, a alternativa para transferência não-cirúrgica de embriões em éguas e quem sabe, também, em outras espécies. Isso se deve ao fato desta técnica ser de rápida execução e, principalmente, por evitar manipulações cervicais, comumente suspeitas de interferirem negativamente nas taxas de prenhez, quando do ato da transferência não-cirúrgica de embriões. / The necessity in obtaining higher pregnancy rates after non-surgical embryo transfer has induced the development of some research on this field. The objective of the present study was to develop and to evaluate, the efficiency of the transvaginal ultrasound-guided intrauterine injection technique in vitro, for a subsequent use as an alternative procedure for embryo transfer in mares. Three experiments were developed using genital tracts of mares (Experiments 1, 2 and 3) and oocytes (Experiment 3) obtained from aspirated follicles. In Experiment 1, the successful rate of insertion of the needle and tube into the uterine lumen in vitro was 87.9% (879/1000). The averages of the certainty scores that resulted in successful (4.0) and not successful (3.7) were different (P<0.001). The high degree of certainty (score 4) resulted in a larger number of successful injections (89.7%, 834/930). This result suggests that the development of visual pattern by scores can be useful to predict the efficiency of this technique. procedure required on average 21.7 ± 0.3 sec/injection. The Difference (P<0.001) was observed among the time for the successful injections (21.0 ± 0.3 sec) versus not successful (26.0 ± 1.2 sec). The viability of the procedure, was also characterized by reduced number of attempts (1.0 ± 0.2) per injection, when the procedure resulted in success. In Experiment 2, 40 genital tracts were used to determine the amount of vehicle to be visualized in the ultrasound image and to be detected in the opened uterine lumen. A white water color was used as vehicle. Two volumes of vehicle were tested: 1) 0.5 mL and 2) 1.0 mL, with 25 to 30 injections/session in each volume. The successful rate (89.8%, 530/590) to deliver the vehicle into the uterus was similar to that obtained in Experiment 1. No difference was detected between the 2 injected volumes. When 1.0 mL was injected, there was a larger relationship (P<0.003) between the visualization of the fluid during the injection and the successful rate of the procedure. However, the visualization of the fluid on the ultrasound immediately after the injection was facilitated (P<0.01) by the smaller volume (0.5 mL), probably due to a slower diffusion. In Experiment 3, 60 injections with a pool of 4 to 5 oocytes per injection were performed to test the capability of the technique to deliver oocytes into the uterus. The successful rate of depositing oocytes into the uterus was 75% (45/60). A lower efficiency rate obtained in this experiment was probably due to other factors involved in the recovery of oocytes. On average, 2.1 ± 1.5 (73.3%) and 0.1 ± 0.4 (6.7%) oocytes were recovered from the first and second flushing, respectively. The range of successful rates (75.0 to 89.8%), of the present study “in vitro” suggests that the transvaginal ultrasonographic technique is a viable procedure. The reduced number of attempts/injection and the short time needed for the procedure may be important for the use of this technique “in vivo”. This study suggests that the transvaginal ultrasound- guided intrauterine injection may have the potential of becoming one more alternative for embryo transfer. In addition, this technique could avoid cervical manipulations, release of PGF2α and oxitocin, uterine infection and refluxes of embryos through the cervix, commonly suspected of interfering negatively in pregnancy rates, after a non- surgical embryo transfer in mares. / Dissertação importada do Alexandria

Orientador: Fernanda da Cruz Landin e Alvarenga / Banca: Roberto Sartori Filho / Banca: Rui Machado / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar a suplementação de diferentes concentrações de soro fetal bovino (SFB) e do etossulfato de fenazina (PES), no meio de cultivo durante a produção in vitro (PIV) de embriões bovinos. Em um experimento fatorial 4x3, quatro concentrações de SFB (0%, 2,5%, 5% e 10%), e três períodos de exposição ao PES (Controle, a partir do 60 horas - PES D2,5, e a partir 96 horas - PES D4, de cultivo) foram avaliados sobre o desenvolvimento, acúmulo lipídico, criotolerância, e apoptose celular de embriões frescos e aquecidos. Tomando a fertilização in vitro como referência (D0), no D7 uma amostra dos embriões foi submetida a coloração de Sudan Black B (quantificação do conteúdo lipídico, n=15-60), e a técnica de TUNEL (apoptose, n=15-134). Os demais embriões (n=2647) foram vitrificados, para posterior aquecimento e re-cultivo em SOFaa a 10% de SFB por 12 horas. Passado este período, os embriões aquecidos foram avaliados quanto a re-expansão da blastocele e submetidos a técnica de TUNEL. Para a análise estatística, foi realizada ANOVA seguida do teste de Tukey, ou Kruskal-Wallis seguido do teste de Dunn. Para análise da correlação foi utilizado o teste de correlação linear de Pearson. Foi adotado o nível de significância de 5%. A elevação da suplementação do SFB no meio de cultivo embrionário aumentou (P<0,05) o número de gotas lipídicas citoplasmáticas pequenas, médias e grandes. Além disso, esta elevação do SFB reduziu (P<0,05) a taxa de re-expansão dos embriões vitrificados e aumentou (P<0,05) a taxa de apoptose dos embriões frescos e aquecidos. A adição do PES ao meio de cultivo a partir do D2,5 e a partir do D4 reduziram (P<0,05) o acúmulo lipídico nos embriões bovinos PIV. O uso do PES a partir do D2,5 prejudicou (P<0,05) o desenvolvimento embrionário e não favoreceu (P>0,05) a criotolerância... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of this study was to evaluate the effect of four FCS concentrations and the use of phenazine ethosulfate (PES) in the culture media during in vitro production (IVP) of bovine embryos. In a 4x3 factorial experimental design, four FCS concentrations (0%, 2,5%, 5% and 10%), and three PES exposure periods (control, after 60 hours - PES D2,5, and after 96 hours - PES D4, of embryo culture) were evaluated by embryo development, lipid accumulation, cryotolerance, and fresh and warmed apoptosis. Taking the in vitro fertilization as reference (D0), a sample of D7 embryos was submitted to Sudan Black B stain (lipid content, n=15-60), and to TUNEL reaction (apoptosis, n=15-134). The remaining embryos (n=2647) were vitrified / warmed and re-cultured in SOFaa with 10% of FCS for 12 hours. After this period, re-expansion and warmed apoptosis rate were determined. For statistical analysis, data were tested using ANOVA followed by Tukey's test, or Kruskal-Wallis followed by Dunn's test. For correlation analysis Pearson correlation test was used. It was adopted the significance level of 5%. The raise of FCS concentration increased (P<0.05) the number of small, medium and large cytoplasmic lipid droplets. Moreover, this raise of FCS reduced (P<0.05) the re-expansion rate and increased (P<0.05) the fresh and warmed apoptosis rate. The addition of PES in the culture media from D2,5 and D4 reduced (P<0.05) the lipid accumulation. The use of PES from D2,5 affected (P<0.05) embryo development and did not improve (P>0.05) cryotolerance. However, the PES treatment that started at D4 did not affect (P>0.05) embryo development and increased (P<0.05) embryo survival after vitrification. The increase of lipid accumulation had a strong and a moderate correlation with fresh and warmed apoptosis, respectively. However, the fresh apoptosis rate had a very strong correlation with the warmed apoptosis... (Complete abstract, click electronic access below) / Mestre

Submitted by Reginaldo Soares de Freitas (reginaldo.freitas@ufv.br) on 2017-06-19T13:08:45Z No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1210163 bytes, checksum: 95611e42b2fda44b48bbe7fdec603f37 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-06-19T13:08:45Z (GMT). No. of bitstreams: 1 texto completo.pdf: 1210163 bytes, checksum: 95611e42b2fda44b48bbe7fdec603f37 (MD5) Previous issue date: 2005-07-28 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / O estudo detalhado do processo de formação dos embriões somáticos e sua comparação morfológica com embriões zigóticos pode fornecer informações relevantes para o aumento ou a manipulação da resposta embriogênica e uma melhor conversão dos embriões somáticos em plantas, uma vez que a análise comparativa da estrutura e morfologia dos embriões somático e zigótico podem apontar falhas do processo da embriogênese somática. Portanto, o presente trabalho teve como objetivo o estudo morfoanatômico e histoquímico dos embriões somáticos e zigóticos de jabuticaba- branca, a fim de determinar as possíveis causas da baixa conversão em plântulas de embriões somáticos de jabuticabeiras. Foram coletados frutos maduros de jabuticaba- branca, sendo as sementes retiradas manualmente. Depois de retirada a mucilagem, parte das sementes foi utilizada para extração do embrião zigótico para o estudo morfoanatômico e histoquímico e parte para obtenção de embriões somáticos. Estes embriões foram obtidos “in vitro”, a partir de cotilédones de embriões zigóticos. Para o estudo anatômico e histoquímico, o material vegetal foi fixado em FAA50% e estocado em etanol 70%. O material vegetal foi incluído em glicol-metacrilato e seccionado transversal e longitudinalmente, em micrótomo rotativo, com 6 μm de espessura. As lâminas com os cortes foram submetidas ao azul-de-toluidina para metacromasia e ao regente de lugol, para detecção de amido, e montadas em resina sintética. Os cortes foram analisados e fotografados em fotomicroscópio com sistema U-photo, câmera e microcomputador com o software Spot-Basic. Para a microscopia eletrônica de varredura, embriões somáticos foram fixados em glutaraldeído 3%, em tampão cocodilato de sódio 0,1 M a 4 oC, desidratados em série etanólica, seguida de secagem em ponto crítico de CO2 líquido. As amostras foram preparadas nos suportes, cobertas com ouro, observadas e fotografadas em microscópio eletrônico de varredura. Análises histológicas apontaram desenvolvimento dos pró-embriões, os quais dão origem a embriões somáticos morfologicamente semelhantes a embriões zigóticos, porém os embriões zigóticos apresentam um procâmbio bem mais desenvolvido e grande quantidade de material de reserva e tamanho 10 vezes maior que os embriões somáticos. Nas análises histológicas dos embriões somáticos, observaram-se diversas anomalias, o que impediu a conversão desses embriões em plântulas. Além dessas anomalias, a falta de meristema apical e o procâmbio bem menos desenvolvido do que nos embriões zigóticos também colaboraram com a baixa conversão em plântulas. As análises histoquímicas dos embriões somáticos e zigóticos comprovaram que o material de reserva de ambos é o amido, porém, nos embriões somáticos, a quantidade de amido é menor e de ocorrência esporádica, sendo uma das causas da baixa conversão em plântulas. Através das análises histológicas, observou-se que os embriões somáticos passam pelos diferentes estádios de desenvolvimento globular, cordiforme, torpedo e cotiledonar, à semelhança dos embriões zigóticos. Existem semelhanças na morfologia dos embriões somáticos e zigóticos, ambos com desenvolvimento de um par de cotilédones e eixo embrionário reduzido. / The detailed study of somatic embryo formation and its morphological comparison with zygotic embryos can elicit relevant information to the increase or manipulation of the embryogenic response and a better conversion of somatic embryos to plants, once the comparative analysis of the structure and morphology of the somatic and zygotic embryos can show defects in somatic embryogenesis. Therefore, the objective of the present work was the morphoanatomical and histochemical study of somatic and zygotic embryos of white-jaboticaba, in order to determine the possible causes of the low conversion of jaboticaba somatic embryos to plantlets. Ripe fruits were collected from white-jaboticaba trees, with seeds removed by hand. After removing the mucilage, part of the seeds was used for zygotic embryo extraction for morphoanatomical and histochemical studies, and part for obtaining somatic embryos. "In vitro" somatic embryos were obtained from cotyledons of zygotic embryos. The material was fixed in FAA50% and stored in 70% ethanol for anatomical and histochemical studies. The material was embedded in glycol methacrylate and 6 μm- thick sections were transverse and longitudinally cut using a rotating microtome. The sections collected on glass slides and stained in toluidine blue, and lugol for starch detection, were mounted in synthetic resin. The sections were analyzed and photographed in a U-photo system light microscope, camera and microcomputer with the Spot-Basic software. For scanning electron microscopy, somatic embryos were fixed in 3% glutaraldehyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer at 4 oC, dehydrated through a graded ethanol series, followed by liquid CO2 critical point drying. The samples were mounted on the supports, coated with gold, observed and photographed in a scanning electronic microscope. The histological examination confirmed the development of pro- embryos, from which somatic embryos morphologically similar to zygotic embryos were produced, however the zygotic embryos presented a well developed procambium, a large amount of storage reserves and were tenfold larger than the somatic embryos. Histological analyses of somatic embryos showed several anomalies, which hindered the conversion of those embryos to plantlets. Besides the anomalies, the lack of apical meristem and the much less procambium developed than in the zygotic embryos also contribute to the low conversion to plantlets. The histochemical analyses of somatic and zygotic embryos proved that the storage reserves in both is starch, however, in somatic embryos, the amount of starch is smaller and of sporadic occurrence, being one of the causes of the low conversion to plantlets. Histological analyses showed that somatic embryos progress through different stages of development such as globular, heart shape, torpedo and cotyledonary, similar to zygotic embryos. The morphology of somatic and zygotic embryos is similar, both developing a pair of cotyledons and reduced embryonic axis.

Orientadora: Prof. Dra. Marcella Pecora Milazzotto. / Dissertação (mestrado) - Universidade Federal do ABC, Programa de Pós-Graduação em Biotecnociência, 2015. / A bioenergia destaca-se como um substituto relevante para os combustíveis fósseis e os A capacidade de selecionar o embrião com maior viabilidade para transferência às receptoras é um componente crucial para o sucesso das técnicas de reprodução assistida. Atualmente, avaliações morfológicas são utilizadas para selecionar os embriões com maior potencial de implantação, e apesar de se tratar de um método não invasivo e relativamente bem sucedido, ainda apresenta uma série de limitações. Nos últimos anos, o desenvolvimento de novas tecnologias tem possibilitado análises quantitativas e qualitativas para determinação da viabilidade dos embriões para melhoria da seleção embrionária. Em especial as tecnologias espectroscópicas e espectrométricas permitiram o desenvolvimento de novos métodos para a caracterização embrionária e predição do potencial de estabelecimento da prenhez. Assim, o objetivo deste trabalho foi a caracterização não invasiva de embriões bovinos pela análise dos perfis espectroscópicos e espectrométricos dos meios de cultivo de embriões com diferentes cinéticas de desenvolvimento visando a obtenção de padrões específicos baseados no fenótipo embrionário. Para isso, embriões bovinos foram produzidos in vitro por protocolos convencionais. Os zigotos foram transferidos para meios de cultivo individualmente e classificados em dois grupos: rápido (4 células-40hpi) e lento (2 ou 3 células-40hpi). Os meios de cultura foram coletados às 40, 96 e 168 horas pós-inseminação (hpi), tranferidos para criotubos e congelados a -80ºC até o momento das análises. A análise do metaboloma embrionário foi realizada por espectroscopia Raman. Para tal, gotas de meios de cultura foram cobertas com óleo mineral, sendo escaneadas por um sistema Raman triplo. Os dados foram normalizados e analisados por Análises de Componentes Principais (PCA), de Agrupamentos (Clusters) e por Loading plot. A análise do secretoma embrionário foi feita por MALDI-MS-TOF, através da extração dos metabólitos, sendo os espectros adquiridos pelo espectrômetro em modo de ionização positiva. Foram feitas analises estatísticas univariadas e multivariadas pelo software online Metaboanalyst. Os resultados obtidos pela espectroscopia Raman e espectrometria de massas demonstram que embriões com diferentes cinéticas de desenvolvimento possuem diferentes perfis espectroscópicos e espectrométricos ao longo do desenvolvimento embrionário, indicando que estes embriões consomem e/ou produzem diferencialmente metabólitos nos meios de cultura. Com base em nossos resultados, propomos com este estudo que a análise dos meios de cultura por espectroscopia Raman pode ser utilizada para fins de diagnóstico embrionário, pois permite uma caracterização rápida e global dos perfis embrionários relacionados a cinética, enquanto a espectrometria de massas pode ser utilizada para caracterização qualitativa dos embriões, permitindo a identificação do secretoma de embriões durante o cultivo in vitro. / The ability to select embryo with greater viability to transfer to the receptors is a crucial component to the success of assisted reproduction techniques. Currently, morphological assessments are used to select embryos with the highest implantation potential, although it¿ s a noninvasive and relatively successful, has still a number of limitations. In recent years, the development of new technologies has enabled quantitative and qualitative analyzes for the determination of viability of embryos to improve embryo selection. In particular spectroscopic and spectrometric technologies have permitted the development of new methods for embryo characterization and prediction of potential establishment of pregnancy. The objective of this study was non-invasive characterization of bovine embryos by analysis of spectroscopic and spectrometric profiling of embryo culture media with different kinetics of development in order to obtain specific patterns based on embryonic phenotype. For this, bovine embryos were produced in vitro by standard protocols. The zygotes were transferred to individual culture medium and divided into two groups: Fast (4 cells-40hpi) and slow (2 or 3 cells-40hpi). The culture media were collected at 40, 96 and 168 hours post-insemination (hpi) tranfered to cryotubes and frozen at -80 until the time of analysis. The analysis of the metabolome embryo was made by Raman spectroscopy. For this, droplets of culture media were overlaid with mineral oil being scanned by a triple Raman system. The data were normalized and analyzed by Principal Component Analysis (PCA), clusters and Loading plot. Analysis of embryonic secretome was made by MALDI-TOF-MS, through the extraction of the metabolites, and the spectra acquired by the spectrometer in positive ionization mode. Analyzes were performed univariate and multivariate statistics by the online software Metaboanalyst. The results obtained by Raman spectroscopy and mass spectrometry demonstrated that the development of embryos with different kinetics have different spectroscopic and spectrometric profiles during embryonic development, indicating that these embryos consume and /or produce differentially metabolites in the culture media. Based on our results, we propose that the analysis of Raman spectroscopy culture media may be used for diagnostic purposes embryo, since it allows a fast and comprehensive characterization of embryonic profiles related to kinetics, while mass spectrometry can be used for qualitative characterization of the embryo, allowing the identification of secretome embryo during in vitro culture.

Com o objetivo de se produzir gestação gemelar em bovinos de corte, à nível comercial, foram utilizadas cinco vacas 1/2 Nelore x 1/2 Red Angus, ciclando naturalmente. As vacas foram sincronizadas, empregando-se implante de Norgestomet (3 mg) e simultaneamente usou-se 3 mg de Norgestomet e 5 mg de Valerato de Estradiol injetável no dia 0. No 5° dia iniciou-se a superovulação usando- se 350 UI de FSH em doses decrescentes durante 4 dias. No 7° dia retirou-se o implante e 50 e 60 horas após foram feitas as IA com sêmen de touro para pelagem vermelha (Limousin). Sete dias após a 1ª IA as vacas foram coletadas, usando-se catéter, equipo de coleta e filtro para embriões descartáveis. Este material foi reutilizado para coletar as 5 doadoras. Foram coletados e congelados 34 embriões viáveis, obtendo-se a média de 6,8 por doadora. Trinta e quatro vacas da raça Nelore foram inseminadas com sêmen de Aberdeen Angus no cio natural e 7 dias após esses animais receberam 1 embrião inovulado via transcervical no corno contra lateral ao ovário com CL. Com esta sistemática as vacas que pariram bezerros com pelagem preta eram frutos da IA e os de pelagem vermelha da inovulação embrionária. Das parturições, 12 vacas geraram somente bezerro de pelagem preta (35,3%), 3 vacas pariram somente bezerro de pelagem vermelha (8,9%), 13 vacas pariram bezerro de pelagem vermelha e bezerro de pelagem preta (38,2%), 4 vacas tiveram abortamento entre o 6° e 7° mês (11, 7%); dessas vacas, 2 abortaram 2 bezerros cada uma e 2 abortaram somente 1. Duas vacas estavam vazias no 45° dia após a inovulação embrionária (5,9%). Obteve-se 25 bezerros oriundos da IA (pelagem preta) (73,53%) e 16 bezerros da IE (pelagem vermelha) (47,05%). O total de bezerros nascidos foi de 41 (= taxa de natalidade 120,58%). Ao final do 4° mês de observação dos bezerros nascidos, restaram 36 (105,58%); supõe-se que se no experimento fossem utilizadas matrizes receptoras com maior aptidão leiteira, essa mortalidade teria sido evitada, em função da baixa produção leiteira da raça Nelore. Concluiu-se que a produção de prenhez gemelar em bovinos de corte à nível comercial é viável técnica e economicamente, desde que utilize-se touros reprodutores que gerem bezerros relativamente pequenos