Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:16Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2010-12-02Bitstream added on 2014-06-13T19:38:31Z : No. of bitstreams: 1 sudano_mj_me_botfmvz.pdf: 7109768 bytes, checksum: 58bfc3ebf81e7505118cc8f8b907a3a3 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi avaliar a suplementação de diferentes concentrações de soro fetal bovino (SFB) e do etossulfato de fenazina (PES), no meio de cultivo durante a produção in vitro (PIV) de embriões bovinos. Em um experimento fatorial 4x3, quatro concentrações de SFB (0%, 2,5%, 5% e 10%), e três períodos de exposição ao PES (Controle, a partir do 60 horas – PES D2,5, e a partir 96 horas – PES D4, de cultivo) foram avaliados sobre o desenvolvimento, acúmulo lipídico, criotolerância, e apoptose celular de embriões frescos e aquecidos. Tomando a fertilização in vitro como referência (D0), no D7 uma amostra dos embriões foi submetida a coloração de Sudan Black B (quantificação do conteúdo lipídico, n=15-60), e a técnica de TUNEL (apoptose, n=15-134). Os demais embriões (n=2647) foram vitrificados, para posterior aquecimento e re-cultivo em SOFaa a 10% de SFB por 12 horas. Passado este período, os embriões aquecidos foram avaliados quanto a re-expansão da blastocele e submetidos a técnica de TUNEL. Para a análise estatística, foi realizada ANOVA seguida do teste de Tukey, ou Kruskal-Wallis seguido do teste de Dunn. Para análise da correlação foi utilizado o teste de correlação linear de Pearson. Foi adotado o nível de significância de 5%. A elevação da suplementação do SFB no meio de cultivo embrionário aumentou (P<0,05) o número de gotas lipídicas citoplasmáticas pequenas, médias e grandes. Além disso, esta elevação do SFB reduziu (P<0,05) a taxa de re-expansão dos embriões vitrificados e aumentou (P<0,05) a taxa de apoptose dos embriões frescos e aquecidos. A adição do PES ao meio de cultivo a partir do D2,5 e a partir do D4 reduziram (P<0,05) o acúmulo lipídico nos embriões bovinos PIV. O uso do PES a partir do D2,5 prejudicou (P<0,05) o desenvolvimento embrionário e não favoreceu (P>0,05) a criotolerância... / The objective of this study was to evaluate the effect of four FCS concentrations and the use of phenazine ethosulfate (PES) in the culture media during in vitro production (IVP) of bovine embryos. In a 4x3 factorial experimental design, four FCS concentrations (0%, 2,5%, 5% and 10%), and three PES exposure periods (control, after 60 hours - PES D2,5, and after 96 hours - PES D4, of embryo culture) were evaluated by embryo development, lipid accumulation, cryotolerance, and fresh and warmed apoptosis. Taking the in vitro fertilization as reference (D0), a sample of D7 embryos was submitted to Sudan Black B stain (lipid content, n=15-60), and to TUNEL reaction (apoptosis, n=15-134). The remaining embryos (n=2647) were vitrified / warmed and re-cultured in SOFaa with 10% of FCS for 12 hours. After this period, re-expansion and warmed apoptosis rate were determined. For statistical analysis, data were tested using ANOVA followed by Tukey´s test, or Kruskal-Wallis followed by Dunn´s test. For correlation analysis Pearson correlation test was used. It was adopted the significance level of 5%. The raise of FCS concentration increased (P<0.05) the number of small, medium and large cytoplasmic lipid droplets. Moreover, this raise of FCS reduced (P<0.05) the re-expansion rate and increased (P<0.05) the fresh and warmed apoptosis rate. The addition of PES in the culture media from D2,5 and D4 reduced (P<0.05) the lipid accumulation. The use of PES from D2,5 affected (P<0.05) embryo development and did not improve (P>0.05) cryotolerance. However, the PES treatment that started at D4 did not affect (P>0.05) embryo development and increased (P<0.05) embryo survival after vitrification. The increase of lipid accumulation had a strong and a moderate correlation with fresh and warmed apoptosis, respectively. However, the fresh apoptosis rate had a very strong correlation with the warmed apoptosis... (Complete abstract, click electronic access below)

Orientador: Fernanda da Cruz Landin e Alvarenga / Banca: Roberto Sartori Filho / Banca: Rui Machado / Resumo: O objetivo deste estudo foi avaliar a suplementação de diferentes concentrações de soro fetal bovino (SFB) e do etossulfato de fenazina (PES), no meio de cultivo durante a produção in vitro (PIV) de embriões bovinos. Em um experimento fatorial 4x3, quatro concentrações de SFB (0%, 2,5%, 5% e 10%), e três períodos de exposição ao PES (Controle, a partir do 60 horas - PES D2,5, e a partir 96 horas - PES D4, de cultivo) foram avaliados sobre o desenvolvimento, acúmulo lipídico, criotolerância, e apoptose celular de embriões frescos e aquecidos. Tomando a fertilização in vitro como referência (D0), no D7 uma amostra dos embriões foi submetida a coloração de Sudan Black B (quantificação do conteúdo lipídico, n=15-60), e a técnica de TUNEL (apoptose, n=15-134). Os demais embriões (n=2647) foram vitrificados, para posterior aquecimento e re-cultivo em SOFaa a 10% de SFB por 12 horas. Passado este período, os embriões aquecidos foram avaliados quanto a re-expansão da blastocele e submetidos a técnica de TUNEL. Para a análise estatística, foi realizada ANOVA seguida do teste de Tukey, ou Kruskal-Wallis seguido do teste de Dunn. Para análise da correlação foi utilizado o teste de correlação linear de Pearson. Foi adotado o nível de significância de 5%. A elevação da suplementação do SFB no meio de cultivo embrionário aumentou (P<0,05) o número de gotas lipídicas citoplasmáticas pequenas, médias e grandes. Além disso, esta elevação do SFB reduziu (P<0,05) a taxa de re-expansão dos embriões vitrificados e aumentou (P<0,05) a taxa de apoptose dos embriões frescos e aquecidos. A adição do PES ao meio de cultivo a partir do D2,5 e a partir do D4 reduziram (P<0,05) o acúmulo lipídico nos embriões bovinos PIV. O uso do PES a partir do D2,5 prejudicou (P<0,05) o desenvolvimento embrionário e não favoreceu (P>0,05) a criotolerância... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The objective of this study was to evaluate the effect of four FCS concentrations and the use of phenazine ethosulfate (PES) in the culture media during in vitro production (IVP) of bovine embryos. In a 4x3 factorial experimental design, four FCS concentrations (0%, 2,5%, 5% and 10%), and three PES exposure periods (control, after 60 hours - PES D2,5, and after 96 hours - PES D4, of embryo culture) were evaluated by embryo development, lipid accumulation, cryotolerance, and fresh and warmed apoptosis. Taking the in vitro fertilization as reference (D0), a sample of D7 embryos was submitted to Sudan Black B stain (lipid content, n=15-60), and to TUNEL reaction (apoptosis, n=15-134). The remaining embryos (n=2647) were vitrified / warmed and re-cultured in SOFaa with 10% of FCS for 12 hours. After this period, re-expansion and warmed apoptosis rate were determined. For statistical analysis, data were tested using ANOVA followed by Tukey's test, or Kruskal-Wallis followed by Dunn's test. For correlation analysis Pearson correlation test was used. It was adopted the significance level of 5%. The raise of FCS concentration increased (P<0.05) the number of small, medium and large cytoplasmic lipid droplets. Moreover, this raise of FCS reduced (P<0.05) the re-expansion rate and increased (P<0.05) the fresh and warmed apoptosis rate. The addition of PES in the culture media from D2,5 and D4 reduced (P<0.05) the lipid accumulation. The use of PES from D2,5 affected (P<0.05) embryo development and did not improve (P>0.05) cryotolerance. However, the PES treatment that started at D4 did not affect (P>0.05) embryo development and increased (P<0.05) embryo survival after vitrification. The increase of lipid accumulation had a strong and a moderate correlation with fresh and warmed apoptosis, respectively. However, the fresh apoptosis rate had a very strong correlation with the warmed apoptosis... (Complete abstract, click electronic access below) / Mestre

A produção in vitro (PIV) de embriões tem sido utilizada amplamente no Brasil como ferramenta para acelerar o melhoramento genético do rebanho. Quando associada à criopreservação, a PIV permite maior flexibilidade da biotecnologia e possibilita estabelecer um banco de embriões. Há a possibilidade que a alta sensibilidade à criopreservação dos embriões bovinos seja influenciada principalmente pela grande quantidade de lipídeos intracitoplasmáticos, sendo isso relacionado especialmente às condições de cultivo in vitro. O Etossulfato de Fenazina (PES) consiste em um regulador do metabolismo de lipídeos. Através da oxidação de NADPH, estimula a via da pentose-fosfato e assim inibe a síntese de ácidos graxos, podendo levar a efeitos benéficos na criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro. O Fator de transcrição denominado proteína de ligação do elemento regulatório de esterol (SREBP-1c), regula preferencialmente a transcrição de genes da síntese de triacilglicerol e fosfolipídios e, a enzima Estearoil Co-A desaturase (SCD1) promove a síntese de ácidos graxos monoinsaturados, conferindo fluidez às membranas celulares. O objetivo desse trabalho foi avaliar a suplementação de diferentes concentrações do etossulfato de fenazina (PES) no meio de cultivo, durante a produção in vitro de embriões bovinos, e verificar o efeito do PES na taxa de gestação, buscando melhorar a qualidade do embrião para a criopreservação através da redução do acúmulo de lipídeos. Foram avaliadas as taxas de desenvolvimento inicial de embriões produzidos in vitro provenientes de ovários de abatedouro, e as taxas de gestação com o uso de embriões bovinos produzidos in vitro a partir da Aspiração folicular de vacas Holandesas e vitrificados. A análise da expressão de genes relacionados com biossíntese de triacilglicerol, SCD1 e SREBP-1c, teve como finalidade auxiliar nos conhecimentos básicos dos mecanismos de ação do Etossulfato de Fenazina, e foi realizada através de PCR quantitativo em Tempo Real, utilizando pools de cinco embriões para cada grupo. Para a análise estatística, foi realizada ANOVA seguida de teste de médias, e o teste qui-quadrado para as taxas de gestação. Não houve diferença estatística na taxa de clivagem e blastocisto entre o grupo controle e os grupos tratados com 0,2µM; 0,3µM; 0,5µM de PES no meio de cultivo in vitro. A taxa de gestação, utilizando-se embriões criopreservados, transferidos para receptoras, não foi alterada pelo uso de PES. A expressão tanto do SREBP-1c, quanto da SCD1 manteve níveis similares na presença ou ausência de PES durante o cultivo in vitro. Sendo assim faz-se necessário novos estudos para investigar mais detalhadamente o mecanismo de ação do PES nos genes da via de biossíntese de lipídeos e se é viável sua utilização a campo. / The in vitro production (IVP) of embryos has been widely used in Brazil as a tool to accelerate the genetic breeding. When combined with cryopreservation, the IVP allows greater flexibility of biotechnology and enable to establish a bank of embryos. There is a possibility that the greater sensitivity to cryopreservation of bovine embryos is influenced mainly by the large amount of intracytoplasmic lipids, and that is especially related to in vitro culture conditions. The phenazine ethosulfate (PES) consists of a lipid metabolism regulator. By NADPH oxidation, stimulates the pentose-phosphate pathway and thus inhibits the fatty acids synthesis, leading to beneficial effects on cryopreservation of bovine embryos in vitro produced. The transcription factor called sterol regulatory element binding proteins (SREBP-1c), preferably regulates the gene transcription of phospholipids and triacylglycerol synthesis and the stearoyl-Co A desaturase (SCD1) enzyme promotes the monounsaturated fatty acids synthesis, giving fluidity to cell membranes. The aim of this study was to evaluate the supplementation of different concentrations of phenazine ethosulfate (PES) in the culture medium during in vitro production of bovine embryos, and determine the effect of PES in the pregnancy rate, aiming to improve the the embryo quality to cryopreservation by reducing the lipids accumulation. We evaluated the early development rates of in vitro produced embryos and pregnancy rates after inovulation of vitrified in vitro produced embryos derived from the Ovum Pick Up of Holstein cows. Expression analysis of triacylglycerol biosynthesis related genes, SCD1 and SREBP-1c, had the purpose to increase the basic knowledge on phenazine ethosulfate mechanisms of action, and was performed by Quantitative Real-Time PCR using pools of five embryos for each group. For statistical analysis, was performed ANOVA followed by mean test, and the chi-square test for pregnancy rates. There was no statistical difference in the cleavage rate and blastocyst rate between the control group and the groups treated with 0,2µM; 0,3µM; 0,5µM of PES in the medium in vitro culture. The pregnancy rate, using cryopreserved embryos transferred to recipient was not altered by the use of PES. The expression of the SREBP-1c as well as SCD1 remained similar in the presence or absence of the PES during in vitro cultivation. Therefore it is necessary further studies to investigate in more details the PES mechanism of action in the genes of lipid biosynthesis pathway and whether it is feasible to use the field.

A produção in vitro (PIV) de embriões tem sido utilizada amplamente no Brasil como ferramenta para acelerar o melhoramento genético do rebanho. Quando associada à criopreservação, a PIV permite maior flexibilidade da biotecnologia e possibilita estabelecer um banco de embriões. Há a possibilidade que a alta sensibilidade à criopreservação dos embriões bovinos seja influenciada principalmente pela grande quantidade de lipídeos intracitoplasmáticos, sendo isso relacionado especialmente às condições de cultivo in vitro. O Etossulfato de Fenazina (PES) consiste em um regulador do metabolismo de lipídeos. Através da oxidação de NADPH, estimula a via da pentose-fosfato e assim inibe a síntese de ácidos graxos, podendo levar a efeitos benéficos na criopreservação de embriões bovinos produzidos in vitro. O Fator de transcrição denominado proteína de ligação do elemento regulatório de esterol (SREBP-1c), regula preferencialmente a transcrição de genes da síntese de triacilglicerol e fosfolipídios e, a enzima Estearoil Co-A desaturase (SCD1) promove a síntese de ácidos graxos monoinsaturados, conferindo fluidez às membranas celulares. O objetivo desse trabalho foi avaliar a suplementação de diferentes concentrações do etossulfato de fenazina (PES) no meio de cultivo, durante a produção in vitro de embriões bovinos, e verificar o efeito do PES na taxa de gestação, buscando melhorar a qualidade do embrião para a criopreservação através da redução do acúmulo de lipídeos. Foram avaliadas as taxas de desenvolvimento inicial de embriões produzidos in vitro provenientes de ovários de abatedouro, e as taxas de gestação com o uso de embriões bovinos produzidos in vitro a partir da Aspiração folicular de vacas Holandesas e vitrificados. A análise da expressão de genes relacionados com biossíntese de triacilglicerol, SCD1 e SREBP-1c, teve como finalidade auxiliar nos conhecimentos básicos dos mecanismos de ação do Etossulfato de Fenazina, e foi realizada através de PCR quantitativo em Tempo Real, utilizando pools de cinco embriões para cada grupo. Para a análise estatística, foi realizada ANOVA seguida de teste de médias, e o teste qui-quadrado para as taxas de gestação. Não houve diferença estatística na taxa de clivagem e blastocisto entre o grupo controle e os grupos tratados com 0,2µM; 0,3µM; 0,5µM de PES no meio de cultivo in vitro. A taxa de gestação, utilizando-se embriões criopreservados, transferidos para receptoras, não foi alterada pelo uso de PES. A expressão tanto do SREBP-1c, quanto da SCD1 manteve níveis similares na presença ou ausência de PES durante o cultivo in vitro. Sendo assim faz-se necessário novos estudos para investigar mais detalhadamente o mecanismo de ação do PES nos genes da via de biossíntese de lipídeos e se é viável sua utilização a campo. / The in vitro production (IVP) of embryos has been widely used in Brazil as a tool to accelerate the genetic breeding. When combined with cryopreservation, the IVP allows greater flexibility of biotechnology and enable to establish a bank of embryos. There is a possibility that the greater sensitivity to cryopreservation of bovine embryos is influenced mainly by the large amount of intracytoplasmic lipids, and that is especially related to in vitro culture conditions. The phenazine ethosulfate (PES) consists of a lipid metabolism regulator. By NADPH oxidation, stimulates the pentose-phosphate pathway and thus inhibits the fatty acids synthesis, leading to beneficial effects on cryopreservation of bovine embryos in vitro produced. The transcription factor called sterol regulatory element binding proteins (SREBP-1c), preferably regulates the gene transcription of phospholipids and triacylglycerol synthesis and the stearoyl-Co A desaturase (SCD1) enzyme promotes the monounsaturated fatty acids synthesis, giving fluidity to cell membranes. The aim of this study was to evaluate the supplementation of different concentrations of phenazine ethosulfate (PES) in the culture medium during in vitro production of bovine embryos, and determine the effect of PES in the pregnancy rate, aiming to improve the the embryo quality to cryopreservation by reducing the lipids accumulation. We evaluated the early development rates of in vitro produced embryos and pregnancy rates after inovulation of vitrified in vitro produced embryos derived from the Ovum Pick Up of Holstein cows. Expression analysis of triacylglycerol biosynthesis related genes, SCD1 and SREBP-1c, had the purpose to increase the basic knowledge on phenazine ethosulfate mechanisms of action, and was performed by Quantitative Real-Time PCR using pools of five embryos for each group. For statistical analysis, was performed ANOVA followed by mean test, and the chi-square test for pregnancy rates. There was no statistical difference in the cleavage rate and blastocyst rate between the control group and the groups treated with 0,2µM; 0,3µM; 0,5µM of PES in the medium in vitro culture. The pregnancy rate, using cryopreserved embryos transferred to recipient was not altered by the use of PES. The expression of the SREBP-1c as well as SCD1 remained similar in the presence or absence of the PES during in vitro cultivation. Therefore it is necessary further studies to investigate in more details the PES mechanism of action in the genes of lipid biosynthesis pathway and whether it is feasible to use the field.