Made available in DSpace on 2014-06-11T19:29:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-06-26Bitstream added on 2014-06-13T20:38:42Z : No. of bitstreams: 1 pieroni_jsp_me_jabo.pdf: 3471756 bytes, checksum: 000592186015a6bd6192107d9e1ae0c6 (MD5) / Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) / A transferência de embrião é uma biotecnologia muito utilizada na atualidade, mas pouco se sabe sobre o local ideal para se depositar o embrião no corno uterino ipsilateral ao corpo lúteo (CL) e se há alguma alteração morfofuncional ao longo desse corno que possa comprometer ou favorecer o ambiente uterino. Os objetivos do presente experimento foram: avaliar as taxas de concepção após inovulação nos terços cranial, médio e caudal do corno uterino ipsilateral ao CL; analisar a morfologia desses três segmentos tanto do corno uterino adjacente quanto ao oposto ao CL através da microscopia de luz e microscopia eletrônica de varredura; estabelecer uma relação entre as taxas de concepção e as características morfofuncionais para indicar o local ideal de inovulação. Para isso, 600 embriões produzidos in vivo (frescos e congelados/descongelados) e 315 produzidos in vitro, foram transferidos para receptoras holandesas e mestiças, respectivamente. O estudo morfológico analisou os úteros de 9 novilhas mestiças abatidas aproximadamente no sétimo dia do ciclo estral, ou seja, simulando uma receptora no dia da inovulação. Os resultados obtidos mostraram que no verão o local de inovulação não influenciou (P>0,05) as taxas de concepção das receptoras que receberam embriões produzidos in vivo. No inverno melhores taxas de concepção (P<0,05) foram alcançadas quando os embriões foram depositados na porção caudal em relação à cranial. Para os embriões produzidos in vitro, o local de inovulação (P>0,05) não interferiu nos resultados reprodutivos. Por meio da histologia e microscopia eletrônica de varredura foi observado um padrão morfológico similar entre as três porções do corno uterino ipsilateral ao CL. No entanto, a contagem de vasos sanguíneos mostrou... / Nowadays the embryo transfer is a biotechnology widely used, however not much is know about the best place to put embryos into the uterine horn ipsilateral to the corpus luteum (CL). In addition, not much is known about the morphological characteristics thorough the uterine horn and if it could improve or damage the uterine environment. The aims of this study were: to investigate the effect of the site of embryo placement (cranial, medial or caudal) into the uterine horn adjacent to the CL on pregnancy rates; to analyze the morphology from these tree portions of the both uterine horns adjacent and opposite to CL using histology and scanning electron microscopy; and establish the relation between pregnancy rates and morphofunctions characteristics to indicate the best place to transfer embryos. In this study 600 in vivo produced embryos (fresh and frozen-thawed) and 315 in vitro produced embryos were transferred to Holstein and crossbred recipients, in order. Nine crossbred heifers were slaughtered approximately seven days after estrus and the uterus were studied to analyze its morphology at the same time that the embryos have been transferred. The results showed that the site of embryo placement did not influence (P>0.05) the pregnancy rates in recipients receiving fresh embryos during summertime. During the winter, the pregnancy rates were greater (P<0.05) for fresh embryos transferred into the caudal portion of the uterus horn than cranial portion. For animals that received in vitro produced embryo, the site of embryo placement did not interfere (P>0.05) in the pregnancy rates. Morphophological characteristics observed by histology and scanning electron microscopy was similar in all parts of the uterine horn ipsilateral to the CL studied. However, the average number of blood vessels counted was lower in the contralateral... (Complete abstract click electronic access below)

Made available in DSpace on 2014-06-12T15:04:24Z (GMT). No. of bitstreams: 2 arquivo4331_1.pdf: 2513431 bytes, checksum: 38382b40f532440ccc321145ef0695b1 (MD5) license.txt: 1748 bytes, checksum: 8a4605be74aa9ea9d79846c1fba20a33 (MD5) Previous issue date: 2008 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / A Família Leguminosae é a mais representativa da Caatinga, compreendendo cerca de um terço da riqueza de espécies catalogadas. Devido à importância das Leguminosae no bioma, foi realizado um inventário florístico no Município de Mirandiba-PE. A partir desta lista de espécies realizou-se o tratamento taxonômico e uma análise de similaridade desta flora com a de outras áreas do Nordeste brasileiro. Além disto, procurou-se estabelecer padrões morfológicos de tipos de frutos, sementes e embriões, com especial enfoque na plúmula, visando possibilitar a identificação de algumas das espécies endêmicas da caatinga. Foram realizadas excursões no período de março de 2006 a julho de 2007 para coleta de material botânico. As relações florísticas foram avaliadas pela análise de UPGMA e PCO a partir dos índices de similaridade de Sørensen. Foram registradas 75 espécies distribuídas em 39 gêneros representando cerca de 25 % das leguminosas já citadas para a caatinga. A análise de similaridade mostrou a formação de dois grupos distintos: O grupo [A] com similaridade de 20% foi estabelecido para as caatingas sobre solos arenosos. O grupo [B] com similaridade de 27% incluiu as caatingas sobre solos derivados do embasamento cristalino Pré-cambriano. Além destes, Cariri (PB) e Caruaru (PE) se mostraram isolados do restante das áreas com uma similaridade de 45%. Dentre as espécies registradas na área, 17 são endêmicas da caatinga, representando 25% do total. Catalogaram-se seis tipos de fruto, onde o tipo padrão foi o legume, freqüente em cerca de 60% das espécies. As sementes sem pleurograma predominaram em cerca de 75% das espécies endêmicas. O padrão de plúmula diferenciada em eófilos segmentados foi o mais comum. A síndrome de dispersão mais representada foi autocórica em mais de 50% das espécies. Os principais diásporos são as sementes

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-01-26T14:14:38Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_EfeitoMeioCondicionado.pdf: 921361 bytes, checksum: 836f42e4214b67273644ea066034ca71 (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-01-27T13:40:05Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_EfeitoMeioCondicionado.pdf: 921361 bytes, checksum: 836f42e4214b67273644ea066034ca71 (MD5) / Made available in DSpace on 2017-01-27T13:40:05Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Dissertacao_EfeitoMeioCondicionado.pdf: 921361 bytes, checksum: 836f42e4214b67273644ea066034ca71 (MD5) Previous issue date: 2016-07-29 / As células tronco são conhecidas por suas propriedades de auto-renovação, diferenciação em diversas linhagem celulares e capacidades imunomoduladores, além de expressarem um grande número de moléculas de adesão, as proteínas de matriz extracelular, citocinas e receptores para fatores de crescimento, permitindo interações com demais células. Podem ser isoladas de vários tecidos, porém as células-tronco adultas derivadas do estroma do tecido adiposo (MSC-ad) apresentam como vantagens a facilidade de isolamento, alto rendimento e baixa morbidade. Baseado nisso, a hipótese deste trabalho é verificar se o uso de meio condicionado pelas MSC-ad na maturação in vitro tem efeito sobre a as taxas de desenvolvimento de embriões bovinos. Para tanto, foi feito o isolamento e em seguida o cultivo de MSC-ad de origem bovina que se estendeu até a passagem três (P3) em meio de cultivo DMEM, suplementado com bicarbonato de sódio, 10% Soro fetal bovino (SFB), 50μl/mL de gentamicina. Quando os cultivos atingiram a confluência de 70% o meio foi substituído por TCM199 suplementado com 0.2 mM de piruvato, 50 μl/ml de gentamicina e 10% de SFB (meio de MIV). As MSC-ad foram condicionadas com meio TCM199 suplementado pelo período de 0 (Grupo CONTROLE), 24 (grupo COND-24h), 48 (grupo COND-48h) e 72 horas (grupo COND-72h), sendo que ao fim de cada período, o meio sobrenadante foi retirado, filtrado, aliquotado e congelado a -200 C. O meio foi descongelado somente no dia da MIV, e suplementado com 0,5 μl de PMSG (concentração 7UI/Ml) e 0,5 μl de HCG. Ovários de abatedouro foram puncionados para obtenção de complexos cumulus oophurus (CCOs) que foram maturados por 24 horas em microgotas de meios condicionados sob óleo mineral e incubados em estufa a 5% de CO2 com 38,5° C. A avaliação da maturação nuclear foi feita com 22 horas, em seguida realizada a ativação partenogenética somente dos oócitos que exibiam corpúsculo polar com concentração em 50 μM de ionomicina por 5 minutos, inativação com TCM199-Hepes saturado com 0,03g de BSA, seguida de incubação por 3 horas em microgotas de 2mM de 6-DMAP. Após esse período as partenogêneses foram transferidas para migrogotas de meio de cultivo in vitro. As taxas de desenvolvimento foram avaliadas no segundo e sétimo dia após a ativação. Os resultados foram analisados por ANOVA e pós-teste de Fisher adotando nível de significância de 5%. Para os grupos experimentais CONTROLE, COND-24h, COND-48h e COND-72h, obtivemos os seguinte 14 resultados, respectivamente: 83.7, 77.7, 81,4 e 76.1% de maturação nuclear; 87.5, 86,9, 74 e 80.3% de clivagem e 23.8, 27.5, 18 e 19.6% de formação de blastocisto. Não houve diferença estatística entre os grupos experimentais condicionados (p>0.05). Porém, as taxas de blastocisto foram menores quando comparadas ao meio de MIV fresco (42.1%) (p<0.05). Isto sugere que o condicionamento ou o congelamento do meio afetou a sua eficiência. Estudos futuros deverão ser realizados para avaliar os níveis dos fatores de crescimento, citocinas e quimiocinas secretadas no meio de MIV. / Stem cells are known for their property of self-renewal, differentiation into various cell lineages and immunomodulatory capabilities, in addition to express a large number of adhesion molecules, extracellular matrix proteins, cytokines and growth factor recptors, allowing interactions with other cells. They can be isolated from various tissues, but adult stem cells derived from adipose tissue stroma (MSC-d) have the advantage of being easely isolated, high yield and low morbidity. Based on this, the study hypothesis is to verify the effect of MSC-ad conditioned medium use in in vitro maturation on development rates of bovine embryos. To this end, bovine MSC ad were isolated then cultivated until the passage three (P3) in DMEM culture medium, supplemented with sodium bicarbonate, 10% fetal bovine serum (FBS), 50mL / mL gentamicin. When cultures reached 70% confluency, the medium was replaced with TCM199 supplemented with 0.2 mM pyruvate, 50 ul / ml gentamicin and 10% FBS (IVM medium). The MSC-ad were conditioned with medium TCM199 supplemented for a period of 0 (Control Group), 24 (COND-24 group), 48 (COND-48h group) and 72 hours (COND group-72h), wherein the end of each period, the supernatant medium was removed, filtered, aliquoted and frozen at -20 0 C. The medium was thawed only on MIV day, and supplemented with 0.5 uL of PMSG (concentration 7 IU / ml) and 0.5 uL of HCG. Slaughterhouse ovaries were punctured to obtain oophurus cumulus complexes (COCs) were matured for 24 hours in microdrops of conditioned mediums under mineral oil them incubated in an incubator at 5% CO 2 at 38.5 ° C. Nuclear maturation assessment was performed with 22 hours, then held 15 parthenogenetic activation of only oocytes that exhibited polar body concentration of at least 50 uM ionomycin for 5 minutes, inactivation with TCM199-Hepes 0.03g saturated with BSA, followed by incubation for 3 hours microdroplets 2mM 6-DMAP. After this period, the parthenogenesis were transferred as microdrops to a culture medium in vitro. development rates were evaluated in the second and seventh days after activation. The results were analyzed by ANOVA and Fisher's post-test adopting a significance level of 5%. For groups: Experimental CONTROL, COND-24, COND-48h and 72h-COND, we obtained the following results respectively: 83.7, 77.7, 81.4 and 76.1% of nuclear maturation; 87.5, 86.9, 74 and 80.3 and 23.8% cleavage, 27.5, 18 and 19.6% of blastocyst formation. There was no statistical difference between condinioned experimental groups (p<0.05). However, blastocyst rates were lower when compared with fresh IVM medium (42.1%) (p<0.05). This suggests that the efficiency was affected by the conditioning of the medium or freezing. Future studies should be conducted to assess the levels of growth factors, cytokines and chemokines secreted in IVM medium.

Made available in DSpace on 2015-03-03T11:52:56Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-11-25Bitstream added on 2015-03-03T12:06:49Z : No. of bitstreams: 1 000809261.pdf: 277300 bytes, checksum: fd4b97c5598b7219cc2c5e30b2f73157 (MD5) / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / O objetivo do presente estudo foi avaliar se aplicação de dose reduzida de bST (333mg), associada ao protocolo de superovulação de doadoras não lactantes, aumenta a produção de embriões e a manutenção de gestação após transferência para receptoras em lactação. Um total de 267 doadoras foram submetidas ao protocolo de superovulação, e subdivididas em 3 grupos: CONT (grupo controle = não tratados com bST), bST/IA (grupo recebeu uma dose de bST no dia da IA) e bST/InIA (grupo recebeu duas doses de bST, uma no início de protocolo e outra no dia da IA). A coleta não cirúrgica dos embriões foi realizada 6,5 dias após a inseminação. Os embriões frescos foram transferidos para receptoras lactantes previamente sincronizadas. Os diagnósticos de gestação foram realizados no d30 e d60. A concentração sérica de IGF1 nas doadoras no dia da coleta de embriões foi maior (p<0,01) para os grupos bST/IA (306,4 ± 13,0 ng/mL) e bST/InIA (307,3 ± 12,4 ng/mL) em relação ao CONT (195,8 ±13,3 ng/mL). A aplicação de bST no momento da IA aumentou a proporção de embriões transferíveis por coleta (69,9%), em relação ao controle (54,7%) e aos animais que receberam duas doses de bST (55,8%), resultando em 3,4±0,6 embriões por coleta no grupo controle, 4,7±0,6 embriões por coleta no grupo tratado com duas doses e 6,0±0,6 no grupo tratado com uma dose na IA. O tratamento com bST na IA aumentou o número de blastocistos recuperados por coleta (3,0±0,4) em relação ao controle (1,6±0,4), enquanto o grupo que recebeu duas aplicações de bST tendeu de aumentar o numero de blastocistos (2,6 ±0,4) em relação ao controle. A prenhez aos 60 dias foi 25,6%, 30% e 28,6% para os grupos CONT, bST/IA e bST/InIA respectivamente. Foi detectada interação entre tratamento e o estágio de desenvolvimento do embrião na prenhez por TE, em que blastocistos dos grupos tratados com bST ... / The objective of this study was evaluate if a low-dose of bST (333mg), associated with the superovulation protocol of non-lactating donors, would increases the embryo production and pregnancy maintenance after transfer to lactating recipients. For this, 267 donors were subjected to the superovulation protocol and subdivided into 3 groups: CONT (control group = no bST), bST/IA (group received one dose of bST at AI) and bST/INIA (group received two doses of bST, one at the beginning protocol and another at AI). Non-surgical collection of embryos occurred 6.5 days after insemination. The fresh embryos were transferred to previously synchronized lactating recipients. The pregnancy diagnoses were performed at d30 and d60. The The donors IGF1 serum concentration at embryo recovery day was higher (p <0.01) for bST/IA groups (306.4 ± 13.0 ng / mL) and bST/INIA (307.3 ± 12 4 ng / ml) compared to the CONT (195.8 ± 13.3 ng / ml). The bST application at AI increased proportion of transferable embryos per collection (69.9%), when compared with the control (54.7%) and with the animals that received two doses of somatotropin (55.8%) resulting 3.4 ± 0.6 embryos per collection in the control group, 4.7 ± 0.6 embryos per collection in two doses group and 6.0 ± 0.6 in the one dose at IA group. Treatment with bST at AI increased the number of blastocysts recovered by collection (3.0 ± 0.4) compared to control (1.6 ± 0.4), while the group that received two bST applications tended to increase number of blastocysts (2.6 ± 0.4) compared to the control. Pregnancy at 60 days was 25.6%, 30% and 28.6% for the CONT group, bST/AI and bST/INIA respectively. Was detected interaction between treatment and embryo development stage in pregnancy by ET, when blastocysts in the bST treated groups had higher P/ET at 60 days compared to the control group blastocysts, while morulae of the treated groups had lower P/ET that morulae ...

Orientador: José Luiz Moraes Vasconcelos / Banca:José Buratini Junior / Banca: Heraldo César Gonçalves / Resumo: O objetivo do presente estudo foi avaliar se aplicação de dose reduzida de bST (333mg), associada ao protocolo de superovulação de doadoras não lactantes, aumenta a produção de embriões e a manutenção de gestação após transferência para receptoras em lactação. Um total de 267 doadoras foram submetidas ao protocolo de superovulação, e subdivididas em 3 grupos: CONT (grupo controle = não tratados com bST), bST/IA (grupo recebeu uma dose de bST no dia da IA) e bST/InIA (grupo recebeu duas doses de bST, uma no início de protocolo e outra no dia da IA). A coleta não cirúrgica dos embriões foi realizada 6,5 dias após a inseminação. Os embriões frescos foram transferidos para receptoras lactantes previamente sincronizadas. Os diagnósticos de gestação foram realizados no d30 e d60. A concentração sérica de IGF1 nas doadoras no dia da coleta de embriões foi maior (p<0,01) para os grupos bST/IA (306,4 ± 13,0 ng/mL) e bST/InIA (307,3 ± 12,4 ng/mL) em relação ao CONT (195,8 ±13,3 ng/mL). A aplicação de bST no momento da IA aumentou a proporção de embriões transferíveis por coleta (69,9%), em relação ao controle (54,7%) e aos animais que receberam duas doses de bST (55,8%), resultando em 3,4±0,6 embriões por coleta no grupo controle, 4,7±0,6 embriões por coleta no grupo tratado com duas doses e 6,0±0,6 no grupo tratado com uma dose na IA. O tratamento com bST na IA aumentou o número de blastocistos recuperados por coleta (3,0±0,4) em relação ao controle (1,6±0,4), enquanto o grupo que recebeu duas aplicações de bST tendeu de aumentar o numero de blastocistos (2,6 ±0,4) em relação ao controle. A prenhez aos 60 dias foi 25,6%, 30% e 28,6% para os grupos CONT, bST/IA e bST/InIA respectivamente. Foi detectada interação entre tratamento e o estágio de desenvolvimento do embrião na prenhez por TE, em que blastocistos dos grupos tratados com bST ... / Abstract: The objective of this study was evaluate if a low-dose of bST (333mg), associated with the superovulation protocol of non-lactating donors, would increases the embryo production and pregnancy maintenance after transfer to lactating recipients. For this, 267 donors were subjected to the superovulation protocol and subdivided into 3 groups: CONT (control group = no bST), bST/IA (group received one dose of bST at AI) and bST/INIA (group received two doses of bST, one at the beginning protocol and another at AI). Non-surgical collection of embryos occurred 6.5 days after insemination. The fresh embryos were transferred to previously synchronized lactating recipients. The pregnancy diagnoses were performed at d30 and d60. The The donors IGF1 serum concentration at embryo recovery day was higher (p <0.01) for bST/IA groups (306.4 ± 13.0 ng / mL) and bST/INIA (307.3 ± 12 4 ng / ml) compared to the CONT (195.8 ± 13.3 ng / ml). The bST application at AI increased proportion of transferable embryos per collection (69.9%), when compared with the control (54.7%) and with the animals that received two doses of somatotropin (55.8%) resulting 3.4 ± 0.6 embryos per collection in the control group, 4.7 ± 0.6 embryos per collection in two doses group and 6.0 ± 0.6 in the one dose at IA group. Treatment with bST at AI increased the number of blastocysts recovered by collection (3.0 ± 0.4) compared to control (1.6 ± 0.4), while the group that received two bST applications tended to increase number of blastocysts (2.6 ± 0.4) compared to the control. Pregnancy at 60 days was 25.6%, 30% and 28.6% for the CONT group, bST/AI and bST/INIA respectively. Was detected interaction between treatment and embryo development stage in pregnancy by ET, when blastocysts in the bST treated groups had higher P/ET at 60 days compared to the control group blastocysts, while morulae of the treated groups had lower P/ET that morulae ... / Mestre

Submitted by Cássio da Cruz Nogueira (cassionogueirakk@gmail.com) on 2017-05-05T11:40:59Z No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_EfeitoCortisolProducao.pdf: 2760412 bytes, checksum: a1460a5384d94a66d0634ae0ee2cb14d (MD5) / Approved for entry into archive by Edisangela Bastos (edisangela@ufpa.br) on 2017-05-09T20:48:49Z (GMT) No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_EfeitoCortisolProducao.pdf: 2760412 bytes, checksum: a1460a5384d94a66d0634ae0ee2cb14d (MD5) / Made available in DSpace on 2017-05-09T20:48:49Z (GMT). No. of bitstreams: 2 license_rdf: 0 bytes, checksum: d41d8cd98f00b204e9800998ecf8427e (MD5) Tese_EfeitoCortisolProducao.pdf: 2760412 bytes, checksum: a1460a5384d94a66d0634ae0ee2cb14d (MD5) Previous issue date: 2014-12-19 / CAPES - Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior / FAPESPA - Fundação Amazônia de Amparo a Estudos e Pesquisas / O objetivo dessa tese foi avaliar o efeito do cortisol, na maturação oocitária e cultivo de embriões bovinos. No ARTIGO 1 foi analisada a distribuição e localização de receptor de glicocorticóide (GR) por imunocitoquímica em oócitos, células do cumulus, embrião de 2-4 células, 8-16 células, mórula e blastocisto, e foi verificado também a presença de RNAm (rtPCR qualitativa) para GR nos referidos estádios. Os resultados apontam que o GR está presente em todas as células analisadas. A fim de verificar a funcionalidade de GR no desenvolvimento embrionário préimplantacional, a tradução do RNAm para GR foi silenciada em zigotos pela técnica de RNAi, e o desenvolvimento embrionário subsequente foi analisado. A diminuição de transcrito e proteínas de GR pela técnica de RNAi prejudicou o desenvolvimento embrionário (p<0,05. A presença de GR em oócito e células do cumulus nos indica que essas células são sensíveis ao uso de GC. Visto isso, no ARTIGO 2 foi avaliado o efeito de diferentes concentrações do cortisol durante a maturação in vitro (MIV) de oócitos bovinos sobre o desenvolvimento embrionário, índice de apoptose e expressão de gênica (NRF1, COX, TFAM, GLUT1, FASN e HSP70). As concentrações de cortisol utilizadas foram 0,01; 0,1 e 1 μg/mL.. Não houve diferença estatística em relação ao número de células e taxa de clivagem, porém a concentração de 0,1 μg/ml de cortisol aumentou a taxa de blastocisto quando comparada ao grupo controle (sem cortisol na MIV) (41 ± 10 versus 21 ± 1,2; p<0,05; respectivamente). A taxa de apoptose e a expressão gênica em oócitos, células do cumulus, e blastocistos foi avaliada apenas na concentração de 0,1 μg/ml de cortisol. Não houve diferença estatística com relação ao índice apoptótico, e nem com relação à expressão gênica em oócitos e células do cumulus para os genes COX, NRF1, HSP70 e FASN (p>0,05). Em relação à expressão gênica embrionária, apenas as quantificações relativas de RNAm para FASN, GLUT1 e HSP70 estavam aumentadas nos blastocistos tratados com 0,1μg/mL durante a MIV quando comparados aos embriões do grupo Controle (p<0,05), os demais genes não mostraram alteração (p>0,05). No ARTIGO 3 foi analisado o uso do cortisol durante o cultivo in vitro (CIV) de embriões bovinos. Visto que no Capítulo 1 foi identificado GR em todos os estádios de desenvolvimento embrionário e quando a expressão de GR foi silenciada o desenvolvimento embrionário foi prejudicado. Sendo assim, no experimento 3 foram adicionadas diferentes concentrações (0,01; 0,1 e 1 μg/mL) de cortisol na CIV e o desenvolvimento embrionário foi avaliado, mesmos parâmetros do Capítulo 2. Não houve diferença estatística nos embriões tratados com Cortisol em diferentes concentrações quando comparados com o Controle para nenhum dos parâmetros analisados (p>0.05). A concentração de 0,1 μg/mL foi escolhida para avaliar outros parâmetros de qualidade embrionária. Sendo assim, embriões CIV Com ou Sem 0,1 μg/mL de Cortisol, foram analisados quanto à taxa de apoptose e expressão gênica, não sendo observada diferença estatística em nenhuma das análises (p>0,05). Após estes estudos concluímos que oócitos e embriões são responsivos a GC, que a adição de cortisol na MIV melhora a competência oocitária, porém a suplementação com cortisol na CIV não influenciou o desenvolvimento embrionário. / The aim of this thesis was to evaluate the effect of cortisol in oocyte maturation and bovine embryo culture. In Chapter 1 we analyzed the distribution and location of glucocorticoid receptor (GR) by immunocytochemistry in oocytes, cumulus cells, embryonic cells 2-4, 8-16 cell, morula and blastocyst, and was also verified the presence of mRNA (qualitative RT-PCR) for GR in the stages. The results showed that the GR is present in all cells analyzed. In order to verify the functionality GR in preimplantation embryo development, translation of mRNA for GR zygotes was silenced in the RNAi technique, and subsequent embryo development was analyzed. The embryonic development decreased (P <0.05) after silencing of GR mRNA. The presence of GR oocyte and the cumulus cells indicates that these cells are sensitive to the use of CG. Given this, in Chapter 2, the effects of different cortisol concentrations during in vitro maturation (IVM) of bovine oocytes and embryonic development, apoptosis rate and gene expression (NRF1, COX, TFAM, GLUT1, FASN and HSP70) were analiyzed. The concentrations of cortisol used were 0.01, 0.1 and 1 mg / mL . There was no statistical difference in the number of cells and cleavage rate, but the concentration of 0.1 mg/ml of cortisol increased the blastocyst rate when compared to the control group (without cortisol in IVM) (41 ± 10 versus 21 ± 1.2; p <0.05, respectively). The rate of apoptosis and gene expression in oocytes, cumulus cells and blastocysts was only assessed at a concentration of 0.1 mg / ml of cortisol. There was no statistical difference in the apoptotic index, and not with respect to gene expression in oocytes and cumulus cells for COX genes, NRF1, HSP70 and FASN (p> 0, 05). Regarding embryonic gene expression, only the measurements relative mRNA FASN, GLUT1 and HSP70 were increased in blastocysts treated with 0.1 g/ml during IVM when compared to embryos of the Control group (p <0.05), the other genes showed no change (p> 0.05). In Chapter 3, we investigated the use of cortisol during in vitro culture (IVC) of bovine embryos. As in Chapter 1 was identified GR in all embryonic stages and when the GR expression was silenced and embryonic development was impaired. Thus, in the experiment three different concentrations (0.01, 0.1 and 1 mg / mL) of cortisol in IVC and embryonic development was evaluated same parameters of Chapter 2. There was no statistical difference in the embryos treated with cortisol in different concentrations when compared to the control for the parameters analyzed (p> 0.05). The concentration of 0.1 mg/ml was chosen to evaluate other parameters of embryo quality. Thus, IVC embryos with or without 0.1 mg/mL of cortisol, were analyzed for apoptosis rate and gene expression, not being statistically significant difference in any of the analyzes (p> 0.05). After these studies conclude that oocytes and embryos are responsive to GC, and the addition of cortisol in IVM improves oocyte competence, but the supplementation of IVC with cortisol may not have influence on embryo development.

Orientador: Joaquim Mansano Garcia / Coorientador: Marina Ragagnin de lima / Banca: Luisa Cunha Carneiro / Resumo: A necessidade de uma metodologia mais prática para transferência de embriões em tempo fixo em rebanhos de gado de corte, para que se torne mais proveitoso, tem aumentado ao longo dos anos. O presente estudo avaliou a taxa de concepção e gestação de embriões produzidos in vitro transferidos a fresco, vitrificados ou congelados em um rebanho nelore de corte. Doadoras Nelore (n= 20) de um mesmo rebanho foram previamente selecionadas para serem submetidas a ovum pick up em dia aleatório do ciclo estral. Oócitos foram recuperados e selecionados para maturação in vitro por 24 horas a 38,5°C com 5% CO2 e 95% de humidade do ar. Para fertilização in vitro, sêmen da mesma partida, de um touro pré-selecionado da raça Nelore foi utilizado. Após 6 dias de cultivo in vitro, os embriões na fase de blastocisto foram aleatoriamente selecionados para serem transferidos a fresco, vitrificados ou congelados. As transferências foram realizadas em novilhas e vacas do mesmo rebanho das doadoras. As taxas de concepção, aos 30 dias, para os embriões transferidos a fresco, vitrificados ou congelados e transferidos depois do reaquecimento foram, respectivamente, de 37,64 ± 11,20%, 24,09 ± 2,34% e 16,21 ± 10,23%. As taxas de concepção, aos 30 dias, considerando a categoria da receptora, novilha ou vaca foi de 23,02 ± 3,42% e 31,06 ± 4,62%, respectivamente. O estudo mostrou que o método de congelação lenta, para transferência direta utilizado, não consegue resultados similares aos transferidos à... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The necessity of a more practical fixed time embryo transfer method in beef cattle herds, in order to make it more usable, has grown over the years. The present study compared the conception and pregnancy rates of in vitro produced embryos transferred fresh, vitrified or slow frozen in an nelore beef herd. Nelore donors (n=20) were previously selected to be submitted to ovum pickup on a random day of estrous cycle. Oocytes were recovered and selected for in vitro maturation for 24 hours at 38,5°C with 5% CO2 and 95% air humidity. For in vitro fertilization, semen, from the same batch, of one pre-selected Nelore bull was used. After 6 days of in vitro cultivation, embryos on blastocysts stage were randomly selected to be transferred either fresh, vitrified or frozen. The transfer procedures were conducted on heifers and cows of the same herd of the donors. Conception rates, at 30 days, for fresh transferred, vitrified and frozen transferred embryos were, respectively, 37,64 ± 11,20%, 24,09 ± 2,34% and 16,21 ± 10,23%. Conception rates, at 30 days, considering animal category of the recipients, heifer or cow were 23,02 ± 3,42% e 31,06 ± 4,62%, respectively. This study showed that the slow freezing, for direct transfer method used, can't achieve similar results (p= 0,0078) as the fresh transferred on Nelore herds, and vitrification still has to be the cryopreservation method for embryos on Nelore herds. It was used a significance of p<0,05. / Mestre

Durante o cultivo in vitro, as células são submetidas a uma série de estímulos estressores e em geral, a heterogeneidade da resposta a estes estímulos não é levada em consideração. O presente estudo foi baseado em um modelo fatorial (2x2x3) criado para avaliar como embriões com cinética de desenvolvimento distinta respondem à combinação de estresse ambiental e metabólico durante o cultivo in vitro. Para isso, embriões rápidos (4 ou mais células às 22 horas de cultura) e Lentos (2 ou 3 células) foram produzidos in vitro, cultivados em 20&#37; ou 5&#37; O2 e também em suplementações de glicose distintas (0.6, 2 e 5mM), resultando em 12 grupos de estudo. Os embriões em estágio de blastocisto foram avaliados em 95 caracteres, incluindo 82 genes, 7 evidências bioquímicas (consumo de glicose, glutamato e piruvato; produção de lactato e ATP), geração de espécies reativas de oxigênio (EROs), atividade mitocondrial e, finalmente, o conteúdo lipídico. Os dados foram normalizados e reunidos em uma matriz que foi analisada em parcimônia, com 500 repetições e Tree-Bissection Reconection como algoritmo (software TNT) em busca de comportamentos semelhantes entre os grupos. Todos os caracteres foram aditivos e igualmente ponderados. Esta análise resultou em uma única árvore ideal, totalmente resolvida. Os resultados mostram os grupos dispostos em dois arranjos principais de acordo com a tensão de oxigênio, exceto os grupos de embriões lentos cultivados em um ambiente de alta glicose (5mM). Num segundo momento, cada um dos grupos pertencentes aos primeiros arranjos foi novamente analisado. A 5&#37; O2 (mais semelhante ao encontrado no útero), os embriões se agruparam de acordo com a cinética de desenvolvimento, independentemente da concentração de glicose no meio de cultura. Nesta condição, embriões rápidos foram mais capazes de atingir o estágio de blastocisto sem sobrecarregar o Metabolismo. Já a 20&#37; O2, a suplementação de glicose foi mais importante para o agrupamento. Em um ambiente de alta glicose, em especial os embriões lentos, apresentaram metabolismo alterado e bloqueio de desenvolvimento. No entanto, embriões cultivados em baixas concentrações de glicose foram mais capazes de ativar mecanismos adaptativos e superar as injúrias causadas pelo estresse. A plasticidade embrionária é uma característica única e com esse trabalho conseguimos demonstrar como o 13 metabolismo se modula para ajudar os embriões a enfrentar condições estressantes enquanto tentam sobreviver a qualquer custo. / During in vitro culture cells are submitted to many stressful stimuli, however, the heterogeneity of the response to those stimuli is usually not considered. This study was based on a factorial experimental design (2x2x3) created to evaluate how embryos with distinct developmental kinetics respond to the combination of environmental and metabolic stress during in vitro culture. For this purpose, Fast (4 or more cells at 22 hours of culture) and Slow embryos (2-3 cells) were produced in vitro using standard protocols, cultured in 20&#37; or 5&#37; O2 and also in distinct glucose concentrations (0, 2 and 5mM), resulting in 12 groups. Blastocysts were evaluated for 95 characters including 82 genes, 7 biochemical evidences: consumption of glucose, glutamate and pyruvate; production of lactate and ATP; generation of reactive oxygen species (ROS), mitochondrial activity and finally the lipid content. Data were normalized and gathered in a matrix that was analyzed under parsimony, with 500 replicates and Tree-Bissection Reconection as the swapping algorithm (TNT software), searching for similar behaviors. All characters were additive and equally weighted. This analysis resulted in a single optimal tree, fully resolved. Results show the groups arranging in two main clusters according to oxygen tension regardless of developmental kinetics and glucose, except the groups of slow embryos cultured in a high glucose environment (5mM). Each cluster was separately analyzed and at 5&#37; of oxygen (more similar to what is found in the uterus), embryos clustered according to developmental kinetics and independently of glucose concentration in culture media. On that condition, embryos with a faster kinetics were more capable of reaching blastocyst stage without overloading the metabolism. At 20&#37; of oxygen, glucose supplementation seems to be more important for the clustering. In a high glucose environment embryos, in special de slow ones, show altered metabolism and block. However embryos cultured in lower glucose concentrations are more capable of activating adaptive mechanisms and overcome stress injuries. The embryonic plasticity is a unique feature and with this work we were able to demonstrate how metabolism modulates to help the embryos face stressful conditions while trying to survive at any cost.

O momento das primeiras divisões celulares pode predizer o potencial de desenvolvimento de um embrião, incluindo sua capacidade de estabelecer prenhez. Além de diferenças relacionadas ao metabolismo, estresse e sobrevivência, embriões com diferentes velocidades de desenvolvimento apresentam padrões transcricionais distintos, principalmente relacionados ao metabolismo energético e lipídico. Como o padrão transcricional é regulado por fatores epigenéticos este estudo visou caracterizar os mecanismos epigenéticos envolvidos neste fenótipo. Para isto, embriões bovinos foram produzidos in vitro utilizando sêmen sexado (fêmeas) e as 40 horas pós inseminação (hpi) foram classificados como Rápidos (4 ou mais células) ou Lentos (2 ou 3 células), permanecendo em cultivo até o estágio de blastocisto (168 hpi) (Capítulo 1) ou sendo avaliados com 40 hpi, 96 hpi ou 168 hpi (Capítulo 2). No capítulo 1, a análise da metilação global do genoma pelo sistema EmbryoGENE Methylation DNA Array (EDMA) identificou 11.584 regiões diferencialmente metiladas (DMRs) (7.976 regiões hipermetiladas em blastocistos derivados do grupo de clivagem rápida FBL - e 3.608 regiões hipermetiladas em blastocistos derivados de embriões de clivagem lenta - SBL). Os FBL apresentaram mais regiões classificadas como hipermetiladas, distribuídas ao longo do genoma, como nos íntrons, exons, promotores e elementos de repetição, enquanto em SBL, as regiões hipermetiladas estavam mais presentes nas ilhas CpG. As DMRs foram agrupadas em relação aos processos biológicos a que estavam envolvidas, e algumas das vias mais afetadas foram relacionadas à sobrevivência/diferenciação celular e metabolismo energético/lipídico. Os perfis dos transcritos dos genes diferencialmente metilados (DMs) relacionados com estas vias também foram avaliados, e a maior parte revelou mudanças na quantificação relativa. No capítulo 2, foi avaliada ao longo do desenvolvimento a presença de metilações e hidroximetilações do DNA e modificações pós-traducionais de histonas (acetilação e trimetilação da lisina 9 da histona 3 e trimetilação da lisina 27 da histona 3 H3K9ac, H3K9me3 e H3K27me3, respectivamente). A cinética das primeiras clivagens influenciou a maioria das modificações epigenéticas estudadas desde os estágios iniciais até o blastocisto (exceto pela hidroximetilação do DNA e H3K27me3). A análise dos transcritos relacionados a inclusão ou remoção dessas modificações corroborou o padrão de modificações encontrado. É possível concluir que a cinética das primeiras clivagens apresenta relação com modificações epigenéticas nos embriões e que se manterão até o final do desenvolvimento pré-implantacional, resultando em blastocistos de padrão transcricional e metabólico distintos, podendo influenciar na viabilidade embrionária. / The timing of the first cell divisions may predict the developmental potential of an embryo, including its ability to establish pregnancy. Besides differences related to metabolism, stress, and survival, embryos with different speeds of development present distinct patterns of gene expression, mainly related to energy and lipid metabolism. As gene expression is regulated by epigenetic factors, and that includes DNA methylation patterns, in this study we compared the global DNA methylation profile of embryos with different kinetics of development in order to identify general pathways and regions that are most influenced by this phenotype. For this, bovine embryos were produced in vitro using sexed semen (females) and the 40 hours post insemination (hpi) were classified as Fast (4 or more cells) or Slow (2 or 3 cells), remaining in culture until the blastocyst stage (168 hpi) (Chapter 1) or evaluated at 40 hpi, 96 hpi or 168 hpi (Chapter 2). In Chapter 1, the analysis of global DNA methylation by EmbryoGENE DNA Methylation Array (EDMA) identified 11,584 differentially methylated regions (DMRs) (7,976 regions hypermethylated in blastocysts derived from the fast cleavage group -FBL- and 3,608 hypermethylated regions in blastocyst derived from the slow cleavage group -SBL). FBL presented more regions classified as hypermethylated, distributed throughout the genome, as in introns, exons, promoters and repeating elements, whereas in SBL, hypermethylated regions were more present in the CpG islands. DMRs were grouped in relation to the biological processes to which they were involved, and some of the most affected pathways were related to cell survival/differentiation and energy/lipid metabolism. Profiles of transcripts of differentially methylated (DMs) genes related to these pathways were also evaluated, and most presented changes in relative quantification. In Chapter 2, the presence of DNA methylations and hydroxymethylations and post-translational histone modifications (histone 3 lysine 9 acetylation and trimethylation and histone 3 lysine 27 trimethylation - H3K9ac, H3K9me3 and H3K27me3, respectively). The kinetics of the first cleavages influenced most of the epigenetic modifications studied from the initial stages to the blastocyst (except DNA hydroxymethylations and H3K27me3). The analysis of the transcripts related to insertion or removal of these modifications corroborated the pattern of modifications. It is possible to conclude that the kinetics of the first cleavages is related with epigenetic modifications in embryos that will be maintained through the pre-implantation development, resulting in blastocysts with different transcriptional and metabolic patterns, which might influence the embryonic viability.

A progesterona desempenha uma função de extrema importância para o desenvolvimento embrionário inicial, por meio da regulação do ambiente uterino no período prévio à adesão dos embriões ao endométrio. Nesse contexto o objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos da suplementação com progesterona ou progestágeno durante a fase inicial da gestação sobre o ambiente uterino e desenvolvimento embrionário de suínos, bem como seus efeitos no desempenho da leitegada nascida. Foram realizados dois experimentos. No experimento 1 utilizou-se 40 porcas e 28 marrãs que no 6&ordm; dia de gestação foram distribuídas em um dos três grupos experimentais: fêmeas suplementadas com 20 mg de altrenogest (Regumate&reg;) do 6&ordm; ao 12&ordm; dia de gestação (RU; n = 23); fêmeas suplementadas com 2,15 mg/kg de progesterona de longa ação (Sincrogest&reg;), injeção única no 6&ordm; dia de gestação (PG; n = 24); fêmeas não suplementadas (CON; n = 21). Esse experimento foi delineado de maneira inteiramente casualizada em um arranjo fatorial, sendo que a categoria (marrã ou porca) foi considerada fator 1 e os grupos (CON, RU e PG) fator 2. 18 fêmeas foram eutanasiadas no 13&ordm; dia de gestação, e 50 fêmeas no 28&ordm; dia de gestação. Foram analisados: taxa de prenhez, taxa de ovulação, sobrevivência embrionária, tamanho e peso de embriões e útero, volume e peso de corpos lúteos, volume das vesículas embrionárias, dosagem sérica de progesterona e 17&#946;- estradiol, morfometrias glandular e de epitélio luminal do uterino. No experimento 2 foram utilizadas 75 matrizes, que no 6&ordm; dia de gestação foram alocadas de maneira interiramente casualisada em um dois grupos: fêmeas suplementadas com 20 mg de altrenogest (Matrix&reg;) do 6&ordm; ao 12&ordm; dia de gestação (ALT; n = 36); fêmeas não suplementadas (CTR; n = 36). Analisadas: taxa de prenhez, período gestacional, peso médio e homogeneidade da leitegada, número de leitões mumificados, natimortos e nascidos vivos, quantidade de leitões nascidos com menos de 800 gramas. Não houve influência dos tratamentos sobre a taxa de prenhez e a sobrevivência embrionária foi prejudicada apenas para marrãs do grupo RU. Para o desenvolvimento embrionário os resultados divergiram entre as categorias, as marrãs do grupo CON apresentaram embriões maiores e mais pesados quando comparados aos grupos suplementados, bem como vesículas embrionárias maiores. Para as porcas o grupo RU apresentou embriões maiores e mais pesados. De maneira geral as suplementações com progesterona ou progestágeno estimularam o crescimento do epitélio glandular aos 13 dias de gestação, mas não tiveram efeito sobre epitélio luminal. Já aos 28 dias de gestação o efeito da estimulação foi apenas observado para marrãs do grupo PG. Os tratamentos estimularam também o crescimento dos corpos lúteos que foram maiores e mais pesados para os grupos suplementados. Em relação ao desempenho da leitegada, analisado no experimento 2, não houve efeito de tratamento para nenhuma das variáveis analisadas. A suplementação de progesterona/progestágeno a partir do 6&ordm; dia de gestação estimulou o crescimento do epitélio glandular uterino e afetou o desenvolvimento embrionário inicial, mas não exerceu efeito significativo sobre o desempenho da leitegada. / Progesterone plays a role of extreme importance for early embryonic development by regulating the uterine environment in the period prior to the adhesion of the embryos to the endometrium. In this context, the objective of the present study was to evaluate the effects of progesterone or progestogen supplementation during early gestation on the uterine environment and embryo development of pigs, as well as their effects on litter performance. Two experiments were carried out. In the experiment 1, 40 sows and 28 gilts were used, which were distributed in one of the three experimental groups: females supplemented with 20 mg altrenogest (Regumate&reg;) from the 6th to the 12thh day of gestation (RU; n = 23); females supplemented with 2.15 mg / kg long acting progesterone (Sincrogest&reg;), single injection at 6th day of gestation (PG; n = 24); females not supplemented (CON; n = 21). This experiment was completely randomized in a factorial arrangement, with the category (gilt or sow) being considered as factor 1 and the groups (CON, RU and PG) factor 2. 18 females were euthanized on the 13th day of gestation, and 50 females on the 28th day of gestation. Pregnancy rate, ovulation rate, embryo survival, embryo and uterus size and weight, volume and weight of corpora lutea, volume of embryonic vesicles, serum progesterone and 17&#946;-estradiol concentrations, morphometric of uterine glandular epithelium and uterine luminal epithelium. In the experiment 2, 75 sows were used, which at the 6th day of gestation were allocated in a randomized manner in one of two groups: females supplemented with 20 mg of altrenogest (Matrix&reg;) from 6 to 12 days of gestation (ALT; = 36); females not supplemented (CTR; n = 36). The variables analyzed were: pregnancy rate, gestation length, average of litter weight, within-litter variation, number of mummified, stillborn and live born piglets, number of piglets born with less than 800 grams. There was no influence of treatments on the pregnancy rate and embryo survival was impaired only for gilts in the RU group. For embryonic development the results differed among the categories, the gilts of the CON group had larger and heavier embryos when compared to the supplemented groups, as well as larger embryonic vesicles. For the sows the RU group presented larger and heavier embryos. In general, progesterone or progestogen supplementation stimulated the growth of the glandular epithelium at 13 days of gestation, but had no effect on luminal epithelium. However, on day 28 of gestation the stimulatory effect was only observed for gilts of the PG group. Treatments also stimulated the growth of corpora lutea that were larger and heavier for the supplemented groups (RU and PG). Regarding the performance of the litter, analyzed in experiment 2, there was no treatment effect for any of the variables analyzed. In conclusion, Progesterone / progestogen supplementation from day 6 of gestation affected the uterine glandular epithelium area, and early embryonic development, but did not have a significant effect on the litter performance.