Orientador: José Buratini Junior / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Juliano da Silveira / Banca: Marcelo Marcondes Seneda / Banca: Marcelo Fábio Gouveia Nogueira / Resumo: O oócito é responsável por regular os mecanismos da maturação do complexo cumulus oócito (COC) principalmente via secreção de fatores. parácrinos.Dentre os fatores secretados pelo oócito (OSF) desta-se o fator de crescimento dos fibroblastos 10 (FGF10), e dois fatores TGFβ mais estudados a proteína morfogenética óssea 15 (BMP15) e fator de crescimento de diferenciação 9 (GDF9) e estão associados com o desenvolvimento da competência oocitária. O presente trabalho investigou a regulação do oócito sobre as células do cumulus em dois cenários atuais da maturação in vitro, na presença de hormônio folículo estimulante (FSH) ou ampirregulina (AREG). A ausência do oócito afeta a expansão das células do cumulus e também o consumo de glicose e a produção de lactato e a adição de oócitos desnudos reverte o efeito da oocectomia na expansão mas não no consumo de glicose nem na produção de lactato. A oocectomia afeta também a expressão gênica reduzindo a abundância de RNAm de hialurona sintetase 2 HAS2 e elevando a expressão de prostaglandina sintase 2 (PTGS2), pentraxina 3 (PTX3) e proteína indutora do fator de necrose tumoral 6 (TNFAIP6) na presença de FSH e AREG. A adição de oócitos desnudos reverte o efeito da oocectomia sobre a expressão de RNAm de AREG às 4 horas de cultivo, HAS2 e PTGS2 às 22 horas de cultivo apenas quando os complexos foram cultivados na presença de AREG. Adicionalmente foi investigado a ação isolada do FGF10 sobre a diferenciação das células do cumulus. O FGF10 re... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The oocyte is responsible for regulating mechanisms of cumulus oocyte complex (COC) maturation mainly through secretion of paracrine factors. Including oocyte secreted factors (OSF) are the fibroblast growth factor 10 (FGF10), and two TGF beta factors most studied, bone morphogenetic protein 15 (BMP15) differentiation and growth factor 9 (GDF9), and they are associated with the oocyte development of competence. This study investigated the regulation of oocyte cumulus cells on two current scenarios in vitro maturation in the presence of follicle stimulating hormone (FSH) or ampirregulina (AREG). The absence of oocyte affects the expansion of the cumulus cells and also the glucose consumption and lactate production and addition of denuded oocytes reverses the effect of the expansion oocectomia but not glucose consumption or lactate production. The oocectomia also affects gene expression by reducing the abundance of mRNA hialurona synthetase 2 HAS2 and raising synthase prostaglandin expression 2 (PTGS2), pentraxin 3 (PTX3) and inducing protein of the tumor necrosis factor 6 (TNFAIP6) in the presence of FSH and AREG. The addition of denuded oocytes reverses the effect of AREG on oocectomia mRNA expression at 4 hours of culture, HAS2 and PTGS2 to 22 hours of cultivation only when complexes were grown in the presence of AREG. Additionally it investigated the isolated FGF10 action on the differentiation of cumulus cells. FGF10 reverses the effect of on the expansion of the cells and the expression of HAS2 and GFPT1apenas to 22 hours in cumulus but not glucose consumption or lactate production, which shows a delayed effect of FGF10 necessitating the presence of other OSF to soon effect as seen previously in the literature. Complementary to the results, it appears that the cumulus cells have an intracumulus control Smad2-activation by the presence of GDF9 and BMP15 in cumulus cells. In summary the oocyte... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

OBJETIVO: avaliação da expressão gênicado receptor do fator de crescimento semelhante à insulina de (Insulin-Like Growth Factor- IGF) 1 em células da granulosa luteinizadas do cumulusde mulheres não obesas, com sensibilidade à insulina normal, com síndrome dos ovários policísticos (SOP) tratadas e não tratadas com metformina. MODELO DO ESTUDO: prospectivo, longitudinal, randomizado. PACIENTES E MÉTODOS: avaliamos 12 mulheres com ciclosovulatórios, 9 mulheres com SOP e 8 mulheres com SOP e tratadas com metformina, ao menos 8 semanas na dose de 1.700 mg/dia. Todos os grupos foram similares com relação ao peso, ao índice de massa corporal (IMC), à circunferência da cintura e com sensibilidade à insulina normal. Todas as mulheres foram submetidas à estimulação ovariana controlada com uso de agonista de GnRH em protocolo longo e gonadotrofinas para ciclos de FIV/ICSI. As células da granulosa do cumulusforam obtidas por microdissecção dos cinco maiores folículos pré-ovulatórios. A expressão gênica do receptor de IGF-1 foi determinada com técnica da Reação da Polimerase em Cadeia a partir da Transcrição Reversa (Reverse transcriptase - Polymerase Chain ReactionRT-PCR) emiquantitativa. Foram avaliadas as concentrações séricas e foliculares de estradiol, progesterona, testosterona, hormônio folículo estimulante (Follicle-Stimulating Hormone- FSH), hormônio luteinizante (Luteinizing Hormone - LH), Sex Hormone-Binding Globulin(SHBG), glicose, insulina e IGF-1. Para análise estatística, foram utilizados os testes: ANOVA, Newman-Keuls, coeficiente de Pearsone regressão linear múltipla, sendo considerado nível de significância de 5%. RESULTADOS: não foram observadas diferenças com relação à expressão gênica do receptor de IGF-1 nos três grupos analisados (P>0,05). O número de oócitos (20,4 vs. 13,1 vs.11,5, P= 0,009), os níveis séricos de estradiol (1.896,00 pcg/mL vs. 985,20 pcg/mL vs.908,10 pcg/mL,P = 0,03) e testosterona (1,43 ng/mL vs.0,89 ng/mL vs. 0,82 ng/mL pcg/mL,P = 0,02) foram maiores no grupo de mulheres com SOP não tratadas com metformina em comparação com as mulheres com ciclos ovulatórios e tratadas com metformina, respectivamente. As mulheres com ciclos ovulatórios (50.710±42.520 ng/mL) apresentaram maiores concentrações foliculares de progesterona quando comparados com as mulheres com SOP tratadas (13.660±5.212 ng/mL) e não tratadas com metformina (17.680±6.644 ng/mL) (P=0,01). Na avaliação da regressão múltipla, a testosterona sérica não sofreu influência da expressão gênica do receptor de IGF-1 ou do IMC. CONCLUSÕES: as altas concentrações séricas de estradiol e testosterona, maior número de oócitos no grupo de mulheres com SOP não tratadas com metformina nos levam a concluir que mulheres com SOP provavelmente têm uma maior sensibilidade à estimulação da esteroidogênese ovariana quando comparadas com mulheres sem essa doença, embora não tenhasido encontrada diferença na expressão do receptor de IGF-1 nos trêsgrupos analisados. A similaridade dos resultados deste estudo entre mulheres com SOP tratadas com metformina e com ciclos ovulatórios nos levam a \"hipotetizar\" que um dos possíveis mecanismos de ação da metformina no sistema IGF-1 nas células da granulosa do cumulus poderia ser por mecanismos pós-receptores. / OBJECTIVE: evaluation of the gene expression of the IGF-I receptor in luteinized cumulus granulosa cells from non-obese women with normal insulin sensitivity and with polycystic ovarian syndrome (PCOS)treated or nor with metformin. STUDY MODEL: prospective,longitudinal, randomized. PATIENTS AND METHODS: we evaluated 12 women withovulatory cycles and 9 women with PCOS who had been treated for at least 8 weeks with a metformin dose of 1700 mg/day. All groups were similar interms of weight, body mass index (BMI), and waist circumference and all had normal insulin sensitivity. All women were submitted to controlled ovarian stimulation with a GnRH agonist in a long protocol and with gonadotropins for IVF/ICSI cycles. Cumulus granulosa cells were obtained by microdissection of the five largest pre-ovulatory follicles. Gene expression of the IGF-1 receptor was determined by semiquantitative RT-PCR. Serum and follicular concentrations of estradiol, progesterone, testosterone, FSH, LH, insulin, SHBG, and IGF-1 were determined. Data were analyzed statistically by ANOVA and by the Newman-Keuls test and the Pearson coefficient and linear multiple regression were calculated, with the level of significance set at 5%. RESULTS: no difference in geneexpression of the IGF-I receptor were observed between the three groups studied (P>0.05). The number of oocytes (20.4 vs. 13.1 vs. 11.5, P= 0.009) and the serum levels of estradiol (1,896.00 pcg/mL vs. 985.20 pcg/mL vs.908.10 pcg/mL,P = 0.03) and testosterone (1.43 ng/mL vs.0.89 ng/mL vs. 0.82 ng/mL pcg/mL,P = 0.02) were higher in the group of women with PCOS not treated with metformin than in women with ovulatory cycles and in women treated with metformin, respectively. The women with ovulatory cycles (50.710±42.520 ng/mL) presented higher follicular concentrations of progesterone compared with women with PCOS treated (13.660±5.212 ng/mL) or not with metformin (17.680±6.644 ng/mL) (P=0.01). Multiple regression revealed that serum testosterone was not affected by the gene expression of the IGF-1 receptor or by BMI. CONCLUSIONS: the high serum concentrations of estradiol and testosterone and the larger number of oocytes in the group ofwomen with PCOS not treated with metformin lead us to conclude that women with PCOS probably have greater sensitivity to stimulation ofovarian steroidogenesis than women without the disease, although no difference was detected in the expression of the IGF-I receptor between the three groups studied. The similarity ofthe present results for the women with PCOS treated with metformin and for the women with ovulatory cycles leads us to hypothesize that one of the possible mechanisms of action of metformin on the IGF-1 system in cumulus granulosa cells may be of the post-receptor type.

OBJETIVO: avaliação da expressão gênicado receptor do fator de crescimento semelhante à insulina de (Insulin-Like Growth Factor- IGF) 1 em células da granulosa luteinizadas do cumulusde mulheres não obesas, com sensibilidade à insulina normal, com síndrome dos ovários policísticos (SOP) tratadas e não tratadas com metformina. MODELO DO ESTUDO: prospectivo, longitudinal, randomizado. PACIENTES E MÉTODOS: avaliamos 12 mulheres com ciclosovulatórios, 9 mulheres com SOP e 8 mulheres com SOP e tratadas com metformina, ao menos 8 semanas na dose de 1.700 mg/dia. Todos os grupos foram similares com relação ao peso, ao índice de massa corporal (IMC), à circunferência da cintura e com sensibilidade à insulina normal. Todas as mulheres foram submetidas à estimulação ovariana controlada com uso de agonista de GnRH em protocolo longo e gonadotrofinas para ciclos de FIV/ICSI. As células da granulosa do cumulusforam obtidas por microdissecção dos cinco maiores folículos pré-ovulatórios. A expressão gênica do receptor de IGF-1 foi determinada com técnica da Reação da Polimerase em Cadeia a partir da Transcrição Reversa (Reverse transcriptase - Polymerase Chain ReactionRT-PCR) emiquantitativa. Foram avaliadas as concentrações séricas e foliculares de estradiol, progesterona, testosterona, hormônio folículo estimulante (Follicle-Stimulating Hormone- FSH), hormônio luteinizante (Luteinizing Hormone - LH), Sex Hormone-Binding Globulin(SHBG), glicose, insulina e IGF-1. Para análise estatística, foram utilizados os testes: ANOVA, Newman-Keuls, coeficiente de Pearsone regressão linear múltipla, sendo considerado nível de significância de 5%. RESULTADOS: não foram observadas diferenças com relação à expressão gênica do receptor de IGF-1 nos três grupos analisados (P>0,05). O número de oócitos (20,4 vs. 13,1 vs.11,5, P= 0,009), os níveis séricos de estradiol (1.896,00 pcg/mL vs. 985,20 pcg/mL vs.908,10 pcg/mL,P = 0,03) e testosterona (1,43 ng/mL vs.0,89 ng/mL vs. 0,82 ng/mL pcg/mL,P = 0,02) foram maiores no grupo de mulheres com SOP não tratadas com metformina em comparação com as mulheres com ciclos ovulatórios e tratadas com metformina, respectivamente. As mulheres com ciclos ovulatórios (50.710±42.520 ng/mL) apresentaram maiores concentrações foliculares de progesterona quando comparados com as mulheres com SOP tratadas (13.660±5.212 ng/mL) e não tratadas com metformina (17.680±6.644 ng/mL) (P=0,01). Na avaliação da regressão múltipla, a testosterona sérica não sofreu influência da expressão gênica do receptor de IGF-1 ou do IMC. CONCLUSÕES: as altas concentrações séricas de estradiol e testosterona, maior número de oócitos no grupo de mulheres com SOP não tratadas com metformina nos levam a concluir que mulheres com SOP provavelmente têm uma maior sensibilidade à estimulação da esteroidogênese ovariana quando comparadas com mulheres sem essa doença, embora não tenhasido encontrada diferença na expressão do receptor de IGF-1 nos trêsgrupos analisados. A similaridade dos resultados deste estudo entre mulheres com SOP tratadas com metformina e com ciclos ovulatórios nos levam a \"hipotetizar\" que um dos possíveis mecanismos de ação da metformina no sistema IGF-1 nas células da granulosa do cumulus poderia ser por mecanismos pós-receptores. / OBJECTIVE: evaluation of the gene expression of the IGF-I receptor in luteinized cumulus granulosa cells from non-obese women with normal insulin sensitivity and with polycystic ovarian syndrome (PCOS)treated or nor with metformin. STUDY MODEL: prospective,longitudinal, randomized. PATIENTS AND METHODS: we evaluated 12 women withovulatory cycles and 9 women with PCOS who had been treated for at least 8 weeks with a metformin dose of 1700 mg/day. All groups were similar interms of weight, body mass index (BMI), and waist circumference and all had normal insulin sensitivity. All women were submitted to controlled ovarian stimulation with a GnRH agonist in a long protocol and with gonadotropins for IVF/ICSI cycles. Cumulus granulosa cells were obtained by microdissection of the five largest pre-ovulatory follicles. Gene expression of the IGF-1 receptor was determined by semiquantitative RT-PCR. Serum and follicular concentrations of estradiol, progesterone, testosterone, FSH, LH, insulin, SHBG, and IGF-1 were determined. Data were analyzed statistically by ANOVA and by the Newman-Keuls test and the Pearson coefficient and linear multiple regression were calculated, with the level of significance set at 5%. RESULTS: no difference in geneexpression of the IGF-I receptor were observed between the three groups studied (P>0.05). The number of oocytes (20.4 vs. 13.1 vs. 11.5, P= 0.009) and the serum levels of estradiol (1,896.00 pcg/mL vs. 985.20 pcg/mL vs.908.10 pcg/mL,P = 0.03) and testosterone (1.43 ng/mL vs.0.89 ng/mL vs. 0.82 ng/mL pcg/mL,P = 0.02) were higher in the group of women with PCOS not treated with metformin than in women with ovulatory cycles and in women treated with metformin, respectively. The women with ovulatory cycles (50.710±42.520 ng/mL) presented higher follicular concentrations of progesterone compared with women with PCOS treated (13.660±5.212 ng/mL) or not with metformin (17.680±6.644 ng/mL) (P=0.01). Multiple regression revealed that serum testosterone was not affected by the gene expression of the IGF-1 receptor or by BMI. CONCLUSIONS: the high serum concentrations of estradiol and testosterone and the larger number of oocytes in the group ofwomen with PCOS not treated with metformin lead us to conclude that women with PCOS probably have greater sensitivity to stimulation ofovarian steroidogenesis than women without the disease, although no difference was detected in the expression of the IGF-I receptor between the three groups studied. The similarity ofthe present results for the women with PCOS treated with metformin and for the women with ovulatory cycles leads us to hypothesize that one of the possible mechanisms of action of metformin on the IGF-1 system in cumulus granulosa cells may be of the post-receptor type.

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Para a caracterização do transcrito do LHR, CG foram recuperadas de folículos dominantes de vacas das raças Gir (n=16) e Holandês (n=16). Após a PCR e o sequenciamento, os dados foram analisados para a presença de polimorfismos, frequência alélica, conteúdo de informação polimórfica (PIC) e Equilíbrio de Hardy-Weinberg (HWE). Vinte e um polimorfismos de base única (SNPs) foram identificados, sendo 17 em Gir e 14 em Holandês. A classificação dos SNPs de acordo com os valores de PIC identificou 12 como altamente informativos em Gir e cinco em Holandês. Em relação a HWE, oito SNPs não estavam em equilíbrio em Gir e 10 em Holandês. Duas isoformas derivadas de splicing alternativo também foram identificadas, uma no éxon 1 e outra no éxon 10. Conclui-se que o LHR em bovinos leiteiros apresenta uma alta frequência de polimorfismos e múltiplas isoformas. Para avaliar o papel das isoformas do LHR nas CG durante a divergência folicular, a emergência da onda folicular foi sincronizada em novilhas Gir (n=10) e Holandês (n=10) e os folículos foram aspirados individualmente em diâmetros correspondentes aos períodos de pré-divergência, divergência, e pós-divergência. A expressão relativa das isoformas de LHR foi determinada por PCR em Tempo Real e os resultados foram relacionados com as concentrações intrafoliculares de estradiol (E2if). Em ambas as raças, houve um aumento progressivo na concentração de E2if ao longo do desenvolvimento folicular. O E2if foi maior em Holandês quando comparado com Gir antes, durante, e depois da divergência; mas foi similar em folículos de mesmo diâmetro nas duas raças. Observou-se um pico de expressão de LHR total após o início da divergência folicular. A expressão das isoformas de LHR foi ou baixa (Holandês) ou sub-regulada (Gir) durante este mesmo período. Os resultados sugerem que a divergência precoce do folículo dominante em raças de Bos indicus podem estar relacionados à maior sensibilidade ao feedback negativo do estradiol. Além disso, mudanças sequenciais na expressão das isoformas de LHR podem regular a função do LHR durante da divergência folicular em bovinos. A avaliação do comportamento das isoformas de LHR durante a indução exógena do crescimento folicular foi realizada em novilhas Gir caracterizadas com boa (n=5) ou má (n=5) resposta à superovulação. Em ambos os grupos, foram coletadas CG de folículos (8 mm) cujo crescimento ocorreu sem (Controle) ou com estimulação por FSH (SOV). No grupo de boa resposta, não houve diferença na expressão de LHR total entre os tratamentos Controle e SOV. No grupo de má resposta, a expressão de LHR total foi menor em SOV comparado com Controle, mas não houve diferença na expressão das isoformas. Conclui-se que o LHR é diferencialmente expresso em folículos dominantes de novilhas caracterizadas com boa ou má resposta a superovulação. / The aim of this study was to evaluate genomic and transcriptomic variations at the luteinizing hormone receptor (LHR) and its role at the follicular dominance establishment and superovulation outcome in bovine. Three experiments were performed, and for all evaluations cDNA synthesized from total RNA extracted from follicular granulosa cells (GC) were used. To characterize the LHR transcript, GC were recovered from dominant follicles from Gir (n=16) and Holstein (n=16) cows. After PCR and sequencing, data were analized to identify polymorphisms, allelic frequency, polymorphic information content (PIC) and Hardy-Weinberg Equilibrium (HWE). Twenty one single nucleotide polymorphism (SNP) were identified, being 17 in Gir and 14 in Holstein. The classification of SNP according to PIC values identified 12 as highly informative in Gir and five in Holstein. Considering HWE, eight SNP were not in equilibrium in Gir and 10 in Holstein. Two isoforms were also identified, one in exon 1 and other in exon 10. We concluded that LHR in dairy cattle shows a high frequency of polymorphism and multiple isoforms. To evaluate the LHR isoforms role in GC during follicular divergence, the follicular wave emergence was synchronized in Gir (n=10) and Holstein (n=10) heifers and follicles were individually aspirated at the corresponding sizes of pre-, divergence, and post-. The relative expression of LHR isoforms was determined by real time PCR and results were correlated to the intrafollicular estradiol (E2if) concentrations. In both breeds, there was a progressive increase in E2if concentration during follicular development. The E2if in Holstein was higher when compared to Gir before, during, and after divergence; but was similar in follicles of same size in both breeds. We observed a peak for the total LHR expression after the beginning of the follicular divergence. The expression of LHR isoforms was low (Holstein) or under-regulated (Gir) during this same period. The results suggest that the early follicular divergence of the dominat follicle in Bos indicus breeds can be related to a higher sensitivity to the estradiol negative feedback. Besides, sequential changes in LHR isoforms expression can act regulating the LHR function during folicullar divergence in bovine. The evaluation of LHR isoforms behavior during the exogenous induction of follcilualr development was performed in Gir heifer previously characterized as good (n=5) or poor (n=5) responders to superovulation. In both groups, GC were collected from follicles (8 mm) which growth occurred without (Control) or with FSH stimulation (SOV). In good responders group, there was no difference in the LHR expression between the Control and SOV treatments. In the poor responders group, the total LHR expression was lower in SOV when compared to Control, but there was no difference in the expression of the isoforms. We concluded that LHR is differentially expressed in dominant follicles from heifers characterized as good or poor responders to superovulation.

As técnicas de cultivo de folículos e oócitos in vitro, com o objetivo de se obter oócitos maduros para procedimentos de Reprodução Assistida (RA), têm sido aplicadas em diferentes contextos. O sucesso destes procedimentos está diretamente relacionado ao sistema de cultivo utilizado. A utilização de células da granulosa (CG) humanas cultivadas in vitro como um suporte para o co-cultivo destes oócitos imaturos e folículos tem sido descrita por alguns autores. A criopreservação destas células, considerando-se o contexto de sua obtenção em procedimentos de RA, permitiria a viabilização da aplicação destas células na prática clínica diária. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi padronizar o congelamento de células da granulosa (CG) humanas para aplicação em sistemas de co-cultivos de folículos e oócitos imaturos. Foram obtidas CG de 20 voluntárias em tratamento de reprodução assistida, células de 10 voluntárias foram cultivadas em meio ?-MEM suplementado para interrupção da luteinização e congeladas após 48 horas em container \"Cryostep\" (grupo 2C- 2 cultivos) (etapa 2) e células de 10 voluntárias foram congeladas em container \"Cryostep\" sem cultivo prévio (grupo CD- congelamento direto) (etapa 3). Após o descongelamento estas células foram (re)cultivadas por 144 horas, com troca de meio em 48, 96 e 144 horas para avaliações da produção de estradiol (E2) e progesterona (P4) (ng/mL). Verificamos redução na contagem celular e na viabilidade celular tanto no método de congelamento direto (CD) quanto no método com dois cultivos (2C) após o descongelamento (p<0,05), e isso se refletiu na produção de estradiol e progesterona que foi maior nas culturas de células frescas em relação às células criopreservadas (p<0,05). Porém, a relação de E2/célula foi mantida após o descongelamento, sugerindo que esta redução na produção se deve à redução no número de células, as que sobrevivem se mantém normofuncionantes (p=0,23).O CD foi mais eficiente pois permitiu uma maior recuperação celular e uma melhor viabilidade quando comparado ao grupo 2C. A relação estradiol/progesterona foi mantida em todos os tempos de cultivo, fresco, CD e 2C (p>0,05), indicando que a característica funcional destas células foi preservada após o descongelamento. Concluímos que a criopreservação de CG humanas obtidas durante a captação de oócitos compromete a contagem celular e a viabilidade geral da cultura, entretanto, a capacidade funcional e a característica destas células se mantêm preservadas (manutenção das relações E2/célula e E2/P4) / Follicle and oocyte in vitro culture techniques, aiming to obtain mature oocytes for Assisted Reproductive Treatments (ART), have been applied to different contexts. The success of these procedures depends on the culture system used. The use of human granulosa cells (GC) in co-culture systems for follicle and oocyte maturation have been described by some authors. The cryopreservation of these cells, considering the context in which they are obtained during ART, would enable the usage of these cells in such procedures in daily clinical practice. Thus, the objective of this study was to standardize the freezing protocol for human granulosa cells (GC) for future applications in co-culture systems for follicle and oocyte maturation. Twenty volunteers submitted to ART donated their granulosa cells after oocyte retrieval, 10 were cultivated previously in order to interrupt the luteinization process and then frozen \"Cryostep\" container (group 2C- two cultures) (step 2) and 10 were directly frozen with no previous culture in the \"Cryostep\" container (group DF- direct freeze) (step 3). After thawing these cells were (re)cultured for 144 hours, with medium exchange at 48, 96 and 144 hours to evaluate the estradiol (E2) and progesterone (P4) production (ng/mL). After thawing, there was a reduction in the cell number (p<0,05) and cell viability in both methods, the direct freezing (DF) and the two cultures (2C) (p<0,05); this had an impact in the production of estradiol and progesterone, which were higher in fresh cultures than in the frozen ones (p<0,05). However, the E2/cell ratio was maintained after thawing (p=0.23), suggesting that this impairment in steroid production was probably due to the reduction in the cell count. The cells that survive remain functionally normal. The DF was more efficient since it allowed greater cell recovery and better viability when compared to 2C. The estradiol/progesterone ratio was maintained in all culture times, in the fresh, DF or 2C groups (p>0.05), indicating that the functional characteristic of these cells was preserved post-thawing. We conclude that cryopreservation of human GC obtained during oocyte retrieval compromises the cell count and the overall viability of the culture; however, the functional capacity and the characteristic of these cells are preserved (maintenance of E2/cell and E2/P4 relations)

Introdução:Até 60% das mulheres com endometriose apresentam como sintoma a infertilidade. Entretanto, os mecanismos envolvidos ainda permanecem não totalmente esclarecidos, especialmente quando não há distorção da anatomia pélvica. A etiologia multifatorial e comprometimento poligênico nesta doença têm sido amplamente aceitos. A aromatase é uma molécula das mais estudadas e há evidências de aumento da expressão do seu gene no endométrio eutópico e ectópico na endometriose. Esta enzima, codificada pelo gene CYP19A1, converte andrógenos a estrógenos e está presente normalmente nas células da granulosa, onde é fundamental para a produção esteroidogênica intrafolicular. Estudos in vitropor cultivo de células da granulosa, mostraram redução da atividade da aromatase em mulheres com endometriose. Devido à escassez de estudos que analisem a expressão do seu gene (CYP19A1) nessas células foi o que estimulou a proposta deste estudo. Este trabalho tem porobjetivo medir a expressão do gene da aromatase por PCR em tempo real nas células da granulosa luteinizadas murais de mulheres com endometriose submetidas a técnicas de reprodução assistida. Pacientes e Métodos: Estudo caso-controle, com 11 mulheres com endometriose e 11 com os fatores tubáreo ou masculino de infertilidade,submetidas à hiperestimulação ovariana controlada (HOC) para reprodução assistida, num total de 12 ciclos para o grupo com endometriose e 11 para o controle. Não houve diferença entre as características clínicas dos dois grupos quanto à idade e parâmetros do ciclo de HOC. As células da granulosa murais foram coletadas de folículos pré-ovulatórios maduros no dia da captação oocitária e isoladas. Posteriormente, procedeu-se à extração do RNA (clorofórmio/ isopropanol) e à transcrição reversa. A PCR em tempo real foi realizada para quantificar os níveis de RNA mensageiro produzidos para o gene da aromatase, normalizados aos produtos do gene endógeno, ß-actina (expressão relativa). Todos os experimentos foram realizados em duplicata. Resultados: não houve diferença na expressão do gene CYP19A1 nas células da granulosa luteinizadas murais de mulheres com endometriose quando comparadas ao grupo controle (p>0,05; Mann Whitney), mesmo na comparação combinada considerando-se separadamente os diferentes graus de endometriose (controle vs. endometriose mínima/leve vs. endometriose moderada/grave, p>0,05;Kruskall Wallis). Conclusão:Os resultados deste estudo sugerem que a aromatase apresenta um mecanismo complexo de controle para sua expressão gênica nas células da granulosa e, apesar de evidências prévias de sua reduzida atividade nessas células na endometriose, a expressão de seu gene parece não estar afetada pela doeça, de acordo com o presente estudo. / Background: Up to 60% of women with endometriosis have infertility symptoms. However, mechanisms remain unclear, mainly when there is no distortion of pelvic anatomy. The multifactorial etiology and polygenic involvement of this disease have been widely accepted. Aromatase is one of the most studied molecules and there are evidences of increased expression of its gene (CYP19A1) on eutopic and ectopic endometrium in endometriosis. This enzyme, codified by the CYP19A1 gene, converts androgens to estrogens and is normally present in granulosa cells, where it plays an essential role for the intrafollicle steroidogenic production. In vitrostudies by granulosa cells culture have demonstrated reduced aromatase activity in women with endometriosis. The scarcity of studies assessing expression of the aromatase gene (CYP19A1) on these target cells stimulated the proposal of this research. The aim of this study is to quantify aromatase gene expression, by real-time PCR, in mural lutein-granulose cells of women with endometriosis undergoing assisted reproduction techniques. Patients and Methods: a case-control study was conducted on 11 women with endometriosis and 11 with male or tubal causes of infertility submitted to ovarian hyperstimulation (HOC), with a total of 12 cycles for endometriosis and 11 for the control group. There was no difference between the groups regarding age or HOC parameters. Mural lutein-granulosacells were harvested from pre-ovulatory follicles during oocyte retrieval and properly isolated. Later, RNA extraction (clorophorm/isopropanol) and reverse transcription were performed. Real-time PCR was run to quantify RNAm products of aromatase gene normalized to those from the control gene, beta-actin (relative expression). All experiments were carried out in duplicate. Results: there was no difference between the groups regarding the gene expression of CYP19A1 (aromatase) gene on mural lutein-granulosa cells (p>0.05, Mann Whitney), even if we consider separately the different stages of endometriosis (control vs. minimal/mild vs. moderate/severe, p>0.05, Kruskall Wallis). Conclusion: These results suggest that aromatase may have a complex control of its gene expression on granulosa cells and, despite of previous evidences showing its reduced activity on these target cells in endometriosis, the gene expression seems not affected by the disease, according to this study.

Introdução:Até 60% das mulheres com endometriose apresentam como sintoma a infertilidade. Entretanto, os mecanismos envolvidos ainda permanecem não totalmente esclarecidos, especialmente quando não há distorção da anatomia pélvica. A etiologia multifatorial e comprometimento poligênico nesta doença têm sido amplamente aceitos. A aromatase é uma molécula das mais estudadas e há evidências de aumento da expressão do seu gene no endométrio eutópico e ectópico na endometriose. Esta enzima, codificada pelo gene CYP19A1, converte andrógenos a estrógenos e está presente normalmente nas células da granulosa, onde é fundamental para a produção esteroidogênica intrafolicular. Estudos in vitropor cultivo de células da granulosa, mostraram redução da atividade da aromatase em mulheres com endometriose. Devido à escassez de estudos que analisem a expressão do seu gene (CYP19A1) nessas células foi o que estimulou a proposta deste estudo. Este trabalho tem porobjetivo medir a expressão do gene da aromatase por PCR em tempo real nas células da granulosa luteinizadas murais de mulheres com endometriose submetidas a técnicas de reprodução assistida. Pacientes e Métodos: Estudo caso-controle, com 11 mulheres com endometriose e 11 com os fatores tubáreo ou masculino de infertilidade,submetidas à hiperestimulação ovariana controlada (HOC) para reprodução assistida, num total de 12 ciclos para o grupo com endometriose e 11 para o controle. Não houve diferença entre as características clínicas dos dois grupos quanto à idade e parâmetros do ciclo de HOC. As células da granulosa murais foram coletadas de folículos pré-ovulatórios maduros no dia da captação oocitária e isoladas. Posteriormente, procedeu-se à extração do RNA (clorofórmio/ isopropanol) e à transcrição reversa. A PCR em tempo real foi realizada para quantificar os níveis de RNA mensageiro produzidos para o gene da aromatase, normalizados aos produtos do gene endógeno, ß-actina (expressão relativa). Todos os experimentos foram realizados em duplicata. Resultados: não houve diferença na expressão do gene CYP19A1 nas células da granulosa luteinizadas murais de mulheres com endometriose quando comparadas ao grupo controle (p>0,05; Mann Whitney), mesmo na comparação combinada considerando-se separadamente os diferentes graus de endometriose (controle vs. endometriose mínima/leve vs. endometriose moderada/grave, p>0,05;Kruskall Wallis). Conclusão:Os resultados deste estudo sugerem que a aromatase apresenta um mecanismo complexo de controle para sua expressão gênica nas células da granulosa e, apesar de evidências prévias de sua reduzida atividade nessas células na endometriose, a expressão de seu gene parece não estar afetada pela doeça, de acordo com o presente estudo. / Background: Up to 60% of women with endometriosis have infertility symptoms. However, mechanisms remain unclear, mainly when there is no distortion of pelvic anatomy. The multifactorial etiology and polygenic involvement of this disease have been widely accepted. Aromatase is one of the most studied molecules and there are evidences of increased expression of its gene (CYP19A1) on eutopic and ectopic endometrium in endometriosis. This enzyme, codified by the CYP19A1 gene, converts androgens to estrogens and is normally present in granulosa cells, where it plays an essential role for the intrafollicle steroidogenic production. In vitrostudies by granulosa cells culture have demonstrated reduced aromatase activity in women with endometriosis. The scarcity of studies assessing expression of the aromatase gene (CYP19A1) on these target cells stimulated the proposal of this research. The aim of this study is to quantify aromatase gene expression, by real-time PCR, in mural lutein-granulose cells of women with endometriosis undergoing assisted reproduction techniques. Patients and Methods: a case-control study was conducted on 11 women with endometriosis and 11 with male or tubal causes of infertility submitted to ovarian hyperstimulation (HOC), with a total of 12 cycles for endometriosis and 11 for the control group. There was no difference between the groups regarding age or HOC parameters. Mural lutein-granulosacells were harvested from pre-ovulatory follicles during oocyte retrieval and properly isolated. Later, RNA extraction (clorophorm/isopropanol) and reverse transcription were performed. Real-time PCR was run to quantify RNAm products of aromatase gene normalized to those from the control gene, beta-actin (relative expression). All experiments were carried out in duplicate. Results: there was no difference between the groups regarding the gene expression of CYP19A1 (aromatase) gene on mural lutein-granulosa cells (p>0.05, Mann Whitney), even if we consider separately the different stages of endometriosis (control vs. minimal/mild vs. moderate/severe, p>0.05, Kruskall Wallis). Conclusion: These results suggest that aromatase may have a complex control of its gene expression on granulosa cells and, despite of previous evidences showing its reduced activity on these target cells in endometriosis, the gene expression seems not affected by the disease, according to this study.

Orientador: Marco Antonio Alvarenga / Resumo: O hormônio Anti-Mülleriano (AMH) tem sido proposto como marcador fidedigno da reserva ovariana, estimando a expectativa de vida reprodutiva remanescente da fêmea. Atualmente, em reprodução assistida humana, tem sido utilizado para determinar o tratamento a ser seguido e conduzir a expectativa da paciente. Em equinos, pouco se sabe sobre a produção de AMH e sua importância clínica. Sendo assim, o objetivo principal deste estudo foi descrever a concentração de AMH ao longo da vida das éguas e avaliar sua concentração após ovariectomia, em busca de relacionar AMH com reserva folicular ovariana. Foram realizados 2 experimentos. Experimento 1: Foi realizada a colheita de sangue de 1058 éguas Quarto de Milha, de 1 dia a 33 anos de idade, com o objetivo de relacionar AMH com a idade da égua. Experimento 2: 13 éguas (6 jovens e 7 idosas) foram submetidas a duas cirurgias de ovariectomia com intervalo médio de 111 dias. Amostras de sangue para dosagem de AMH foram retiradas imediatamente antes da primeira cirurgia e diariamente durante 15 dias. Na segunda cirurgia, amostras de sangue foram coletadas imediatamente antes da cirurgia e 15 dias após a mesma. AMH foi dosado por técnica de ELISA (Equine AMH ELISA; Ansh Labs, Webster, TX, USA). Testes não paramétricos foram utilizados para confrontar as medianas dos níveis de AMH entre diferentes categorias de idade e médias dos períodos pré e pós operatórios. A idade foi responsável por somente 5% da variabilidade dos níveis de AMH. A conc... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Doutor

As técnicas de cultivo de folículos e oócitos in vitro, com o objetivo de se obter oócitos maduros para procedimentos de Reprodução Assistida (RA), têm sido aplicadas em diferentes contextos. O sucesso destes procedimentos está diretamente relacionado ao sistema de cultivo utilizado. A utilização de células da granulosa (CG) humanas cultivadas in vitro como um suporte para o co-cultivo destes oócitos imaturos e folículos tem sido descrita por alguns autores. A criopreservação destas células, considerando-se o contexto de sua obtenção em procedimentos de RA, permitiria a viabilização da aplicação destas células na prática clínica diária. Sendo assim, o objetivo deste estudo foi padronizar o congelamento de células da granulosa (CG) humanas para aplicação em sistemas de co-cultivos de folículos e oócitos imaturos. Foram obtidas CG de 20 voluntárias em tratamento de reprodução assistida, células de 10 voluntárias foram cultivadas em meio ?-MEM suplementado para interrupção da luteinização e congeladas após 48 horas em container \"Cryostep\" (grupo 2C- 2 cultivos) (etapa 2) e células de 10 voluntárias foram congeladas em container \"Cryostep\" sem cultivo prévio (grupo CD- congelamento direto) (etapa 3). Após o descongelamento estas células foram (re)cultivadas por 144 horas, com troca de meio em 48, 96 e 144 horas para avaliações da produção de estradiol (E2) e progesterona (P4) (ng/mL). Verificamos redução na contagem celular e na viabilidade celular tanto no método de congelamento direto (CD) quanto no método com dois cultivos (2C) após o descongelamento (p<0,05), e isso se refletiu na produção de estradiol e progesterona que foi maior nas culturas de células frescas em relação às células criopreservadas (p<0,05). Porém, a relação de E2/célula foi mantida após o descongelamento, sugerindo que esta redução na produção se deve à redução no número de células, as que sobrevivem se mantém normofuncionantes (p=0,23).O CD foi mais eficiente pois permitiu uma maior recuperação celular e uma melhor viabilidade quando comparado ao grupo 2C. A relação estradiol/progesterona foi mantida em todos os tempos de cultivo, fresco, CD e 2C (p>0,05), indicando que a característica funcional destas células foi preservada após o descongelamento. Concluímos que a criopreservação de CG humanas obtidas durante a captação de oócitos compromete a contagem celular e a viabilidade geral da cultura, entretanto, a capacidade funcional e a característica destas células se mantêm preservadas (manutenção das relações E2/célula e E2/P4) / Follicle and oocyte in vitro culture techniques, aiming to obtain mature oocytes for Assisted Reproductive Treatments (ART), have been applied to different contexts. The success of these procedures depends on the culture system used. The use of human granulosa cells (GC) in co-culture systems for follicle and oocyte maturation have been described by some authors. The cryopreservation of these cells, considering the context in which they are obtained during ART, would enable the usage of these cells in such procedures in daily clinical practice. Thus, the objective of this study was to standardize the freezing protocol for human granulosa cells (GC) for future applications in co-culture systems for follicle and oocyte maturation. Twenty volunteers submitted to ART donated their granulosa cells after oocyte retrieval, 10 were cultivated previously in order to interrupt the luteinization process and then frozen \"Cryostep\" container (group 2C- two cultures) (step 2) and 10 were directly frozen with no previous culture in the \"Cryostep\" container (group DF- direct freeze) (step 3). After thawing these cells were (re)cultured for 144 hours, with medium exchange at 48, 96 and 144 hours to evaluate the estradiol (E2) and progesterone (P4) production (ng/mL). After thawing, there was a reduction in the cell number (p<0,05) and cell viability in both methods, the direct freezing (DF) and the two cultures (2C) (p<0,05); this had an impact in the production of estradiol and progesterone, which were higher in fresh cultures than in the frozen ones (p<0,05). However, the E2/cell ratio was maintained after thawing (p=0.23), suggesting that this impairment in steroid production was probably due to the reduction in the cell count. The cells that survive remain functionally normal. The DF was more efficient since it allowed greater cell recovery and better viability when compared to 2C. The estradiol/progesterone ratio was maintained in all culture times, in the fresh, DF or 2C groups (p>0.05), indicating that the functional characteristic of these cells was preserved post-thawing. We conclude that cryopreservation of human GC obtained during oocyte retrieval compromises the cell count and the overall viability of the culture; however, the functional capacity and the characteristic of these cells are preserved (maintenance of E2/cell and E2/P4 relations)

Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico / The objective of this study was to investigate the factors controling the expression of angiotensin II (AngII) receptors and to determine the physiological role of AngII in granulosa cells. The AGTR2 receptor was localized in granulosa (and theca) cells from follicles of different sizes. Bovine ovaries were collected at a local abattoir and small follicles (2-5mm) were isolated for harvesting granulosa cells. The cells were cultured in free medium serum in non-luteinizing conditions without FSH (control group) or with graded doses of FSH or IGF1. In other cultures, cells were cultured with or without IGF1 and bone morphogenetic protein-7 (BMP-7), and fibroblast growth factor-2 (FGF-2). Treatment with FSH, IGF1 and BMP-7 increased (P<0.05) estradiol secretion and AGTR2 mRNA expression relative to control cultures. In contrast, none of these treatments affected AGTR1 receptor expression. Addition of FGF-2 significantly decreased estradiol secretion but did not affect AGTR1 or AGTR2 expression. Cells were cultured with FSH plus graded doses of FGF-7 or FGF-10, and the effects of these factors on AGTR2 protein levels were measured by Western blot. AGTR2 protein levels decreased in the groups treated with FGF-7 (10 and 100ng/ml) and FGF-10 (all concentrations; P<0.05), and estradiol secretion was significantly inhibited by the highest dose of each FGF (P<0.05). Bovine follicles greater than 5 mm diameter were dissected and granulosa and theca cells were separated for RNA extraction, and follicle fluid assayed for estradiol (E2) and progesterone (P) content. Non-atretic follicles (P less than 100ng/ml) were classed as estrogenic (E2 greater than 100ng/ml) or non-estrogenic (E2 less than 40ng/ml). There were no differences in AGTR1 receptor expression in theca and granulosa cells between estrogenic and nonestrogenic follicles. Likewise, there were no changes in AGTR2 receptor expression in theca cells with follicle state. However, AGTR2 receptor mRNA levels were significantly higher in granulosa cells of estrogenic compared to non-estrogenic follicles (P<0.01), and AGTR2 receptor mRNA was correlated with E2 concentrations in follicular fluid. To determine the physiological consequences of AT activation in granulosa cells, cells from small (2-5mm) bovine follicles were cultured in serum-free medium with FSH ± AngII. The addition of AngII had no effect on estradiol or progesterone secretion, but significantly inhibited protease nexin-1 (PN-1) mRNA levels and protein secretion (P<0.05). PN-1 is an inhibitor of proteases involved in extracellular matrix remodeling and follicle rupture. Bovine granulosa cells from large (>10 mm) follicles were cultured for 6h, 12h and 24h with LH (100ng/ml) or AngII, with or without angiotensin receptor blocker (losartan for AGTR1 and PD123,319 for AGTR2). These cells expressed Ptgs2 under basal culture conditions, which was not upregulated by either LH or AngII alone. However, LH and AngII in combination significantly enhanced Ptgs2 (P<0.05) mRNA and protein accumulation. Similarly, expression of the proteolytic enzymes uPA and tPA, and their inhibitor, PN-1, were upregulated by the combination of LH and AngII but not by either factor alone. The addition of AGTR blockers inhibited the effect of AngII. In conclusion, AGTR2 receptor is present in granulosa bovine cells, and mRNA and protein are regulated by FSH, IGF-1, BMP-7, FGF-7 and FGF-10 in bovine granulosa cells in vitro, AGTR2 but not AGTR1 receptor mRNA levels are regulated during follicular growth in cattle, and that AngII regulates granulosa PN-1 secretion. These data suggest that AngII is a physiological co-factor necessary for the expression of genes in granulosa cells that are critical for ovulation. / O objetivo deste trabalho foi estabelecer o controle de expressão dos receptores de angiotencina II (AngII) e determinar a ação fisiológica da AngII em células da granulosa (CG) cultivadas in vitro. Os receptores de AngII tipo 1 (AGTR1) e tipo 2 (AGTR2) foram localizados em folículos de bovinos de diferentes tamanhos. Verificouse que as CG de bovinos provenientes de folículos entre 2- 5 mm e cultivadas com FSH, IGF-1, BMP-7 apresentaram aumento na expressão do receptor AGTR2 (P<0,05) em relação ao grupo controle (GC), bem como aumento da secreção de estradiol (E2; P<0,05). Em contraste, as CG tratadas com 10 ng/ml de FGF-2 ou 10 e 100 ng/ml de FGF-7 e FGF-10 apresentaram uma redução na secreção de E2 (P<0,05), porém somente os grupos FGF-7 e 10 nas doses 10 e 100 ng/ml reduziram (P<0,05) a expressão do receptor AGTR2. Para os dois experimentos, não houve diferença na expressão do receptor AGTR1 entre o GC e os grupos tratados. As CG e células da teca (CT) foram coletadas de ovários provenientes de abatedouro para extração de RNA e o fluido folicular para dosagem de E2 e progesterona P4. Esses folículos foram classificados como dominantes (FD; P4<100ng/ml e E2>100ng/ml) e atrésicos (FA; P4>40ng/ml). A expressão dos receptores AGTR1 e AGTR2 foi mensurada por RTPCR. Não houve diferença na expressão do receptor AGTR1 entre FD e FA. No entanto, o receptor AGTR2 apresentou um aumento (P<0,05) na expressão em CG de FD em relação a FA. A expressão do receptor AGTR1 se manteve constante em CG e CT de FD e FA. Para determinar os afeitos da AngII através da ativação de seus receptores CG foram cultivadas em meio livre de soro com FSH e/ou AngII. A AngII não apresentou efeito na secreção de E2 ou P4, mas inibiu (P<0.05) mRNA e proteína para a protease nexin-1 (PN-1). Considerando a redução de expressão da PN-1 envolvida no controle do remodelamento da matriz extracelular (RME), é possível especular um efeito de AngII sobre RME durante o desenvolvimento folicular. Em um terceiro experimento, as CG de folículos grandes (>10mm) foram cultivadas durante 6h, 12h e 24h na presença de Ang (10-5) com ou sem LH (100ng/ml). A combinação de AngII e LH aumentou significativamente (P<0,05) a expressão de mRNA e proteína para COX-2, ativador do plasminogênio tipo U e T, bem como para PN-1. Entretanto, AngII ou LH não aumentaram a expressão de COX-2. O aumento da expressão destes gene indica uma função de AngII no processo de ovulação através das CG. Em um segundo momento, verificou-se através de qual receptor a AngII atua para controlar a expressão desses genes. As CG foram cultivadas por 6h com LH e/ou AngII com ou sem inibidores específicos para o receptor AGTR1 (losartan) e AGTR2 (PD123,319). Os resultados demonstraram que a presença do inibidor de AGTR2 bloqueou o efeito da associação de LH e AngII em relação ao grupo controle (P<0.05), demonstrado que a ação da AngII é mediada pelo receptor AGTR2 em CG. Em conclusão, o receptor AGTR2 está presente nas células da granulosa de bovinos e o mRNA para o receptor AGTR2 é regulado durante o crescimento folicular. Além disso, a expressão do mRNA e a tradução da proteína para o AGTR2 são reguladas por FSH, IGF-1, BMP-7, FGF-7 e FGF-10 em CG de bovinos cultivadas in vitro. Os dados também sugerem que AngII regula a proteína PN-1 em CG e age como um co-fator fisiológico necessário para a ovulação.