Orientador: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Lindsay Unno Gimenes / Banca: Claudia Lima Verde Leal / Resumo: Este estudo foi desenvolvido com o objetivo de avaliar o efeito do precursor do peptídeo natriurético tipo C (NPPC) durante o cultivo de pré-maturação in vitro (pré-MIV) de oócitos bovinos sobre: 1) a progressão da maturação nuclear; 2) a expressão gênica das células do cumulus e 3) a aquisição da competência do oócito para o desenvolvimento embrionário in vitro. Os complexos cumulus-oócito (CCOs) foram pré-MIV com 100 nM NPPC por 8 horas (grupo NPPC) e, ao final do período, foram lavados para completa remoção do NPPC e submetidos à MIV por 22h. Após 8h de pré-MIV e após 8h de pré-MIV seguidas de 22h de MIV (duração total do cultivo = 30h) foram avaliadas a progressão da maturação nuclear e a expressão relativa de mRNA nas células do cumulus. O grupo controle (C) foi maturado na ausência de NPPC por até 30h, e as mesmas avaliações anteriores foram realizadas imediatamente após a remoção do ambiente folicular (C0), após 8h de cultivo (C8), após 22h de cultivo (C22) e após 30h de cultivo (C30). Em outro experimento, cujos tratamentos foram idênticos aos supramencionados, os oócitos foram fecundados ao término da MIV e foi avaliado o desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos. Após 8h de cultivo de pré-MIV, a análise da progressão da meiose demonstrou que o grupo C0 apresentou 58,9% de estruturas com configuração de GV1, enquanto que o grupo C8 apresentou apenas 13,9% de estruturas nesta configuração (P<0,05). A proporção de GV1 no grupo NPPC foi semelhante a ambos e... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The aim of this study was to evaluate the effect of the C-type natriuretic peptide precursor (NPPC) during pre in vitro maturation culture (pre-IVM) of bovine oocytes on: 1) nuclear maturation progress; 2) gene expression in cumulus cells and 3) acquisition of competence for in vitro embryo development. Cumulus oocyte complexes (COCs) were pre-IVM with 100 nM NPPC for 8 hours (NPPC group) and then were washed for the complete removal of NPPC and submitted to IVM for 22h. After 8h pre-IVM followed by 22h IVM (total culture time = 30h) oocytes were evaluated for nuclear maturation progress and cumulus cells for relative mRNA expression. Control group (C) was IVM in the absence of NPPC for up to 30h and the same evaluations were made immediately after follicle removal (C0) and after 8h (C8), 22h (C22) and after 30h of culture (C30). In another experiment with the same treatment, the oocytes were fertilized at the end of IVM and embryo development to the blastocyst stage was evaluated. After 8 hours of pre-IVM culture, meiosis progression analysis showed 58.9% of oocytes in GV1 configuration in C0, while C8 had only 13.9% (P<0.05). The GV1 rates in NPPC did not differ from any group (22.8%; P>0.05). On the other hand, C8 showed higher rates of GV3 in comparison with C0 (53.1% vs. 3.62%; p<0.05) and no differences compared to NPPC (38.7%; P<0.05). At the end of IVM culture, no differences between groups (C22 vs. NPPC vs. C30) were observed in nuclear maturation, however, higher rates of degenerated oocytes were observed in C30 in comparison with C22 (11.4% vs. 2.8%; P<0.05). The relative gene expression analysis in cumulus cells after 8h pre-IVM with NPPC showed an up-regulation in genes related to cumulus cells expansion (GREM1, PTGS2/COX2, PTX3, TNFAIP6 and VCAN), oocyte maturation (BDNF, EGFR, NOS3, PDE5A, PRKCD e STAT3) a... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre

Orientador: Sony Dimas Bicudo / Banca: Eunice Oba / Resumo: O presente estudo visou avaliar a resposta ovariana a superestimulação utilizando 80UI de FSH e 300UI de eCG após ablação por laparoscopic ovum pic-up (LOPU1) de todos os folículos visíveis presentes em ambos os ovários. Determinar o melhor momento para realização de uma nova LOPU (LOPU2), mediante a avaliação ultrassonográfica dos ovários a cada 12 horas após LOPU1. E comparar a respostas ovariana do tratamento Duplo LOPU (DLOPU) com o tratamento One Shot adaptado de Baldassarre (1996), quanto a quantidades dos Complexos Cumulos-Oócito (COCs), e qualidade das estruturas obtidas e após processo de maturação in vitro (MIV) por 24 horas. Foi determinado o momento para realização da LOPU2 em 36 horas após a superestimulação. A média de folículos presentes na avaliação ultrassonográfica imediatamente antes a LOPU em ambos os tratamentos foi cerca de 9 estruturas, não diferindo da media de folículos aspirados, a taxa de recuperação comum aos dois tratamentos foi de 62,5%. A avaliação imediata das estruturas obtidas bem como a após 24 de MIV demonstrou que não houve diferença qualitativa COCs entre os tratamentos / Abstract: The present study aimed to evaluate the ovarian response to superstimulation using 80UI FSH and eCG 300UI after ablation LOPU (LOPU1) of all follicles present in both ovaries. Determine mlehor time to make a new LOPU (LOPU2) by ultrasound evaluation of the ovaries every 12 hours LOPU1. And comparing the responses ovarian DLOPU treatment with the treatment Ono Shot adapted Baldassarre (1996) with the DLOPU described here, the amounts of COC and quality of the structures obtained after process and IVM for 24 hours. It was determined the time for completion of LOPU2 in 36 hours after the overstimulation. The mean number of follicles present in the ultrasonographic evaluation immediately before the LOPU in both treatments was about 9 structures did not differ from follicles aspirated media, the recovery rate common to the two treatments was 62.5%. Immediate assessment of the structures obtained as well as after 24 IVM demonstrated that COCs do not hear qualitative difference between treatments / Mestre

Orientador: Fernanda da Cruz Landim / Banca: João Carlos Pinheiro Ferreira / Banca: Maria Denise Lopes / Banca: Alício martins Júnior / Banca: Edson Guimarães Lo Turco / Resumo: Este trabalho teve como objetivo geral averiguar o efeito da BL-I e da ROS em bloquear temporariamente a retomada da meiose, atuando sobre os fatores que controlam o ciclo celular meiótico de oócitos bovinos e a expansão das células do cumulus oophoros. No Experimento I, os oócitos permaneceram em meio MIV durante 6, 12 e 24 h na presença de duas concentrações de ROS (12,5 μM e 25 μM) ou na presença de BL-I (50 μ e 100 μM) ou na presença da associação de ROS (6,25 μM) + BL-I (25 μM) e em seguida foram cultivados em meio MIV livre de fármacos por 18 h, 12 h ou 24 h. Após esse tempo, os oócitos inibidos por 6 ou 12 h foram fertilizados e cultivados in vitro. O tratamento com ROS e BL-I não resultou em atraso na quebra da vesícula germinativa em relação ao controle. Entretanto, quando utilizados por 24 h, elevadas taxas de degeneração oocitária foram encontradas. Quando estes fármacos foram utilizados por 12 h com reversão por mais 12 h, verificamos uma menor taxa produção de blastocistos em relação ao grupo controle. No entanto, após a retirada do bloqueio por 6 h e maturação por 18 h um maior número de oócitos tratados tanto com ROS, como BL-I encontraram-se em MII. Da mesma forma, ao reduzirmos a dose e o tempo de inibição, os grupos tratados por 6 h de inibição meiótica e reversão por 18 h apresentaram taxas de produção embrionária similares ao grupo controle. No Experimento II, os oócitos permaneceram em meio MIV durante 6h na presença de 12,5 μM de ROS ou na presença de 50 μM de BL-I ou com a associação de ROS (6,25 μM) + BL-I (25 μM) sendo em seguida cultivados em meio MIV livre de fármacos por 18 h. Após esse tempo, os oócitos inibidos foram fertilizados, cultivados in vitro e os embriões produzidos foram submetidos a vitrificação. Os grupos BI-I e ROS + BL-I apresentaram superioridade de produção embrionária, tanto em relação ao grupo ROS como o controle. O grupo ... / Abstract: This work had as main objective to investigate the effect of BL-I and ROS in temporarily blocking the resumption of meiosis, acting on the factors that control the meiotic cell cycle of bovine oocytes and expansion of cumulus oophoros cells. In Experiment I, the oocytes remained in IVM mediafor 6, 12 and 24h in the presence of two concentrations of ROS (12.5 μM and 25 μM) or in the presence of BL-I (50 μ to 100 mM) or the association of ROS (6.25 μM) + BL-I (25 μM) and then cultured in a drug-free IVM media for 18, 12 or 24 h. After this time, the inhibited oocytes by 6 or 12 h were fertilized and cultured in vitro. Treatment with ROS and BL-I did not resulted in delay in germinal vesicle breakdown in relation to control. However, when used for 24 h, higher rates of oocyte degeneration were found. When these drugs were used for 12 h with reversion for more than 12 h, a lower blastocyst production rate compared to the control group was verified. However, after removal of the blockage for 6 h and maturation for 18 h, a higher number of oocytes treated with both ROS and BL-I were found in MII. Similarly, when the dose and duration of inhibition were reduced, the groups treated for 6 h of meiotic inhibition and reversion for 18 h showed similar embryo production rates to the control group. In Experiment II, oocytes remained in IVM mediafor 6 h in the presence of 12.5 μM of ROS or the presence of 50 μM of BL-I or the association of ROS (6.25 μM) + BL-I (25 μM) and then cultured in drug-free IVM media for 18 h. After this time, the inhibited oocytes were fertilized in vitro and the produced embryos were submitted to vitrification. The BI-I and ROS + BL-I groups showed superiority in embryo production, both in relation to the control as ROS group. The ROS + BL-I group showed higher rate of re-expansion after vitrification. Additionally, embryos from BL-I and BL-I + ROS showed lower number of apoptotic cells when compared to ... / Doutor

Made available in DSpace on 2015-10-06T13:03:00Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2013-09-27. Added 1 bitstream(s) on 2015-10-06T13:19:07Z : No. of bitstreams: 1 000847150.pdf: 860477 bytes, checksum: 76e841df35fa2f2e934e0f4bedb91cbc (MD5) / O presente estudo visou avaliar a resposta ovariana a superestimulação utilizando 80UI de FSH e 300UI de eCG após ablação por laparoscopic ovum pic-up (LOPU1) de todos os folículos visíveis presentes em ambos os ovários. Determinar o melhor momento para realização de uma nova LOPU (LOPU2), mediante a avaliação ultrassonográfica dos ovários a cada 12 horas após LOPU1. E comparar a respostas ovariana do tratamento Duplo LOPU (DLOPU) com o tratamento One Shot adaptado de Baldassarre (1996), quanto a quantidades dos Complexos Cumulos-Oócito (COCs), e qualidade das estruturas obtidas e após processo de maturação in vitro (MIV) por 24 horas. Foi determinado o momento para realização da LOPU2 em 36 horas após a superestimulação. A média de folículos presentes na avaliação ultrassonográfica imediatamente antes a LOPU em ambos os tratamentos foi cerca de 9 estruturas, não diferindo da media de folículos aspirados, a taxa de recuperação comum aos dois tratamentos foi de 62,5%. A avaliação imediata das estruturas obtidas bem como a após 24 de MIV demonstrou que não houve diferença qualitativa COCs entre os tratamentos / The present study aimed to evaluate the ovarian response to superstimulation using 80UI FSH and eCG 300UI after ablation LOPU (LOPU1) of all follicles present in both ovaries. Determine mlehor time to make a new LOPU (LOPU2) by ultrasound evaluation of the ovaries every 12 hours LOPU1. And comparing the responses ovarian DLOPU treatment with the treatment Ono Shot adapted Baldassarre (1996) with the DLOPU described here, the amounts of COC and quality of the structures obtained after process and IVM for 24 hours. It was determined the time for completion of LOPU2 in 36 hours after the overstimulation. The mean number of follicles present in the ultrasonographic evaluation immediately before the LOPU in both treatments was about 9 structures did not differ from follicles aspirated media, the recovery rate common to the two treatments was 62.5%. Immediate assessment of the structures obtained as well as after 24 IVM demonstrated that COCs do not hear qualitative difference between treatments

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:15Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-03-17Bitstream added on 2015-05-14T16:59:09Z : No. of bitstreams: 1 000829407.pdf: 3139564 bytes, checksum: ac15cce43cb3520f922ab5d6b73802ab (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / Este trabalho teve como objetivo geral averiguar o efeito da BL-I e da ROS em bloquear temporariamente a retomada da meiose, atuando sobre os fatores que controlam o ciclo celular meiótico de oócitos bovinos e a expansão das células do cumulus oophoros. No Experimento I, os oócitos permaneceram em meio MIV durante 6, 12 e 24 h na presença de duas concentrações de ROS (12,5 μM e 25 μM) ou na presença de BL-I (50 μ e 100 μM) ou na presença da associação de ROS (6,25 μM) + BL-I (25 μM) e em seguida foram cultivados em meio MIV livre de fármacos por 18 h, 12 h ou 24 h. Após esse tempo, os oócitos inibidos por 6 ou 12 h foram fertilizados e cultivados in vitro. O tratamento com ROS e BL-I não resultou em atraso na quebra da vesícula germinativa em relação ao controle. Entretanto, quando utilizados por 24 h, elevadas taxas de degeneração oocitária foram encontradas. Quando estes fármacos foram utilizados por 12 h com reversão por mais 12 h, verificamos uma menor taxa produção de blastocistos em relação ao grupo controle. No entanto, após a retirada do bloqueio por 6 h e maturação por 18 h um maior número de oócitos tratados tanto com ROS, como BL-I encontraram-se em MII. Da mesma forma, ao reduzirmos a dose e o tempo de inibição, os grupos tratados por 6 h de inibição meiótica e reversão por 18 h apresentaram taxas de produção embrionária similares ao grupo controle. No Experimento II, os oócitos permaneceram em meio MIV durante 6h na presença de 12,5 μM de ROS ou na presença de 50 μM de BL-I ou com a associação de ROS (6,25 μM) + BL-I (25 μM) sendo em seguida cultivados em meio MIV livre de fármacos por 18 h. Após esse tempo, os oócitos inibidos foram fertilizados, cultivados in vitro e os embriões produzidos foram submetidos a vitrificação. Os grupos BI-I e ROS + BL-I apresentaram superioridade de produção embrionária, tanto em relação ao grupo ROS como o controle. O grupo ... / This work had as main objective to investigate the effect of BL-I and ROS in temporarily blocking the resumption of meiosis, acting on the factors that control the meiotic cell cycle of bovine oocytes and expansion of cumulus oophoros cells. In Experiment I, the oocytes remained in IVM mediafor 6, 12 and 24h in the presence of two concentrations of ROS (12.5 μM and 25 μM) or in the presence of BL-I (50 μ to 100 mM) or the association of ROS (6.25 μM) + BL-I (25 μM) and then cultured in a drug-free IVM media for 18, 12 or 24 h. After this time, the inhibited oocytes by 6 or 12 h were fertilized and cultured in vitro. Treatment with ROS and BL-I did not resulted in delay in germinal vesicle breakdown in relation to control. However, when used for 24 h, higher rates of oocyte degeneration were found. When these drugs were used for 12 h with reversion for more than 12 h, a lower blastocyst production rate compared to the control group was verified. However, after removal of the blockage for 6 h and maturation for 18 h, a higher number of oocytes treated with both ROS and BL-I were found in MII. Similarly, when the dose and duration of inhibition were reduced, the groups treated for 6 h of meiotic inhibition and reversion for 18 h showed similar embryo production rates to the control group. In Experiment II, oocytes remained in IVM mediafor 6 h in the presence of 12.5 μM of ROS or the presence of 50 μM of BL-I or the association of ROS (6.25 μM) + BL-I (25 μM) and then cultured in drug-free IVM media for 18 h. After this time, the inhibited oocytes were fertilized in vitro and the produced embryos were submitted to vitrification. The BI-I and ROS + BL-I groups showed superiority in embryo production, both in relation to the control as ROS group. The ROS + BL-I group showed higher rate of re-expansion after vitrification. Additionally, embryos from BL-I and BL-I + ROS showed lower number of apoptotic cells when compared to ... / FAPESP: 2010/18994-4

Made available in DSpace on 2015-05-14T16:53:23Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2014-12-04Bitstream added on 2015-05-14T16:58:53Z : No. of bitstreams: 1 000826973.pdf: 1421350 bytes, checksum: cb9046da915832bdb24f2e31bcc45a06 (MD5) / Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP) / O objetivo deste estudo foi quantificar a abundância de genes associados com a competência de desenvolvimento em oócitos (GDF-9, BMP15 e OOSP1) e nas células do cumulus (GREM1, PTGS2, PFKP, AREG, EREG, HAS2, VCAN, PTX3, ADAM10 e ADAM17), a partir de oócitos imaturos (VG), maturados in vivo (MIVO) e cultivados em meio de MIV com diferentes macromoléculas (SFB, BSA ou PVA), diferentes concentrações de EGF ou pré-cultivados com butirolactona I (BLI) antes da MIV. O delineamento experimental consistiu de três experimentos de MIV de oócitos bovinos, a saber: experimento 1, complexos cumulus-oócito maturados em meio de cultivo contendo 10% de SFB ou 1 mg/mL de PVA ou 4 mg/mL de BSA; experimento 2, complexos cumulus-oócito maturados em meio de cultivo contendo EGF (nas concentrações de 0, 10 e 100 ng/mL); e experimento 3, complexos cumulus-oócito maturados in vitro na ausência (BL0) ou presença de pré-maturação com 10 μM de BLI ( BL12, 12 horas de pré-maturação e 12 horas de MIV; BL24, 24 horas de prématuração e 24 horas de MIV). A quantidade relativa de transcritos para o gene GREM1, PTGS2, PFKP e AREG foi maior do que (P<0,05) nas células do cumulus de oócitos MIVO, nos experimentos 1 e 2 e para o gene GREM1 no experimento 3. No experimento 1, o grupo SFB exibiu maior (P<0,05) abundância de transcritos de GREM1 e AREG entre os grupos MIV. No experimento 2, a adição de 10 ng/mL ao meio de MIV propiciou uma regulação positiva de EREG. No experimento 3, BL12 apresentou maior (P<0,05) abundância de AREG e o BL24 de EREG e PTX3. Entre os grupos de MIV, o gene GREM1 foi expresso em maior quantidade (P<0,05) no BL12. Não houve diferença estatística nos experimentos 1, 2 e 3 entre os grupos de oócitos MIV, MIVO e VG para os genes GDF9, BMP15 e OOSP1. Conclui-se que, a utilização de diferentes macromoléculas, diferentes concentrações de EGF e a realização de précultivo com BLI altera a transcrição nas células ... / The aim of this study was to quantify the abundance of genes associated with the development of oocyte competence in oocytes (GDF-9, BMP15 and OOSP1) and in cumulus cells (GREM1, PTGS2, PFKP, AREG, EREG, HAS2, VCAN, PTX3, ADAM10 and ADAM-17) of immature oocytes (GV), in vivo matured (IVMO) and cultured in IVM medium with different macromolecules (FCS, BSA or PVA), different EGF concentrations or pre-cultured with butyrolactone I (BLI) before IVM. The experimental design consisted of three IVM experiments of bovine oocytes, namely: experiment 1, cumulus-oocyte complex matured in culture medium containing 10% FCS or 1 mg/mL PVA or 4 mg/mL BSA; Experiment 2, cumulus-oocyte complex matured in culture medium containing EGF (at concentrations of 0, 10 and 100 ng/mL); and Experiment 3, cumulus-oocyte complex in vitro matured in the absence (BL0) or presence of pre-maturation with 10 μM de BLI (BL12, 12 hours of pre-maturation and 12 hours of IVM, BL24, 24 hours of pre-maturation and 24 hours of IVM). The relative amount of transcripts for GREM1, PTGS2, PFKP and AREG gene was larger than (P <0.05) in cumulus cells of IVMO oocytes in experiments 1 and 2 and for GREM1 gene in experiment 3. In experiment 1, the FCS group exhibited higher (P <0.05) abundance of transcripts of GREM1 and AREG among MIV groups. In experiment 2, the addition of 10 ng/ml to the IVM medium provided an upregulation of EREG. In experiment 3, BL12 showed higher (P <0.05) abundance of AREG and BL24 of EREG and PTX3. Among IVM groups, the GREM1 gene was expressed in larger quantities (P <0.05) in BL12. There was no statistical difference in experiments 1, 2 and 3 among groups of oocytes IVM, IVMO and GV for GDF9, BMP15 and OOSP1 genes. It was concluded that the use of different macromolecules, different EGF concentrations and the performance of pre-culture with BLI change the transcription in the cumulus cell of genes associated with oocyte competence / FAPESP: 2011/20514-3

Made available in DSpace on 2015-08-20T17:09:38Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2015-02-03. Added 1 bitstream(s) on 2015-08-20T17:26:43Z : No. of bitstreams: 1 000836722_20170301.pdf: 180132 bytes, checksum: 753f2fc6bf6704d0d437a28d4b51d4f2 (MD5) Bitstreams deleted on 2017-03-03T11:01:29Z: 000836722_20170301.pdf,. Added 1 bitstream(s) on 2017-03-03T11:02:39Z : No. of bitstreams: 1 000836722.pdf: 980013 bytes, checksum: 2c92fb3c55ff70c48ea0cac62876c366 (MD5) / O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos da inibição da meiose com inibidores farmacológicos ou biológicos durante o transporte de oócitos bovinos por 6 horas sobre: 1) progressão da maturação nuclear; 2) maturação citoplasmática e 3) competência no desenvolvimento e qualidade dos embriões produzidos. Para tanto, o meio de transporte de oócitos foi suplementado com butirolactona-I (BL), milrinona (MR), IBMX e forskolina (CL) ou fluido folicular puro (FF) e o meio de maturação somente do grupo transportado com IBMX e forskolina foi suplementado com cilostamida. Os oócitos foram incubados em incubadora portátil (Minitub®) para simulação de transporte, durante 6h. Posteriormente, foram submetidos à maturação in vitro (MIV) até completar 24h e, em seguida, foram fecundados e os prováveis zigotos foram cultivados in vitro durante 7 dias. Foram feitos dois grupos controle no experimento I: MIV em 5% de CO2 em ar por 24h (C1); MIV por 6h na transportadora e mais 18h em 5% de CO2 em ar (C2). No experimento II foram feitos três grupos controle: MIV com 10% de SFB (Contr SFB); MIV com 0,6% de BSA (Contr BSA); MIV por 6h na transportadora e mais 18h em 5% de CO2 em ar (Contr Transp) No primeiro experimento foi avaliada a cinética da maturação nuclear após o transporte e durante a MIV, quando também foi avaliada a expansão das células do cumulus. As avaliações da maturação citoplasmática após o transporte e ao final da MIV foram feitas pelos seguintes parâmetros: avaliação do posicionamento de mitocôndrias, do potencial de membrana mitocondrial, do posicionamento dos microfilamentos de actina, da taxa de apoptose e do conteúdo intracelular de espécies reativas do oxigênio. No experimento 2, foi feita a avaliação da taxa de clivagem (72 hpi) e do desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos (168 hpi), sendo que a qualidade dos embriões foi avaliada pela contagem do número total de... / The aim of this trial was to evaluate the effects of meiotic inhibiton with biological and pharmacological inhibitors during transportation of bovine oocytes for 6 hours in: 1) nuclear maturation progress; 2) cytoplasmic maturation and 3) embryo development and quality. Thus, the transportation media were supplemented with butyrolactone-I, milrinone, IBMX and forskolin or follicular fluid. Oocytes were transported during 6 hours and then submitted to in vitro maturation (IVM) until completing 24 hours, then they were fertilized and the presumptive zygotes cultured during 7 days. There were made two control groups in the first experiment: 24h IVM in 5% CO2 in air (C1); 6h IVM in transport and 18h more in 5% CO2 in air (C2). In the second experiment there were made three control groups: IVM with 10% FCS (Contr FCS); IVM with 0,6% BSA (Contr BSA); 6h IVM in transport and 18h more in 5% CO2 in air (Contr Transp). Experiment 1 evaluated nuclear maturation kinetics and cumulus cell expansion. Cytoplasmic maturation was also evaluated after transport and after IVM through the evaluation of mitochondria position and membrane potential, actin microfilaments distribution. Apoptotic rates and intracellular measurement of reactive oxygen species were evaluated as well. Experiment 2 evaluated cleavage (72 hpi) and blastocyst (168 hpi) rates and embryo quality by total cell number, apoptosis and caspases activity. In experiment 1 no differences (P>0.05) were observed between treatments in metaphase II rates after 24h IVM (61.2%-74.7%). Cumulus cells expansion was higher (P<0.05) in FF group after 6h and there were no differences (P>0.05) between treatments after IVM (4.8- 5.0). Actin microfilaments distribution was higher (P<0.05) in MR group for diffuse category (37.4%) after 6h IVM when compared to immature (6.4%) and FF groups (8.1%), but it was predominantly in normal category and did not differ (P>0,05) between groups after IVM ...

Orientador: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Joaquim Mansano Garcia / Banca: Cláudia Lima Verde Leal / Resumo: O objetivo desse estudo foi avaliar os efeitos da inibição da meiose com inibidores farmacológicos ou biológicos durante o transporte de oócitos bovinos por 6 horas sobre: 1) progressão da maturação nuclear; 2) maturação citoplasmática e 3) competência no desenvolvimento e qualidade dos embriões produzidos. Para tanto, o meio de transporte de oócitos foi suplementado com butirolactona-I (BL), milrinona (MR), IBMX e forskolina (CL) ou fluido folicular puro (FF) e o meio de maturação somente do grupo transportado com IBMX e forskolina foi suplementado com cilostamida. Os oócitos foram incubados em incubadora portátil (Minitub®) para simulação de transporte, durante 6h. Posteriormente, foram submetidos à maturação in vitro (MIV) até completar 24h e, em seguida, foram fecundados e os prováveis zigotos foram cultivados in vitro durante 7 dias. Foram feitos dois grupos controle no experimento I: MIV em 5% de CO2 em ar por 24h (C1); MIV por 6h na transportadora e mais 18h em 5% de CO2 em ar (C2). No experimento II foram feitos três grupos controle: MIV com 10% de SFB (Contr SFB); MIV com 0,6% de BSA (Contr BSA); MIV por 6h na transportadora e mais 18h em 5% de CO2 em ar (Contr Transp) No primeiro experimento foi avaliada a cinética da maturação nuclear após o transporte e durante a MIV, quando também foi avaliada a expansão das células do cumulus. As avaliações da maturação citoplasmática após o transporte e ao final da MIV foram feitas pelos seguintes parâmetros: avaliação do posicionamento de mitocôndrias, do potencial de membrana mitocondrial, do posicionamento dos microfilamentos de actina, da taxa de apoptose e do conteúdo intracelular de espécies reativas do oxigênio. No experimento 2, foi feita a avaliação da taxa de clivagem (72 hpi) e do desenvolvimento embrionário até a fase de blastocistos (168 hpi), sendo que a qualidade dos embriões foi avaliada pela contagem do número total de... / Abstract: The aim of this trial was to evaluate the effects of meiotic inhibiton with biological and pharmacological inhibitors during transportation of bovine oocytes for 6 hours in: 1) nuclear maturation progress; 2) cytoplasmic maturation and 3) embryo development and quality. Thus, the transportation media were supplemented with butyrolactone-I, milrinone, IBMX and forskolin or follicular fluid. Oocytes were transported during 6 hours and then submitted to in vitro maturation (IVM) until completing 24 hours, then they were fertilized and the presumptive zygotes cultured during 7 days. There were made two control groups in the first experiment: 24h IVM in 5% CO2 in air (C1); 6h IVM in transport and 18h more in 5% CO2 in air (C2). In the second experiment there were made three control groups: IVM with 10% FCS (Contr FCS); IVM with 0,6% BSA (Contr BSA); 6h IVM in transport and 18h more in 5% CO2 in air (Contr Transp). Experiment 1 evaluated nuclear maturation kinetics and cumulus cell expansion. Cytoplasmic maturation was also evaluated after transport and after IVM through the evaluation of mitochondria position and membrane potential, actin microfilaments distribution. Apoptotic rates and intracellular measurement of reactive oxygen species were evaluated as well. Experiment 2 evaluated cleavage (72 hpi) and blastocyst (168 hpi) rates and embryo quality by total cell number, apoptosis and caspases activity. In experiment 1 no differences (P>0.05) were observed between treatments in metaphase II rates after 24h IVM (61.2%-74.7%). Cumulus cells expansion was higher (P<0.05) in FF group after 6h and there were no differences (P>0.05) between treatments after IVM (4.8- 5.0). Actin microfilaments distribution was higher (P<0.05) in MR group for diffuse category (37.4%) after 6h IVM when compared to immature (6.4%) and FF groups (8.1%), but it was predominantly in normal category and did not differ (P>0,05) between groups after IVM ... / Mestre

Orientador: Eunice Oba / Coorientador: Alicio Martins Júnior / Banca: Sony Dimas Bicudo / Banca: Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga / Banca: Eduardo Paulino da Costa / Banca: Álan Maia Borges / Resumo: O objetivo deste estudo foi quantificar a abundância de genes associados com a competência de desenvolvimento em oócitos (GDF-9, BMP15 e OOSP1) e nas células do cumulus (GREM1, PTGS2, PFKP, AREG, EREG, HAS2, VCAN, PTX3, ADAM10 e ADAM17), a partir de oócitos imaturos (VG), maturados in vivo (MIVO) e cultivados em meio de MIV com diferentes macromoléculas (SFB, BSA ou PVA), diferentes concentrações de EGF ou pré-cultivados com butirolactona I (BLI) antes da MIV. O delineamento experimental consistiu de três experimentos de MIV de oócitos bovinos, a saber: experimento 1, complexos cumulus-oócito maturados em meio de cultivo contendo 10% de SFB ou 1 mg/mL de PVA ou 4 mg/mL de BSA; experimento 2, complexos cumulus-oócito maturados em meio de cultivo contendo EGF (nas concentrações de 0, 10 e 100 ng/mL); e experimento 3, complexos cumulus-oócito maturados in vitro na ausência (BL0) ou presença de pré-maturação com 10 μM de BLI ( BL12, 12 horas de pré-maturação e 12 horas de MIV; BL24, 24 horas de prématuração e 24 horas de MIV). A quantidade relativa de transcritos para o gene GREM1, PTGS2, PFKP e AREG foi maior do que (P<0,05) nas células do cumulus de oócitos MIVO, nos experimentos 1 e 2 e para o gene GREM1 no experimento 3. No experimento 1, o grupo SFB exibiu maior (P<0,05) abundância de transcritos de GREM1 e AREG entre os grupos MIV. No experimento 2, a adição de 10 ng/mL ao meio de MIV propiciou uma regulação positiva de EREG. No experimento 3, BL12 apresentou maior (P<0,05) abundância de AREG e o BL24 de EREG e PTX3. Entre os grupos de MIV, o gene GREM1 foi expresso em maior quantidade (P<0,05) no BL12. Não houve diferença estatística nos experimentos 1, 2 e 3 entre os grupos de oócitos MIV, MIVO e VG para os genes GDF9, BMP15 e OOSP1. Conclui-se que, a utilização de diferentes macromoléculas, diferentes concentrações de EGF e a realização de précultivo com BLI altera a transcrição nas células ... / Abstract: The aim of this study was to quantify the abundance of genes associated with the development of oocyte competence in oocytes (GDF-9, BMP15 and OOSP1) and in cumulus cells (GREM1, PTGS2, PFKP, AREG, EREG, HAS2, VCAN, PTX3, ADAM10 and ADAM-17) of immature oocytes (GV), in vivo matured (IVMO) and cultured in IVM medium with different macromolecules (FCS, BSA or PVA), different EGF concentrations or pre-cultured with butyrolactone I (BLI) before IVM. The experimental design consisted of three IVM experiments of bovine oocytes, namely: experiment 1, cumulus-oocyte complex matured in culture medium containing 10% FCS or 1 mg/mL PVA or 4 mg/mL BSA; Experiment 2, cumulus-oocyte complex matured in culture medium containing EGF (at concentrations of 0, 10 and 100 ng/mL); and Experiment 3, cumulus-oocyte complex in vitro matured in the absence (BL0) or presence of pre-maturation with 10 μM de BLI (BL12, 12 hours of pre-maturation and 12 hours of IVM, BL24, 24 hours of pre-maturation and 24 hours of IVM). The relative amount of transcripts for GREM1, PTGS2, PFKP and AREG gene was larger than (P <0.05) in cumulus cells of IVMO oocytes in experiments 1 and 2 and for GREM1 gene in experiment 3. In experiment 1, the FCS group exhibited higher (P <0.05) abundance of transcripts of GREM1 and AREG among MIV groups. In experiment 2, the addition of 10 ng/ml to the IVM medium provided an upregulation of EREG. In experiment 3, BL12 showed higher (P <0.05) abundance of AREG and BL24 of EREG and PTX3. Among IVM groups, the GREM1 gene was expressed in larger quantities (P <0.05) in BL12. There was no statistical difference in experiments 1, 2 and 3 among groups of oocytes IVM, IVMO and GV for GDF9, BMP15 and OOSP1 genes. It was concluded that the use of different macromolecules, different EGF concentrations and the performance of pre-culture with BLI change the transcription in the cumulus cell of genes associated with oocyte competence / Doutor

Orientador: José Buratini Junior / Banca: Gisele Zoccal Mingoti / Banca: Juliano da Silveira / Banca: Marcelo Marcondes Seneda / Banca: Marcelo Fábio Gouveia Nogueira / Resumo: O oócito é responsável por regular os mecanismos da maturação do complexo cumulus oócito (COC) principalmente via secreção de fatores. parácrinos.Dentre os fatores secretados pelo oócito (OSF) desta-se o fator de crescimento dos fibroblastos 10 (FGF10), e dois fatores TGFβ mais estudados a proteína morfogenética óssea 15 (BMP15) e fator de crescimento de diferenciação 9 (GDF9) e estão associados com o desenvolvimento da competência oocitária. O presente trabalho investigou a regulação do oócito sobre as células do cumulus em dois cenários atuais da maturação in vitro, na presença de hormônio folículo estimulante (FSH) ou ampirregulina (AREG). A ausência do oócito afeta a expansão das células do cumulus e também o consumo de glicose e a produção de lactato e a adição de oócitos desnudos reverte o efeito da oocectomia na expansão mas não no consumo de glicose nem na produção de lactato. A oocectomia afeta também a expressão gênica reduzindo a abundância de RNAm de hialurona sintetase 2 HAS2 e elevando a expressão de prostaglandina sintase 2 (PTGS2), pentraxina 3 (PTX3) e proteína indutora do fator de necrose tumoral 6 (TNFAIP6) na presença de FSH e AREG. A adição de oócitos desnudos reverte o efeito da oocectomia sobre a expressão de RNAm de AREG às 4 horas de cultivo, HAS2 e PTGS2 às 22 horas de cultivo apenas quando os complexos foram cultivados na presença de AREG. Adicionalmente foi investigado a ação isolada do FGF10 sobre a diferenciação das células do cumulus. O FGF10 re... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: The oocyte is responsible for regulating mechanisms of cumulus oocyte complex (COC) maturation mainly through secretion of paracrine factors. Including oocyte secreted factors (OSF) are the fibroblast growth factor 10 (FGF10), and two TGF beta factors most studied, bone morphogenetic protein 15 (BMP15) differentiation and growth factor 9 (GDF9), and they are associated with the oocyte development of competence. This study investigated the regulation of oocyte cumulus cells on two current scenarios in vitro maturation in the presence of follicle stimulating hormone (FSH) or ampirregulina (AREG). The absence of oocyte affects the expansion of the cumulus cells and also the glucose consumption and lactate production and addition of denuded oocytes reverses the effect of the expansion oocectomia but not glucose consumption or lactate production. The oocectomia also affects gene expression by reducing the abundance of mRNA hialurona synthetase 2 HAS2 and raising synthase prostaglandin expression 2 (PTGS2), pentraxin 3 (PTX3) and inducing protein of the tumor necrosis factor 6 (TNFAIP6) in the presence of FSH and AREG. The addition of denuded oocytes reverses the effect of AREG on oocectomia mRNA expression at 4 hours of culture, HAS2 and PTGS2 to 22 hours of cultivation only when complexes were grown in the presence of AREG. Additionally it investigated the isolated FGF10 action on the differentiation of cumulus cells. FGF10 reverses the effect of on the expansion of the cells and the expression of HAS2 and GFPT1apenas to 22 hours in cumulus but not glucose consumption or lactate production, which shows a delayed effect of FGF10 necessitating the presence of other OSF to soon effect as seen previously in the literature. Complementary to the results, it appears that the cumulus cells have an intracumulus control Smad2-activation by the presence of GDF9 and BMP15 in cumulus cells. In summary the oocyte... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor