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Efeito do condicionamento com nicotina e cotinina na morfologia, densidade e viabilidade de fibroblastos. Estudo "in vitro" /

Traverso Martínez, Aurora Esmeralda. January 2002 (has links)
Orientador: Carlos Rossa Júnior / Banca: Denise Madalena Palomari Spolidorio / Banca: Cassiano Kuchenbecker Rosing / Resumo: O objetivo do estudo foi avaliar "in vivo" o efeito do condicionamento com nicotina ou cotinina sobre a morfologia, densidade e viabilidade de fibroblastos. Na avaliação da morfologia e densidade, também foi determinado se a raspagem mecânica das superfícies condicionadas modifica estes resultados. Foram formados dois grupos experimentais : Apenas condicionamento e Raspagem após condicionamento. No grupo Apenas condicionamento, as amostras foram incluídas em placas para cultivo celular e subdivididas em 3 subgrupos segundo a substância testada: Nicotina, Cotinina e Controle negativo. No primeiro subgrupo cada orifício recebeu 2ml de solução de Nicotina (concentrações de 100ng, 1ug, 100 ug, 1mg/ml). No segundo subgrupo cada orifício recebeu 2 ml de solução de Cotinina (concentrações de 50ng, 100ng, 500ng, 1ug/ml). O terceiro subgrupo foi o controle. Após 24 horas de condicionamento as amostras foram lavadas com tampão fosfato e adicionado a 1ml de meio de cultura + 1 ml de meio de cultura contendo 1x10 células/ml. Para o grupo Raspagem após condicionamento, foram empregadas as mesmas concentrações de nicotina e cotinina descritas. O condicionamento foi realizado da mesma forma seguido de raspagem manual. As amostras obtidas foram fixadas, desidratadas, metalizadas e levadas ao microscópio eletrônico de varredura para exame e fotografias. Para a avaliação da viabilidade foram formados dois grupos experimentais, segundo a dose de nicotina: 0-controle, 10ug, 100ug, 0.5mg, 1mg; e segundo o tempo de condicionamento : 1 e 24 hora. Para a cotinina os valores de concentração e tempo de condicionamento foram: 0-controle, 50ng, 100ng, 500ng, 1ug/ml; e 1, 24 e 48 horas respectivamente. Cada um dos orifícios de uma placa para cultura celular recebeu 1 mL de meio de Eagle, 1 ml de Eagle contendo a nicotina ou cotinina nas diferentes... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo). / Abstract: The aim of this study was to evaluate "in vitro" the effect of nicotine or cotinine, on the morphology, density and viability of fibroblasts. In was also assessed if performing root planing on conditioned root surface would alter the results. Exposure to nicotine or cotinine and Root planning after the exposure to nicotine or cotinine. In the first group, the specimens were set in plates for cellular cultures and divided in three subgroups according to the substance tested: nicotine, cotinine, and control (negative). In the firs subgroup each well received 2ml of nicotine solution (100mg, 1ug, 100ug, 1mg/ml). In the second subgroup each well received 2ml of solution of cotinine (50ng, 100ng, 500ng, 1ug/ml). The third group was control. After 24 hours, the specimens were washed with phosphate buffer and 1ml of a cell suspension containing 1x15 cells/ml was added to each well. For the group of root planning after the exposure there were used the same concentrations of nicotine and cotinine of the first group. The exposure was made with the same procedure of root planning. The specimens obtained were fixed, dehidratated, sputter coated with gold, photographed and observed to the eletronic microscope. For the viability, two experimental groups were formed according to drug dosage: 0- control, 10 ug, 100 ug, 0.5 mg, 1 mg and to drug exposure time 1 and 24 hours for the nicotine group. For the cotinine group, concentration values were: 0- control, 50 ng, 100 ng, 500 ng, and 1 ug/ml, the exposure times were 1, 24 and 48 hours. Twelve well microplates were used. Each well received 1 ml of culture medium containing nicotine or cotinine in different concentrations. One milliliter of culture medium containing 1 x 10 cells/ml was also added to each well. After the drug exposure period, the cells were colored with trypan blue 0.4%. Stained non... (Complete abstract, click electronic address below). / Mestre
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Análise "in vitro" da toxicidade de substâncias utilizadas em pulpotomias de dentes decíduos. Estudo em linhagem de fibroblastos Balb-c 3T3 / Toxicity of primary teeth pulpotomy agents. In vitro study on immortalized fibroblast cell line Balb-c 3T3.

José Vitor Nogara Borges de Menezes 07 July 2004 (has links)
O principal objetivo deste trabalho foi estabelecer, através da definição da dose TD50 (concentração que causa a morte de 50% das células) uma escala de toxicidade dentre diversas substâncias comumente utilizadas em pulpotomias de dentes decíduos. Foram utilizadas como substâncias-teste o formocresol concentrado (FC), formocresol diluído a 1:5 (FCD), solução de sulfato férrico a 15,5% (SF), hidróxido de cálcio P.A. (HC) e o agregado trióxido mineral (MTA). Fibroblastos Balb-c 3T3 foram semeados em placas de cultura de 24 poços na concentração de 3x104 células por poço. Diluições variadas dos extratos das substâncias-teste, obtidos de acordo com normas da ISO 10993-12, foram colocadas em contato com as células por 24 horas para a determinação da TD50, dose tóxica para 50% das células quando comparadas com grupo controle negativo (células não expostas aos extratos). Os ensaios colorimétricos de redução do MTT e captação do corante Vermelho Neutro foram realizados na TD50 das substâncias-teste. O tratamento estatístico dos resultados foi feito através dos testes de Análise de Variância (ANOVA), Dunnet e Bartlett, com p<0,05. Baseado na definição da TD50, pode ser estabelecida uma escala de citotoxicidade em ordem decrescente, a saber: FC>FCD>SF>HC>MTA. Os ensaios para a determinação da capacidade de redução do MTT e incorporação de VN demonstraram que a citotoxicidade dos materiais afeta, primordialmente, a função mitocondrial em detrimento do efeito mais discreto na integridade da membrana. Concluímos que a determinação da dose TD50 utilizando a metodologia proposta pela ISO 10993-12 permite o estabelecimento de uma escala de potência adequada para a ordenação de compostos terapêuticos em função de sua toxicidade. Esta padronização poderá facilitar a comparação entre diversos materiais auxiliando na investigação de novas drogas. Ainda, é possível concluir que os materiais testados e utilizados para a pulpotomia de dentes decíduos têm sua toxicidade mediada principalmente por alterações da função mitocondrial das células. / The main purpose of this study was to define a rank of In vitro toxicity of primary teeth pulpotomy agents, based on MTT and Neutral Red colorimetric essays, and on the definition of the TD50 for each substance tested. Buckley’s formocresol (FC), 20% diluted formocresol (FCD), calcium hydroxide P.A. (HC), 15,5% ferric sulfate solution (SF) and mineral trioxide aggregate (MTA) were tested on Balb-c 3T3 mouse fibroblasts. The cells were seeded in 24-well culture plates at a density of 3.104 cells/well and incubated for 24 h. to allow attachment. Extracts from the substances were obtained according to ISO 10993-12 standards. After incubation at a 37oC temperature in air atmosphere of 5% of CO2, medium was aspirated and replaced with 1,0 mL of the extracts. The plates were incubated for 24 h. and the cytotoxicity was assessed in a spectrophotometer. The absorbance was read at 560 nm. There were two independent experiments in triplicates. Mean test absorptions were calculated and expressed as a percentage of the control cells together with standard deviations. The statistical approach was carried out with the ANOVA, Bartlett and Dunnet tests (p<0,05). Based on the TD50 results, the cytotoxicity can be ranked as: FC>FCD>SF>HC>MTA. Neutral Red test results showed that cells exposed to MTA, HC and SF did not affect the cells, when compared with control group, while FC and FCD reduced cell viability in approximately 65 %, when compared with control (p<0,05). The MTT assay demonstrated that the cytotoxicity of the materials can be ranked as: FC>FCD>SF>HC>MTA, with all the substances statistically significant different compared with control cells (p<0,01).
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Análise "in vitro" da toxicidade de substâncias utilizadas em pulpotomias de dentes decíduos. Estudo em linhagem de fibroblastos Balb-c 3T3 / Toxicity of primary teeth pulpotomy agents. In vitro study on immortalized fibroblast cell line Balb-c 3T3.

Menezes, José Vitor Nogara Borges de 07 July 2004 (has links)
O principal objetivo deste trabalho foi estabelecer, através da definição da dose TD50 (concentração que causa a morte de 50% das células) uma escala de toxicidade dentre diversas substâncias comumente utilizadas em pulpotomias de dentes decíduos. Foram utilizadas como substâncias-teste o formocresol concentrado (FC), formocresol diluído a 1:5 (FCD), solução de sulfato férrico a 15,5% (SF), hidróxido de cálcio P.A. (HC) e o agregado trióxido mineral (MTA). Fibroblastos Balb-c 3T3 foram semeados em placas de cultura de 24 poços na concentração de 3x104 células por poço. Diluições variadas dos extratos das substâncias-teste, obtidos de acordo com normas da ISO 10993-12, foram colocadas em contato com as células por 24 horas para a determinação da TD50, dose tóxica para 50% das células quando comparadas com grupo controle negativo (células não expostas aos extratos). Os ensaios colorimétricos de redução do MTT e captação do corante Vermelho Neutro foram realizados na TD50 das substâncias-teste. O tratamento estatístico dos resultados foi feito através dos testes de Análise de Variância (ANOVA), Dunnet e Bartlett, com p<0,05. Baseado na definição da TD50, pode ser estabelecida uma escala de citotoxicidade em ordem decrescente, a saber: FC>FCD>SF>HC>MTA. Os ensaios para a determinação da capacidade de redução do MTT e incorporação de VN demonstraram que a citotoxicidade dos materiais afeta, primordialmente, a função mitocondrial em detrimento do efeito mais discreto na integridade da membrana. Concluímos que a determinação da dose TD50 utilizando a metodologia proposta pela ISO 10993-12 permite o estabelecimento de uma escala de potência adequada para a ordenação de compostos terapêuticos em função de sua toxicidade. Esta padronização poderá facilitar a comparação entre diversos materiais auxiliando na investigação de novas drogas. Ainda, é possível concluir que os materiais testados e utilizados para a pulpotomia de dentes decíduos têm sua toxicidade mediada principalmente por alterações da função mitocondrial das células. / The main purpose of this study was to define a rank of In vitro toxicity of primary teeth pulpotomy agents, based on MTT and Neutral Red colorimetric essays, and on the definition of the TD50 for each substance tested. Buckley’s formocresol (FC), 20% diluted formocresol (FCD), calcium hydroxide P.A. (HC), 15,5% ferric sulfate solution (SF) and mineral trioxide aggregate (MTA) were tested on Balb-c 3T3 mouse fibroblasts. The cells were seeded in 24-well culture plates at a density of 3.104 cells/well and incubated for 24 h. to allow attachment. Extracts from the substances were obtained according to ISO 10993-12 standards. After incubation at a 37oC temperature in air atmosphere of 5% of CO2, medium was aspirated and replaced with 1,0 mL of the extracts. The plates were incubated for 24 h. and the cytotoxicity was assessed in a spectrophotometer. The absorbance was read at 560 nm. There were two independent experiments in triplicates. Mean test absorptions were calculated and expressed as a percentage of the control cells together with standard deviations. The statistical approach was carried out with the ANOVA, Bartlett and Dunnet tests (p<0,05). Based on the TD50 results, the cytotoxicity can be ranked as: FC>FCD>SF>HC>MTA. Neutral Red test results showed that cells exposed to MTA, HC and SF did not affect the cells, when compared with control group, while FC and FCD reduced cell viability in approximately 65 %, when compared with control (p<0,05). The MTT assay demonstrated that the cytotoxicity of the materials can be ranked as: FC>FCD>SF>HC>MTA, with all the substances statistically significant different compared with control cells (p<0,01).
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Efeito citotóxico de microcristais de tungstato de prata e de molibdato de prata em fibroblastos gengivais humanos cultivados em monocamada e em equivalente dermal /

Haro Chávez, Natali Lisette January 2017 (has links)
Orientador: Carlos Eduardo Vergani / Resumo: A associação da prata a outros compostos vem sendo estudada em uma tentativa de acentuar as propriedades antimicrobianas e reduzir a citotoxicidade deste metal quando em altas concentrações. O presente estudo investigou o efeito dos microcristais: tungstato de prata (α-Ag2WO4) e molibdato de prata (β-Ag2MoO4), no comportamento das células gengivais em monocamada e em modelo de matriz de colágeno, simulando a reparação tecidual. Para isto, fibroblastos gengivais (FGH) foram cultivados e utilizados somente entre as passagens 3 e 8 para formação de monocamada e para a confecção do equivalente dermal em matriz de colágeno em três dimensões (3D). Ambos microcristais foram utilizados na concentração fungicida mínima (CFM) capaz de matar o fungo Candida albicans (C. albicans) e foram definidas como C2: 7,81 µg/mL para tungstato de prata e 15,62 µg/mL para molibdato de prata. A partir destes valores, concentrações 10 vezes concentradas (C3) e 10 vezes diluídas (C1) foram preparadas para melhor compreender a margem de efeito dos componentes sobre as células estudadas. Células incubadas com meio de cultura na ausência de microcristais foram utilizadas como controle negativo (C-) e células incubadas com tampão de lise (TL) como controle positivo, representando 100% de morte celular. O efeito dos microcristais na morfologia, viabilidade e proliferação das células foram inicialmente avaliados e direcionaram os experimentos sequenciais. A geração de espécies reativas de o... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: Growing interest has been reported in combining silver with other metals to improve the antimicrobial properties, reduce silver concentration and consequently its toxicity. Herein, this study investigated the effect of microcrystals silver tungstate (α- Ag2WO4) and silver molybdate (β-Ag2MoO4) on the gingival cells and threedimensional (3D) collagen matrices behavior. For all experiments, human gingival fibroblasts cells (HGF) were used between the 3rd and 8th passage. To carry out the experiments, lowest concentrations of α-Ag2WO4 and β-Ag2MoO4 that prevents visible growth of Candida albicans (C. albicans) planktonic cells were defined as our test concentration (C2): 7,81 µg/mL for silver tungstate and 15,62 µg/mL for silver molybdate. Solutions prepared from initial MFC concentration, ten-folds diluted (C1) and ten-folds concentrated (C3), improved the knowledge about the concentration ranging effect against human cells. Complete medium (C-) was used as a negative control and lysis buffer (LB) served as positive control (C+), equating to 100% cell death. The effect of the microcrystals concentration on cell morphology, viability and proliferation of HGF cells led following experiments. Reactive oxygen species (ROS) generation and DNA integrity analyzes were mandatories to know the real impact of the microcrystals on human cells. The quantitative and qualitative results showed that α-Ag2WO4 did not affect mitochondrial enzymatic activity of HGF cells cultured in monolayer an... (Complete abstract click electronic access below) / Mestre
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Estudio comparativo de la expresión y actividad del inflamasoma NLRP3 en fibroblastos y miofibroblastos cardíacos

Tapia Cáceres, Felipe Eduardo January 2015 (has links)
Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El inflamasoma NLRP3 es un complejo multiproteico que tiene como objetivo producir la fragmentación de la citoquina pro-inflamatoria, proIL-1, a su forma activa IL-1, facilitar su secreción al espacio extracelular y, de esta forma, regular y activar el sistema inmune innato. Este complejo está conformado por el receptor NLRP3, la proteína adaptadora ASC y la enzima llamada procaspasa-1. El inflamasoma puede ser encontrado en diversos tipos celulares, incluyendo los fibroblastos cardíacos (FC). Estas células, participan activamente en la homeostasis de la matriz extracelular (MEC) y responden a frente a estímulos patofisiológicos. Entre ellos, a TGF-1, el cual promueve la diferenciación de los FC a su forma más activa, los miofibroblastos cardiacos (MFC). Con la finalidad de conocer las principales diferencias del inflamasoma NLRP3 entre FC y MFC, empleamos diversas metodologías experimentales de carácter analítica. Los resultados obtenidos no mostraron diferencias en los niveles proteicos de ASC, NLRP3 y en la secreción de IL-1, tanto en FC como en MFC. Sin embargo, tanto los niveles proteicos de procaspasa-1, así como también la actividad de caspasa-1, fueron mayores en MFC respecto de FC. Por otra parte, se observaron mayores niveles proteicos de proIL-1 en FC, en comparación con los MFC. Finalmente, en base a los resultados obtenidos, se puede concluir que los MFC, presentan mayores niveles de expresión y actividad del inflamasoma NLRP3 que los FC / The NLRP3 inflammasome is a multiprotein complex that aims to produce fragmentation of the pro-inflammatory, pro-IL-1, cytokine to its active IL-1, facilitating its secretion to the extracellular space and, thus, regulating and activating the innate immune system. The complex consists of: NLRP3 receptor, ASC adapter protein and an enzyme called pro-caspase-1. The inflammasome can be found in various cell types, including cardiac fibroblast (FC). These cells are actively involved in the homeostasis of extracellular matrix (ECM) and responds against pathophysiological stimuli, including TGF-1, which promotes the differentiation of FC to its active form, cardiac myofibroblast (MFC). In order to know the NLRP3 inflammasome main differences between FC and MFC, we use various experimental methods of analytical character. The results showed no difference in protein levels of ASC, NLRP3 and secretion of IL - 1, either FC or MFC. However both, protein levels of pro-caspase-1 as well as the activity of caspase-1, were higher in MFC regarding FC. Moreover, higher protein levels of pro- IL- 1 in FC were observed compared to the MFC. Finally, based on the results obtained, it can be concluded that the MFC, have higher levels of expression and activity of the inflammasome NLRP3 than FC
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Expresión y función de los receptores de cininas en fibroblastos y miofibroblastos cardíacos

Boza Fuentes, Pía de los Angeles January 2012 (has links)
Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos son las principales células impulsoras del proceso fibrótico en el corazón. Estas células son activadas tanto por estrés mecánico, como también por citoquinas, entre ellas TGF-β1, que actúa promoviendo la diferenciación celular a miofibroblastos y la síntesis de diferentes proteínas y sustancias que originan el proceso fibrótico. Antecedentes de nuestro laboratorio han revelado que el receptor B1 de cininas se encuentra levemente expresado en fibroblastos y su expresión se induce en los miofibroblastos cardiacos. Este receptor es parte del sistema cinina-calicreína, que de modo general, actúa de manera opuesta al sistema renina-angiotensina, y que contrarresta el efecto pro-fibrótico de angiotensina II, tanto en los fibroblastos como en los miofibroblastos cardiacos. Utilizando técnicas de western blot determinamos que TGF-β1 induce la expresión de B1R a las 48 horas y que este fenómeno estaría mediado por la vía de las MAPK y también por ALK5. Utilizando técnicas de adhesión sobre placa demostramos que tanto BK o DAKD no aumentan la adhesión de fibroblastos o miofibroblastos cardiacos. Por otro lado, utilizando el método de migración en placa (método de la herida), BK aumenta el comportamiento de migración en los fibroblastos, no así de los miofibroblastos. Finalmente, a partir de este trabajo concluimos que TGF-β1, a través de las vías transduccionales MAPK y ALK5; y no por la vía PI3-Akt ni a través de Smad 3; induce la expresión de B1R. Por otro lado, las cininas no median el comportamiento de adhesión celular de fibroblastos ni de miofibroblastos cardiacos. Sin embargo, BK induce la migración celular solo en fibroblastos cardiacos, mientras que DAKD, no media migración en fibroblastos ni miofibroblastos cardiacos. Estos resultados en conjunto, fortalecen el concepto de que las cininas son importantes mediadores del remodelado cardiaco. / Fibroblasts are the main drivers of cells in the heart fibrotic process. These cells are activated either by mechanical stress as well as by cytokines, including TGF-β1, which acts by promoting cell differentiation to myofibroblasts and the synthesis of different proteins and substances that originate the fibrotic process. History of our laboratory has shown that the kinin B1 receptor is slightly expressed in fibroblasts and its expression is induced in cardiac myofibroblasts. This receptor is part of the kininkallikrein system, which in general, acts opposite to the renin-angiotensin system, and counteracts the pro-fibrotic effect of angiotensin II in fibroblasts and cardiac myofibroblasts. Using western blot techniques, we determined that TGF-β1 induces the expression of B1R at 48 hours and that this phenomenon would be mediated by the MAPK pathway and by ALK5. Using plate adhesion techniques demonstrated that either BK or DAKD not increase the adhesion of cardiac fibroblasts or myofibroblasts. Furthermore, using the migration plate method (wound healing), BK increases the migration behavior in fibroblasts, but not of myofibroblasts. Finally, from this work, we conclude that TGF-β1, through MAPK signal transduction pathways and ALK5, and not through PI3-Akt or Smad 3, induces the expression of B1R. Furthermore, kinins do not mediate cell adhesion behavior of cardiac fibroblasts or myofibroblasts. However, BK induces cell migration only in cardiac fibroblasts, while DAKD doesn’t mediate migration in fibroblasts and myofibroblasts heart. These results, taken together reinforce the concept that kinins are important mediators of cardiac remodeling.
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Dimetilaminoetanol(DMAE) na viabilidade de fibroblastos humanos cultivados / Dimethylaminoethanol(DMAE) in the viability of cultivated human fibroblasts

Giannoccaro, Fabiana Bocci [UNIFESP] January 2006 (has links) (PDF)
Made available in DSpace on 2015-12-06T23:08:03Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2006 / Introdução: O dimetilaminoetanol (DMAE) tem sido utilizado na prática clínica no combate a rugas e flacidez cervico-facial. Sua ação firmadora é explicada devido a sua molécula ser um precursor de acetilcolina, de forma que o DMAE alteraria a contração muscular. Entretanto não existem trabalhos experimentais que comprovem esta teoria. Pela falta de definição do real mecanismo de ação do DMAE, e não existindo referência na Literatura da sua ação sobre os fibroblastos, foi elaborado estudo para avaliar a ação direta sobre os fibroblastos humanos cultivados. Métodos: Fibroblastos humanos provenientes de fragmento de pele total desprezado de pacientes submetidos a procedimentos cirúrgicos estéticos ou reparadores realizados na Disciplina de Cirurgia Plástica da UNIFESP/EPM. Foi utilizada a técnica de explante, e na quarta passagem celular o meio de cultura foi suplementado com diferentes concentrações de DMAE e as células foram avaliadas quanto à proliferação, medidas do cálcio citosólico e ciclo celular. A análise estatística dos resultados foi realizada usando-se o teste de ANOVA seguido pelo teste de Newman-Keuls para múltiplas comparações. Resultados: A proliferação dos fibroblastos mostrou-se diminuída com o aumento das concentrações de DMAE. O tempo de tratamento com tripsina foi maior nos grupos tratados com DMAE de forma dose dependente. Houve aumento de cálcio citosólico na presença de DMAE de forma dose-dependente. Houve um aumento de apoptose nos grupos tratados com DMAE. Conclusão: O DMAE diminuiu a proliferação dos fibroblastos, e causou aumento do cálcio citosólico e alterou o ciclo celular causando um aumento da apoptose nos fibroblastos humanos cultivados. / Background: Dimethylaminoethanol (DMAE) has been used in medical practice to treat facial wrinkles and cervical flabbiness. Its tensor action is explained by its action as an acethylcoline precursor affecting muscular contraction. However, there are no experimental models proving this theory. Due to the lack of information about DMAE action mechanism and no data about DMAE action on fibroblasts in vitro this study was performed. Methods: Human fibroblasts from patients who undergone cosmetic or reparative surgery performed on Plastic Surgery Division from UNIFESP/EPM were cultured from discharged total skin fragment. Explant technique was used and fibroblasts from passage four were cultured with different concentrations of DMAE. The cells were evaluated in proliferation, cytosolic calcium, and cellular cycle. Statistical analysis was done using ANOVA and Newman-Keuls test for multiple comparisons. Results: Fibroblast proliferation diminished with increasing DMAE concentrations. The trypsin treatment in DMAE groups was longer than in control group in a dose dependent way. Increasing in cytosolic calcium was found in DMAE groups in a dose dependent manner. Apoptosis increased in DMAE treatment group. Conclusion: DMAE diminished fibroblast proliferation, increased cytosolic calcium leading to increasing apoptosis in cultured human fibroblasts. / BV UNIFESP: Teses e dissertações
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Avaliação da indução de autofagia e senescência em fibroblastos humanos deficientes no reparo por excisão de nucleotídeos tratados com doxorrubicina

Souza, Larissa Milano de January 2014 (has links)
Doxorrubicina (DOX) é um agente importante na terapia antitumoral. Seu mecanismo de ação inclui inibição de topoisomerase II, formação de radicais livres e adutos de DNA. O reparo por excisão de nucleotídeos (NER) atua removendo lesões que distorcem a dupla hélice do DNA, como as induzidas por UV e agentes químicos. Linhagens celulares deficientes em NER são mais sensíveis às antraciclinas. Porém, pouco se sabe sobre os processos celulares que permitem sobrevivência celular destas linhagens após o tratamento com esta classe de drogas. Neste trabalho verificou-se a resposta celular às lesões induzidas por DOX em linhagens celulares de fibroblastos humanos proficientes (MRC5) e deficientes em NER (CSB, XPA, XPC e XPD). Para esta finalidade foram realizados os ensaios de MTT, anexina-V, laranja de acridina e SA-b-galactosidase. Além disso, a dinâmica do ciclo celular e PDT (population doubling time) foram determinados após 72 horas de tratamento com DOX. Os resultados indicam que as linhagens deficientes em NER são mais sensíveis à DOX e morrem de maneira dose-dependente, principalmente por apoptose. Na análise do ciclo celular, a linhagem proficiente MRC5 e a linhagem deficiente em XPA apresentaram maior porcentagem de células na fase G2/M. No entanto, as linhagens CSB e XPD não apresentaram aumento relevante. Quando a linhagem XPD foi complementada com gene XPD funcional uma parada em G2 foi observada apenas em baixas doses de DOX. No ensaio PDT, houve um aumento do número de horas necessárias para a duplicação das células MRC5 e XPA tratadas com DOX, enquanto células CSB e XPD não mostraram uma mudança relevante no tempo necessário para a duplicação celular. Isto indica que estas células prosseguem através do ciclo celular, mesmo após o tratamento com DOX. No ensaio de SA-b-galactosidase, as linhagens MRC5, XPA e XPC entraram em senescência após tratamento com DOX, enquanto CSB e XPD não foram induzidas neste processo. Estes resultados foram confirmados por análise de Western Blot, onde as células CSB e XPD não apresentam diferença nos níveis de expressão de p21 e p16 (marcadores de senescência), em resposta ao tratamento com DOX. Em conjunto com a parada em G2/M e indução da senescência, as células MRC5 e XPA mostraram um aumento na coloração com laranja de acridina, indicando o processo de autofagia, enquanto que as células CSB e XPD não demonstraram este aumento. Um indício importante vem de estudos recentes que ligam a autofagia com o início da senescência. Assim, autofagia e senescência podem ser parte do mesmo processo fisiológico, conhecido como transição autofagia-senescência. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que a autofagia e senescência tendem a ocorrer em paralelo, e que autofagia pode ser necessária para o fenótipo senescente. Além disso, pode-se inferir uma participação ativa do NER no reparo de lesões induzidas pela DOX. Assim, NER eficiente após o tratamento com DOX parece ser essencial para a sobrevivência da célula. Por outro lado, o recrutamento de fatores da via de NER (CSB e XPD) parece ser necessário para a indução de respostas celulares específicas, tais como a transição autofagia-senescência. / Doxorubicin (DOX) is an important agent in cancer therapy and its mechanism of action includes topoisomerase II-poisoning, free radicals release and DNA adducts formation.The nucleotide excision repair (NER) participates in the removal of lesions that distort the double helix of DNA induced by UV and chemicals. Cell lines deficient in NER are more sensitive to anthracyclines, however little is known about the cellular processes that permit cell survival after treatment with these drugs. In this work we verified the cellular response to DOX induced lesions in human fibroblasts cell lines proficient (MRC5) and deficient in NER (CSB, XPA, XPC and XPD). For this purpose we performed MTT, Annexin-V, Acridine orange and SA-b-galactosidase assays. In addition, the cell cycle dynamics and PDT (population doubling time) was determined after 72h DOX treatment. The results indicate that cell lines deficient in NER are more sensitive to anthracyclines and die in a dose dependent manner mainly by apoptosis. In the cell cycle analysis, a proficient MRC5 and XPA deficient cell lines showed a higher percentage of cells in G2/M phase. In contrast, CSB and XPD cells showed no relevant increase. When XPD cells were complemented with functional XPD gene a G2 arrest was observed just at low doses of DOX. In PDT assay, there was an increased number of hours required for doubling in MRC5 and XPA cells treated with DOX, whereas CSB and XPD lines did not show a relevant change in time required for cell duplication. This indicates that these cells proceed through the cell cycle even after treatment with DOX. In SA-b- galactosidase assay, MRC5, XPA and XPC lines entered in senescence after DOX treatment, while CSB and XPD do not induced in this process. These results were confirmed by Western Blot analysis where CSB and XPD cells do not exhibit difference in p21 and p16 expression levels (senescence markers) in response to treatment DOX. Along with the G2/M arrest and senescence induction, MRC5 and XPA cells showed an increase in acridine orange staining, indicating autophagy process, whereas CSB and XPD cells do not demonstrate this increase. An important clue comes from recent studies linking autophagy with the onset of senescence. Thus, autophagy and senescence may be part of the same physiological process, known as the autophagy-senescence transition. Taken together, our findings suggest that autophagy and senescence tend to occur in parallel, and that autophagy may be required for the senescent phenotype. Furthermore, we can infer an active involvement of NER in the repair of DOX-induced lesions. Thus, efficient NER following treatment with DOX seems to be essential for cell survival. On the other hand, recruitment of NER pathway factors (CSB and XPD) seems to be necessary for induction of specific cellular responses such as autophagy-senescence transition.
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Avaliação da indução de autofagia e senescência em fibroblastos humanos deficientes no reparo por excisão de nucleotídeos tratados com doxorrubicina

Souza, Larissa Milano de January 2014 (has links)
Doxorrubicina (DOX) é um agente importante na terapia antitumoral. Seu mecanismo de ação inclui inibição de topoisomerase II, formação de radicais livres e adutos de DNA. O reparo por excisão de nucleotídeos (NER) atua removendo lesões que distorcem a dupla hélice do DNA, como as induzidas por UV e agentes químicos. Linhagens celulares deficientes em NER são mais sensíveis às antraciclinas. Porém, pouco se sabe sobre os processos celulares que permitem sobrevivência celular destas linhagens após o tratamento com esta classe de drogas. Neste trabalho verificou-se a resposta celular às lesões induzidas por DOX em linhagens celulares de fibroblastos humanos proficientes (MRC5) e deficientes em NER (CSB, XPA, XPC e XPD). Para esta finalidade foram realizados os ensaios de MTT, anexina-V, laranja de acridina e SA-b-galactosidase. Além disso, a dinâmica do ciclo celular e PDT (population doubling time) foram determinados após 72 horas de tratamento com DOX. Os resultados indicam que as linhagens deficientes em NER são mais sensíveis à DOX e morrem de maneira dose-dependente, principalmente por apoptose. Na análise do ciclo celular, a linhagem proficiente MRC5 e a linhagem deficiente em XPA apresentaram maior porcentagem de células na fase G2/M. No entanto, as linhagens CSB e XPD não apresentaram aumento relevante. Quando a linhagem XPD foi complementada com gene XPD funcional uma parada em G2 foi observada apenas em baixas doses de DOX. No ensaio PDT, houve um aumento do número de horas necessárias para a duplicação das células MRC5 e XPA tratadas com DOX, enquanto células CSB e XPD não mostraram uma mudança relevante no tempo necessário para a duplicação celular. Isto indica que estas células prosseguem através do ciclo celular, mesmo após o tratamento com DOX. No ensaio de SA-b-galactosidase, as linhagens MRC5, XPA e XPC entraram em senescência após tratamento com DOX, enquanto CSB e XPD não foram induzidas neste processo. Estes resultados foram confirmados por análise de Western Blot, onde as células CSB e XPD não apresentam diferença nos níveis de expressão de p21 e p16 (marcadores de senescência), em resposta ao tratamento com DOX. Em conjunto com a parada em G2/M e indução da senescência, as células MRC5 e XPA mostraram um aumento na coloração com laranja de acridina, indicando o processo de autofagia, enquanto que as células CSB e XPD não demonstraram este aumento. Um indício importante vem de estudos recentes que ligam a autofagia com o início da senescência. Assim, autofagia e senescência podem ser parte do mesmo processo fisiológico, conhecido como transição autofagia-senescência. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que a autofagia e senescência tendem a ocorrer em paralelo, e que autofagia pode ser necessária para o fenótipo senescente. Além disso, pode-se inferir uma participação ativa do NER no reparo de lesões induzidas pela DOX. Assim, NER eficiente após o tratamento com DOX parece ser essencial para a sobrevivência da célula. Por outro lado, o recrutamento de fatores da via de NER (CSB e XPD) parece ser necessário para a indução de respostas celulares específicas, tais como a transição autofagia-senescência. / Doxorubicin (DOX) is an important agent in cancer therapy and its mechanism of action includes topoisomerase II-poisoning, free radicals release and DNA adducts formation.The nucleotide excision repair (NER) participates in the removal of lesions that distort the double helix of DNA induced by UV and chemicals. Cell lines deficient in NER are more sensitive to anthracyclines, however little is known about the cellular processes that permit cell survival after treatment with these drugs. In this work we verified the cellular response to DOX induced lesions in human fibroblasts cell lines proficient (MRC5) and deficient in NER (CSB, XPA, XPC and XPD). For this purpose we performed MTT, Annexin-V, Acridine orange and SA-b-galactosidase assays. In addition, the cell cycle dynamics and PDT (population doubling time) was determined after 72h DOX treatment. The results indicate that cell lines deficient in NER are more sensitive to anthracyclines and die in a dose dependent manner mainly by apoptosis. In the cell cycle analysis, a proficient MRC5 and XPA deficient cell lines showed a higher percentage of cells in G2/M phase. In contrast, CSB and XPD cells showed no relevant increase. When XPD cells were complemented with functional XPD gene a G2 arrest was observed just at low doses of DOX. In PDT assay, there was an increased number of hours required for doubling in MRC5 and XPA cells treated with DOX, whereas CSB and XPD lines did not show a relevant change in time required for cell duplication. This indicates that these cells proceed through the cell cycle even after treatment with DOX. In SA-b- galactosidase assay, MRC5, XPA and XPC lines entered in senescence after DOX treatment, while CSB and XPD do not induced in this process. These results were confirmed by Western Blot analysis where CSB and XPD cells do not exhibit difference in p21 and p16 expression levels (senescence markers) in response to treatment DOX. Along with the G2/M arrest and senescence induction, MRC5 and XPA cells showed an increase in acridine orange staining, indicating autophagy process, whereas CSB and XPD cells do not demonstrate this increase. An important clue comes from recent studies linking autophagy with the onset of senescence. Thus, autophagy and senescence may be part of the same physiological process, known as the autophagy-senescence transition. Taken together, our findings suggest that autophagy and senescence tend to occur in parallel, and that autophagy may be required for the senescent phenotype. Furthermore, we can infer an active involvement of NER in the repair of DOX-induced lesions. Thus, efficient NER following treatment with DOX seems to be essential for cell survival. On the other hand, recruitment of NER pathway factors (CSB and XPD) seems to be necessary for induction of specific cellular responses such as autophagy-senescence transition.
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Avaliação da indução de autofagia e senescência em fibroblastos humanos deficientes no reparo por excisão de nucleotídeos tratados com doxorrubicina

Souza, Larissa Milano de January 2014 (has links)
Doxorrubicina (DOX) é um agente importante na terapia antitumoral. Seu mecanismo de ação inclui inibição de topoisomerase II, formação de radicais livres e adutos de DNA. O reparo por excisão de nucleotídeos (NER) atua removendo lesões que distorcem a dupla hélice do DNA, como as induzidas por UV e agentes químicos. Linhagens celulares deficientes em NER são mais sensíveis às antraciclinas. Porém, pouco se sabe sobre os processos celulares que permitem sobrevivência celular destas linhagens após o tratamento com esta classe de drogas. Neste trabalho verificou-se a resposta celular às lesões induzidas por DOX em linhagens celulares de fibroblastos humanos proficientes (MRC5) e deficientes em NER (CSB, XPA, XPC e XPD). Para esta finalidade foram realizados os ensaios de MTT, anexina-V, laranja de acridina e SA-b-galactosidase. Além disso, a dinâmica do ciclo celular e PDT (population doubling time) foram determinados após 72 horas de tratamento com DOX. Os resultados indicam que as linhagens deficientes em NER são mais sensíveis à DOX e morrem de maneira dose-dependente, principalmente por apoptose. Na análise do ciclo celular, a linhagem proficiente MRC5 e a linhagem deficiente em XPA apresentaram maior porcentagem de células na fase G2/M. No entanto, as linhagens CSB e XPD não apresentaram aumento relevante. Quando a linhagem XPD foi complementada com gene XPD funcional uma parada em G2 foi observada apenas em baixas doses de DOX. No ensaio PDT, houve um aumento do número de horas necessárias para a duplicação das células MRC5 e XPA tratadas com DOX, enquanto células CSB e XPD não mostraram uma mudança relevante no tempo necessário para a duplicação celular. Isto indica que estas células prosseguem através do ciclo celular, mesmo após o tratamento com DOX. No ensaio de SA-b-galactosidase, as linhagens MRC5, XPA e XPC entraram em senescência após tratamento com DOX, enquanto CSB e XPD não foram induzidas neste processo. Estes resultados foram confirmados por análise de Western Blot, onde as células CSB e XPD não apresentam diferença nos níveis de expressão de p21 e p16 (marcadores de senescência), em resposta ao tratamento com DOX. Em conjunto com a parada em G2/M e indução da senescência, as células MRC5 e XPA mostraram um aumento na coloração com laranja de acridina, indicando o processo de autofagia, enquanto que as células CSB e XPD não demonstraram este aumento. Um indício importante vem de estudos recentes que ligam a autofagia com o início da senescência. Assim, autofagia e senescência podem ser parte do mesmo processo fisiológico, conhecido como transição autofagia-senescência. Tomados em conjunto, os nossos resultados sugerem que a autofagia e senescência tendem a ocorrer em paralelo, e que autofagia pode ser necessária para o fenótipo senescente. Além disso, pode-se inferir uma participação ativa do NER no reparo de lesões induzidas pela DOX. Assim, NER eficiente após o tratamento com DOX parece ser essencial para a sobrevivência da célula. Por outro lado, o recrutamento de fatores da via de NER (CSB e XPD) parece ser necessário para a indução de respostas celulares específicas, tais como a transição autofagia-senescência. / Doxorubicin (DOX) is an important agent in cancer therapy and its mechanism of action includes topoisomerase II-poisoning, free radicals release and DNA adducts formation.The nucleotide excision repair (NER) participates in the removal of lesions that distort the double helix of DNA induced by UV and chemicals. Cell lines deficient in NER are more sensitive to anthracyclines, however little is known about the cellular processes that permit cell survival after treatment with these drugs. In this work we verified the cellular response to DOX induced lesions in human fibroblasts cell lines proficient (MRC5) and deficient in NER (CSB, XPA, XPC and XPD). For this purpose we performed MTT, Annexin-V, Acridine orange and SA-b-galactosidase assays. In addition, the cell cycle dynamics and PDT (population doubling time) was determined after 72h DOX treatment. The results indicate that cell lines deficient in NER are more sensitive to anthracyclines and die in a dose dependent manner mainly by apoptosis. In the cell cycle analysis, a proficient MRC5 and XPA deficient cell lines showed a higher percentage of cells in G2/M phase. In contrast, CSB and XPD cells showed no relevant increase. When XPD cells were complemented with functional XPD gene a G2 arrest was observed just at low doses of DOX. In PDT assay, there was an increased number of hours required for doubling in MRC5 and XPA cells treated with DOX, whereas CSB and XPD lines did not show a relevant change in time required for cell duplication. This indicates that these cells proceed through the cell cycle even after treatment with DOX. In SA-b- galactosidase assay, MRC5, XPA and XPC lines entered in senescence after DOX treatment, while CSB and XPD do not induced in this process. These results were confirmed by Western Blot analysis where CSB and XPD cells do not exhibit difference in p21 and p16 expression levels (senescence markers) in response to treatment DOX. Along with the G2/M arrest and senescence induction, MRC5 and XPA cells showed an increase in acridine orange staining, indicating autophagy process, whereas CSB and XPD cells do not demonstrate this increase. An important clue comes from recent studies linking autophagy with the onset of senescence. Thus, autophagy and senescence may be part of the same physiological process, known as the autophagy-senescence transition. Taken together, our findings suggest that autophagy and senescence tend to occur in parallel, and that autophagy may be required for the senescent phenotype. Furthermore, we can infer an active involvement of NER in the repair of DOX-induced lesions. Thus, efficient NER following treatment with DOX seems to be essential for cell survival. On the other hand, recruitment of NER pathway factors (CSB and XPD) seems to be necessary for induction of specific cellular responses such as autophagy-senescence transition.

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