Leucodistrofia metacromática (LDM) é uma doença autossômica recessiva causada pela deficiência da enzima arilsulfatase A (ARSA) que afeta primariamente o sistema nervoso central (SNC). Tratamentos em estudos incluem a terapia de reposição enzimática e o transplante de medula óssea, porém com limitações devido à barreira hemato-encefálica (BHE). Uma alternativa seria a implantação no cérebro de células encapsuladas superexpressando ARSA, simulando a reposição enzimática sem injeções repetidas e eliminando a necessidade de transpor a BHE. Baseado nisto, testamos a habilidade de células BHK encapsuladas superexpressando ARSA em corrigir a deficiência enzimática em fibroblastos de pacientes com LDM. Três grupos foram analisados: fibroblastos tratados com células BHK superexpressando ARSA (rBHK) imobilizadas em cápsulas de alginato (grupo CAPSULES), fibroblastos tratados com o sobrenadante de células rBHK não encapsuladas (grupo UPTAKE CONTROL) e fribroblastos tratados com as cápsulas vazias (grupo EMPTY). Fibroblastos não tratados e normais foram usados como controles. As rBHK foram obtidas por seleção clonal após transfecção com o vetor pTARSA-CMV2, por método de transferência gênica não viral. A atividade de ARSA foi medida após 1, 2, 3 e 4 semanas de tratamento, usando ensaio espectrofotométrico. A atividade de beta-gal foi usada como referência. A análise estatística foi realizada usando os testes ANOVA e Tukey post hoc. Fibroblastos normais têm uma atividade de ARSA de 23,9 +/- 2,01 nmol/h/mg prot. Fibroblastos não tratados apresentaram baixos níveis enzimáticos (2,22 +/- 0.17). O grupo EMPTY apresentou os mesmos níveis de ARSA que os fibroblastos não tratados. Os grupos CAPSULES e UPTAKE CONTROL demonstraram altos níveis de ARSA, respectivamente 23,42 +/- 6,39 e 42,35 +/- 5,20 (p<0,01 para todos os grupos), quando comparado aos fibroblastos não tratados. Clones de rBHK encapsulados demostraram um alto potencial como nova estratégia terapêutica no tratamento de LDM, alcançando níveis enzimáticos normais em fibroblastos humanos deficientes. Entretanto, mais estudos devem ser realizados usando modelo animal para corroborar nossos achados. / Metachromatic leukodystrophy (MLD) is an autosomal recessive disorder due to arylsulfatase A (ARSA) deficiency that affects primarily the Central Nervous Systems (CNS). Ongoing treatments include enzyme replacement therapy and bone marrow transplantation, both limited in their effects due to the blood-brain barrier. An alternative would be the implantation in the brain of encapsulated cells over expressing ARSA that would eliminate the need of repeated infusions and overcome the blood brain barrier. Based on that, we tested the ability of encapsulated BHK cells over expressing ARSA to correct enzymatic deficiency in fibroblasts from MLD patients. Three groups were analyzed: fibroblasts treated with ARSA-over expressing BHK cells (rBHK) trapped in alginate capsules (CAPSULES group), fibroblasts treated with supernatant of non-encapsulated rBHK (UPTAKE CONTROL) and fibroblasts treated with empty capsules (EMPTY group). Untreated and normal fibroblasts were used as controls. rBHK were obtained by clone selection after non viral transfection with pTARSA-CMV2. ARSA activity was measured after 1, 2, 3 and 4 weeks of treatment using spectrophotometric assay, and beta-gal was used as reference enzyme. Sattistical analysis was performed using ANOVA and Tukey’s test. Normal group showed an ARSA activity of 23.9 +/- 2.01 nmol/h/mg prot. MLD untrated had the lowest ARSA activity (2.22 +/- 0.17). EMPTY group ARSA activity was equal untreated fibroblasts (2.71 +/- 0.34). CAPSULES and UPTAKE CONTROL groups showed higher enzymatic levels, compared with to the MLD untreated, respectively 23.42 +/- 6.39 and 42.35 +/- 5.20 (p<0,01 for all groups). Encapsulated rBHK clones show potencial as a new therapeutic strategy for the treatment of MLD, reaching a normal enzyme levels in human MLD fibroblasts. However more studies are still needed using MLD animal model to corroborate our findings.

Memoria para optar al Título Profesional de Químico Farmacéutico / Los fibroblastos cardíacos (FC), han sido denominados células centinelas del corazón, pues responden de manera variada y compleja ante cualquier elemento externo o interno a fin de mantener la homeostasis. Esta respuesta se lleva a cabo mediante una maquinaria conformada por una amplia red de receptores, entre ellos los receptores tipotoll y, en particular, el TLR4. La activación de este receptor ha mostrado mediar respuestas inflamatorias y fibróticas tanto en FC, como en otras células; en donde la expresión de proteínas de adhesión y reclutamiento de células del sistema inmune componen un eje vital en estos procesos. Por tanto se buscó determinar si la activación de TLR4 en el FC de ratas adultas genera una mayor adhesión de monocitos a través de un aumento en los niveles de E-selectina. La activación de TLR4 por LPS en FC, indujo un aumento en la expresión de Eselectina, situación que es revertida con el pre tratamiento con TAK-242 (inhibidor de TLR4). Adicionalmente, la activación de TLR4 generó un aumento en la adhesión de monocitos sobre los FC, mientras que la inhibición de TLR4 y las vías transduccionales ERK1/2, PI3K/Akt y NF-κB previo al estímulo con LPS, revirtió el aumento de adhesión de monocitos. De igual forma, el bloqueo de E-selectina, mediante el uso de un anticuerpo bloqueante, también revirtió el aumento de la adhesión, dando luces de que esta proteína de adhesión es fundamental para el reclutamiento de monocitos y por tanto para mediar la respuesta inflamatoria orquestada por el FC / Cardiac fibroblasts (CF) have been considered as sentinel cells, since they respond in a complex and diverse manner to external and internal stimulus, in orden to maintein homeostasis of the heart. This is mediated through a wide number of receptor, among then Toll-Like receptors, an particulary TLR4, play a critical role in cardiac inflammation. TLR4 activation has been involved in the regulation of inflammatory and fibrotic response both in CF and other cells; adhesion molecules and recruiment of immune cells are key elements of these process. Therefore we sought to evaluate whether TLR4 activation in CF obteined from adults rats increased monocyte adhesion trough increased levels of E-selectin. TLR4 activation by LPS in CF, induce increased in E-selectin expression, which was abolished when CF were pre treatment with TAK-242 (TLR4 inhibitor). In adittion, TLR4 activation increased monocyte adhesion to CF, whereas the inhibition of this receptor and releated signaling pathway ERK1/2, PI3K/Akt and NF-κB, previous LPS exposure reverse monocyte adhesion. Similarly, E-selectin blockade, by the use of blocking antibody, also blocked monocyte adhesion, which a yeast the importance of this adhesion molecule in monocyte recruitment and inflammatory response orchestrated by CF

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / En los últimos años se ha descrito y dado énfasis al rol determinante que tiene el fibroblasto cardiaco (FC) en el proceso inflamatorio, dónde cumple un rol clave a fin de mantener la homeostasis del órgano. En los procesos inflamatorios y en cualquier episodio de daño, los neutrófilos son la primera línea de defensa del organismo, los cuales son atraídos al sitio de daño por la quimioquina, interleuquina 8 (IL-8), quien además, provoca su activación. Posteriormente, el reclutamiento de neutrófilos en los sitios de daño es dependiente de las proteínas de adhesión E-selectina, ICAM-1 y VCAM-1. Por lo tanto, controlar la expresión de estas proteínas constituye un nuevo enfoque terapéutico en el tratamiento de los procesos inflamatorios. En ese sentido, el interferón beta (IFN-β), ha demostrado moderar la respuesta inflamatoria; pero hasta la fecha no se ha demostrado su utilidad como agente antiinflamatorio en el corazón y específicamente en el FC. Debido a estos antecedentes, el objetivo general fue estudiar el efecto preventivo del IFN-β sobre la expresión de IL-8, ICAM-1 y VCAM-1 bajo un contexto inflamatorio, inducido por estímulo con LPS. Consecuente con este hallazgo, se observó que el IFN-β disminuye la adhesión de neutrófilos sobre FC inducida por LPS. De esta manera, se demostró que el tratamiento con IFN-β puede modular la cascada inflamatoria, y así, transformarse en una potencial y valiosa herramienta terapéutica capaz de controlar la expresión de estas proteínas de vital importancia partícipes del proceso inflamatorio luego de algún evento de injuria cardiaca como lo puede ser una miocarditis, o bien, un infarto al miocardio / In recent years it is described the determining role that cardiac fibroblast (CF) has in the inflammatory process, where plays a major role to maintain homeostasis. In inflammatory process and any event of damage, neutrophils are the first line of defense, which are attracted to the site of damage through interleukin 8 (IL-8), who initially causes activation. Subsequently, neutrophil recruitment at sites of damage depends on Eselectin, ICAM-1 and VCAM-1 adhesion proteins. Therefore, controlling the expression of these proteins is a new therapeutic approach in the treatment of inflammatory process. In this sense, interferon beta (IFN-β) has shown be a inflammatory moderator; but to date it has not been proved useful as an anti-inflammatory agent in the heart, specifically on CF. On the basis of this background, the overall objective was to study the preventive effect of IFN-β on the expression of IL-8, ICAM-1 and VCAM-1 on CF under an inflammatory stimuli with LPS and evaluate neutrophil adhesion to CF. The results showed that IFN-β prevents the increased expression on IL-8, ICAM-1 and VCAM-1 induced by LPS. Consistent with this finding, we observed that IL-8, ICAM-1 and VCAM-1 decreases the neutrophil adhesion induced also by LPS on CF. Thus, it was shown that IL-8, ICAM-1 and VCAM-1 can modulate the inflammatory cascade, and thus become a potentially valuable therapeutic tool able to manage these important participants proteins of the inflammatory process after an event of cardiac injury as can be a myocarditis, or myocardial infarction

Memoria para optar al título de Químico Farmacéutico / El corazón está compuesto por varios tipos celulares, de los cuales aproximadamente el 90% corresponde a cardiomiocitos y a fibroblastos. Los fibroblastos representan 2/3 de la población total de células del corazón y están encargados principalmente del recambio de las proteínas de la matriz extracelular. Este tipo celular puede responder frente a una variedad de citoquinas, factores de crecimiento y expresan sus receptores, indicativo de una respuesta autocrina. Por acción del TGF-β1 se diferencian a un fenotipo celular altamente secretor de colágeno, el miofibroblasto, principal célula encargada del proceso de cicatrización. Por otra parte, existen antecedentes que demuestran que en fibroblastos cardíacos la activación de las vías transduccionales que conducen a un aumento en los niveles de AMPc contribuye a disminuir el grado de fibrosis cardíaca, por regulación de procesos tales como adhesión, migración y la diferenciación a miofibroblasto. Para estos efectos, el AMPc es crítico debido al rol que juegan dos proteínas que se activan cuando aumentan los niveles de éste; estas son Epac (Exchange protein activated by cAMP/ proteína intercambiadora de nucleótidos de guanina activada por AMPc) y PKA (proteína quinasa A). Anteriormente se estudió el rol desempeñando por la Epac en los procesos de adhesión y migración de fibroblastos y miofibroblastos, en donde se vio que Epac aumenta la adhesión en ambos fenotipos celulares, y con respecto a migración, se vio que los estímulos que aumentan los niveles de AMPc aumentan la migración en fibroblastos, pero no así en miofibroblastos. Con esto surge la interrogante de saber cómo modula la PKA estos procesos. El objetivo de este trabajo fue determinar el rol que juega la PKA en adhesión, migración y expresión de colágeno. Se utilizaron estímulos que aumentan los niveles de AMPc (isoproterenol y forskolina), el agonista de la PKA 6-Bz-AMPc y su inhibidor H-89. Nuestros resultados mostraron que tanto en fibroblastos como en miofibroblastos, hubo un aumento de la adhesión al estimular con isoproterenol y forskolina, pero con 6-Bz-AMPc no se observó un cambio significativo con respecto al control, aunque sí tendió a disminuir lo que indica que la PKA no regula la adhesión celular. En migración no se observa efecto alguno con el agonista de la PKA y en la expresión de colágeno se vio una disminución con isoproterenol, forskolina, 6-Bz-AMPc y Me-AMPc tanto en fibroblastos como en miofibroblastos. Conclusión: PKA no interviene dentro de los procesos de adhesión y migración, pero sí lo hace en la expresión de colágeno. / The heart is composed by many types of cells, mainly cardiomyocytes and fibroblasts (almost 90% of total cells). Fibroblasts represent two thirds of the whole heart cell population and are responsible for the constant turnover of extracellular matrix proteins. This kind of cells can respond to many cytokines, growth factors and express their receptors indicating an autocrine answer. By the action of TGF-β1, they can be differentiated into a new phenotype called myofibroblasts, highly secreting of collagen and main cell involved into the healing process. Otherwise, there are numerous reports indicating that in cardiac fibroblasts, activation of signal transduction pathways leading to increased cAMP levels contributes to the reduction of cardiac fibrosis by regulating profibrotic processes like adhesion, migration and myofibroblast differentiation. For these effects cAMP is critical due to the role played by two proteins whose activation depends on the increase in the cAMP levels. These proteins are Epac (Exchange protein activated by cAMP) and PKA (protein kinase A). Formerly it was studied the role played by Epac in adhesion and migration of fibroblasts and myofibroblasts. Epac increased cell adhesion in both phenotypes, and about migration, in fibroblasts this phenomenon was increased with all the stimuli that increased the cAMP levels, whereas in myofibroblasts were no effect. So, we can ask about the role lead by PKA in these processes. The objective in this work was determined which role plays PKA in adhesion, migration and collagen expression. We used stimuli that increase cAMP levels (isoproterenol and forskolin), PKA’s agonist 6-ph-cAMP and its inhibitor H-89. Our results showed that both fibroblasts and in myofibroblasts there was an increase in cell adhesion in response to isoproterenol, forskolin and H-89, but with 6-ph-cAMP no significant change was observed respect control but tended to decrease, indicating that PKA is not involved in cell adhesion. In migration no effect was observed with 6-ph-cAMP, and finally in collagen expression these stimuli decreased the expression (we tried with Epac agonist Me-cAMP too) in both phenotypes. Conclusion: PKA does not intervene in adhesion and migration processes, but it does in collagen expression.

A polpa dental é formada de tecido conjuntivo frouxo sendo constituída por diversas células, dentre as quais os fibroblastos são as mais numerosas. Ao serem submetidas a agressões diversas, estas células respondem com a liberação de substâncias, tais como citocinas e quimiocinas, que participam de maneira ativa no processo inflamatório. Assim sendo, este trabalho teve como proposição: 1. avaliar a capacidade de fibroblastos de polpa dental humana em cultura em produzirem as quimiocinas MIP-l\'alfa\' /CCL3 e SDF-1/CXCL12; 2. avaliar a produção destas quimiocinas pelos fibroblastos quando estimulados por Enterococcus faecalis morto por calor com relação à quantidade de bactérias por célula e 3. avaliar a liberação destas quimiocinas com relação ao tempo de estímulo. Para o estabelecimento das culturas, foi coletada a polpa de terceiro molar hígido de um paciente saudável. O tecido foi extraído, armazenado e picotado em meio de cultura para fibroblastos (DMEM), os quais foram utilizados a partir da quarta passagem. Após adesão das células a placas de 24 poços, o meio de cultura contendo Enterococcus .faecalis morto por calor numa concentração correspondente a 1, 10 e 100 bactérias por fibroblasto foi adicionado aos poços. Após 1, 6 e 24 horas, o sobrenadante das células foi coletado para a análise por ELISA. A análise estatística foi realizada aplicando-se o teste Kruskal-Wallis com nível de significância de 5%. A produção de MIP-l\'alfa\' /CCL3 e SDF-l/CXCL12 pelas células pôde ser detectada por ELISA. Os fibroblastos pulpares se mostraram capazes de produzir SDF-1 constitutivamente sendo que o estímulo bacteriano levou a uma diminuição estatisticamente significativa desta produção. A produção de MIP-l\'alfa\' também foi detectada tanto de maneira constitutiva como em resposta ao desafio microbiano. Enquanto a concentração intermediária de bactéria por fibroblasto (10:1) mostrou uma produção semelhante ao grupo controle, as concentrações de 1 e 100 bactérias por fibroblasto induziram aumento maior na primeira hora de estímulo. Essas diferenças, entretanto, não foram estatisticamente significativas. A capacidade dos fibroblastos secretarem quimiocinas, como MIP-l\'alfa\' e SDF-1, reforça a importância dessas células dentro do contexto de imunidade e inflamação pulpar, principalmente por serem as células mais numerosas deste microambiente. / Dental pulp is a connective tissue structure constituted by many different cell types. Among them, the fibroblasts are the most frequent ones. When challenged by different aggressive agents, these cells are able to release some substances like cytokines and chemokines, which are essential to trigger the inflammatory process. The aims of this study were: 1. to evaluate the ability of fibroblasts to produce the chemokines MIP-l\'alfa\'/CCL3) and SDF-1/CXCL12; 2. to evaluate the expression of these chemokines by fibroblasts when challenged by heat killed Enterococcus. faecalis in gradual concentrations and 3. to evaluate the production of these chemokines in a time course manner. The dental pulp from non-carious third molar was collected from a healthy patient. Explants were made and stocked in culture medium (DMEM) for fibroblasts growth. The cells were used since passage four. In a 24-well plate and after reaching confluence, culture medium alone or containing heat killed E. faecalis at proportion 1:1, 10:1 and 100:1 bacteria:fibroblast, were added to the fibroblasts. After 1, 6 and 24 hours, the supernatants were collected for analysis. The protein detection of MIP-l\'alfa\'/CCL3 and SDF-1/CXCL12 was performed by ELISA. For statistical analysis, data were assessed by Kruskal-Wallis followed by Miller post-test. Significance levels of 5% were adopted. Production of both chemokines was detected by ELISA. Pulp fibroblasts were able to produce SDF-1 constitutively. This production decreased with the increase in the number of heat killed E. faecalis increased (p < 0.05). Production of MIP-l\'alfa\' was detected in unchallenged and challenged cells. The median bacterial concentration (10:1) presented a profile production similar to that of unstimulated cells. Bacterial concentrations of 1 and 100 microrganisms/cell showed a highly enhanced production of MIP-l\'alfa\' at the first hour of stimulum; however, these data were not statistically significant (p > 0.05). Fibroblasts ability to produce chemokines, like MIP-l\'alfa\' and SDF-1, confirms their importance at immune and inflammatory events in dental pulp, specially being fibroblasts the most abundant cells at this microenvironment .

Introdução: A artrite reumatoide é caracterizada pela invasão de fibroblastos sinoviais no interior da cartilagem e pela erosão do osso ocasionando uma progressiva destruição da articulação. A invasão de fibroblastos in vitro é correlacionada com o dano articular na AR, entretanto pouco é sabido sobre esta regulação. O peptídeo liberador da gastrina (GRP) é um homólogo funcional da bombesina e sua sinalização através de seu receptor está envolvida em diversas funções, incluindo a resposta inflamatória. O GRP e seu receptor (GRPR) têm sido encontrados na membrana sinovial e no fluído de pacientes com AR, mas o envolvimento dos mesmos na AR não está completamente elucidado. Em paralelo, estudos tem mostrado que a sinalização GRP/GRPR está relacionada com a sinalização PI3K/AKT. Esta última, é uma via de sinalização que apresenta um papel chave em diversos processos celulares, como proliferação, migração e invasão celular. O RC-3095 é um antagonista do GRPR. Objetivo: Avaliar o envolvimento do GRP e do GRPR no comportamento invasivo dos FLS de camundongo com artrite, bem como o envolvimento do GRP na sinalização da via PI3K/AKT Métodos: FLS foram isolados das articulações de camundongos com artrite induzida por colágeno. A expressão de GRPR foi investigada por imunocitoquímica e por western blot. A proliferação celular foi avaliada pelo ensaio de sulforodamina B após o tratamento dos FLS com GRP e/ou RC-3095 (antagonista do GRP), e/ou Ly294002 (inibidor da via PI3K/AKT) e a capacidade invasora dessas células após o tratamento com GRP, RC-3095 ou Ly249002 foi avaliada utilizando um ensaio de invasão em matrigel. A fosforilação da AKT foi analisada através de western blot. Resultados: A proteína GRPR foi detectada por imunocitoquímica e western blot. A exposição ao GRP aumentou cerca de duas vezes a invasão comparado com células não tratadas (p<0,05), enquanto que o RC-3095 reverteu este efeito (p<0,001). O GRP também aumentou a expressão de AKT fosforilada. Por fim, quando adicionado Ly294002 com GRP, o mesmo preveniu o aumento da invasão induzida por GRP (p<0.001). Conclusão: Esta é a primeira vez que a expressão de GRPR está sendo demonstrado nos FLS. Além disso, este trabalho sugere que o GRP aumenta o comportamento invasor dos FLS. Este efeito ocorre em parte através da ativação da AKT. Entretanto, mais estudos devem ser realizados sobre a via GRP/GRPR, já que a mesma pode ser relevante para o desenvolvimento de terapias cujo alvo são os FLS. / Introduction: Rheumatoid Arthritis (RA) is characterized by invasion of fibroblast-like synoviocytes (FLS) into de articular cartilage and by bone erosion leading to progressive joint destruction. FLS in vitro invasiveness correlates with articular damage in RA, yet little is known about this regulation. Gastrin-releasing peptide (GRP) is a functional homologue of bombesin, and its receptor signaling is involved in several functions, including the inflammatory response. GRP and its receptor (GRPR) have been found in synovial membrane and fluid of RA patient, but their involvement with RA is not completely elucidated. In parallel, studies have shown that GRP/GRPR is related with PI3K/AKT signaling. This pathway plays a key role in multiple cellular processes such as cell proliferation, migration and invasion. RC-3095 is an antagonist of GRPR. Objective: To examine the role of gastrin-releasing peptide (GRP) and its receptor (GRPR) on the invasive behavior of fibroblast-like synoviocytes (FLS) from arthritic mice, as well as to evaluate GRP-induced signaling on PI3K/AKT pathway Methods: FLS were isolated from the joints of mice with collagen-induced arthritis (CIA). Expression of GRPR in FLS was investigated by immunocytochemistry and western blot (WB). FLS treated with GRP and/or RC-3095 (GRP antagonist), and/or Ly294002 (inhibitor of PI3K/AKT pathway) were assessed for proliferation by sulforhodamine B assay over a three-day period, and for invasion using a Matrigel-coated transwell system over 24 hours. Akt phosphorylation was assessed by WB. Results: GRPR protein was detected in FLS by immunocytochemistry and WB. Exposure to GRP increased FLS invasion by nearly two-fold, compared with untreated cells (p<0.05), while RC-3095 reversed that effect (p<0.001). GRP also increased phosphorylated AKT expression in FLS. When Ly294002 was added with GRP, it prevented the GRP-induced increased cell invasiveness (p<0.001). Conclusion: GRPR was expressed on FLS and mediates the GRP-induced increased invasiveness. This effect occurs at least in part through the AKT activation. Further understanding of the GRP/GRPR pathway could be relevant in the development of FLS-targeted therapy for RA.

Orientador: José Buratini Junior / Banca: José Antonio Visitin / Banca: Guilherme de Paula Nogueira / Banca: Fernanda da Cruz Landim e Alvarenga / Banca: Sony Dimas Bicudo / Resumo: Durante o desenvolvimento ovariano fetal, a formação folicular inicial é decisiva para a fertilidade da fêmea, pois define sua reserva gametogênica. Tem sido proposto que a progesterona e o estradiol desempenham papel regulatório na foliculogênese pré-antral, de forma que sua produção reduzida em ovários fetais bovinos antecede o surgimento de folículos primordiais e primários. Recentemente, os FGFs 10 e 18 foram reportados em folículos ovarianos bovinos como redutores dos níveis de esteróides, o que parece envolver a inibição da expressão de enzimas necessárias à esteroidogênese. Em adição, a expressão do FGF10 foi observada durante o desenvolvimento ovariano fetal bovino, e esteve positivamente associada ao aumento no número de folículos primários. O presente estudo investigou primeiramente o padrão de expressão do RNAm das enzimas esteroidogênicas (StAR, CYP11A1, 3β-HSD, CYP17A1, CYP19A1 e 17β-HSD) em ovários de fetos bovinos em idades gestacionais específicas (60, 75, 90, 120, 150 e 210 dias). Todos os genes investigados se mostraram expressos e regulados ao longo da gestação. Os níveis de RNAm da CYP19A1 diminuíram dos 60 para os 90 dias, sugerindo envolvimento desta enzima com a produção decrescente de estradiol observada previamente durante este período gestacional. A expressão das demais enzimas foi elevada ao longo da gestação, coincidente com o aumento da competência esteroidogênica descrito preliminarmente durante o desenvolvimento folicular inicial. Em adição, foi investigada a participação dos FGFs 10 e 18 na esteroidogênese ovariana fetal bovina. A expressão do FGF18 e de seus receptores (FGFR2C, FGFR3C e FGFR4) foi detectada em ovários fetais bovinos ao longo da gestação (60, 75, 90, 120, 150 e 210 dias). A abundância de RNAm do FGF18 aumentou... (Resumo completo, clicar acesso eletrônico abaixo) / Abstract: During fetal ovarian development, early follicular formation is essential to female fertility, when the gametogenic reserve is defined. It has been proposed that progesterone and estradiol play regulatory role on preantral folliculogenesis, once its reduced production in bovine fetal ovaries precedes primordial and primary follicle assembly. Recentlly, FGFs 10 and 18 were reported in bovine ovarian follicles as reducers of steroids levels, and this seems to involve the inhibition of enzymes necessary to steroidogenesis. In addition, FGF10 expression was observed during bovine fetal ovary development, and it was positively associated with the elevation on primary follicles number. The present study first investigated the mRNA expression patterns for steroidogenic enzymes (StAR, CYP11A1, HSD3B1, CYP17A1, CYP19A1 and HSD17B1) in bovine fetal ovaries at specific gestational ages (60, 75, 90, 120, 150 e 210 days). Expression of all investigated genes was detected and regulated through gestation. Messenger RNA levels of CYP19A1 decreased from days 60 to 90 of gestation, suggesting involvement of this enzyme on decrescent estradiol production previously observed during this gestational period. The expression of other enzymes was elevated during gestational period, which was coincident with the enhance of steroidogenic competence previously described during early follicular development. In addition, the participation of FGFs 10 and 18 on steroidogenesis in bovine fetal ovaries was investigated. The expression of FGF18 and its receptors (FGFR2C, FGFR3C and FGFR4) was detected in bovine fetal ovaries through gestation (60, 75, 90, 120, 150 e 210 days). The mRNA abundance of FGF18 enhanced between 90 and 120 days and decreased at 210 days. The expression of FGFR2C and FGFR4 did not vary during... (Complete abstract click electronic access below) / Doutor

Submitted by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-07-06T19:28:12Z No. of bitstreams: 1 cp108663.pdf: 6511010 bytes, checksum: a1f904e3c30018157c57e2ce7903eb20 (MD5) / Approved for entry into archive by Diogo Misoguti (diogo.misoguti@gmail.com) on 2016-07-06T19:28:51Z (GMT) No. of bitstreams: 1 cp108663.pdf: 6511010 bytes, checksum: a1f904e3c30018157c57e2ce7903eb20 (MD5) / Made available in DSpace on 2016-07-06T19:28:51Z (GMT). No. of bitstreams: 1 cp108663.pdf: 6511010 bytes, checksum: a1f904e3c30018157c57e2ce7903eb20 (MD5) Previous issue date: 2009 / Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) / Objetivo: Avaliar o impacto das próteses de polipropileno (PPL) e polipropileno/ poliglecaprone (PPL/PG) na atividade in vitro da metaloproteinase-2 (MMP-2) em fibroblastos de indivíduos com hérnia inguinal indireta. Métodos: A partir de amostras de pele e saco herniário de pacientes com hérnia inguinal indireta unilateral formam-se linhagens de fibroblastos encubadas em três meios distintos: fibroblastos isolados, fibroblastos com tela de PPL e fibroblastos com tela de PPL/PG. A atividade da MMP-2 foi avaliada pela zimografia. Resultados: A atividade da MMP-2 nos fibroblastos da pele é menor quando associada á prótese de PPL (p=<0,0001) e PPL/PG (p=<0,0001). A atividade da MMP-2 de fibroblastos da pele é menor quando associada com PPL do que com o PPL/PG (p=<0,0001). A atividade da MMP-2 de fibroblastos da pele é maior do que a do saco herniário independente da presença (p=<0,0001) ou ausência das próteses (p=<0,0001). A atividade da MMP-2 nos fibroblastos do saco herniário é maior quando se associa com as próteses de PPL (p=<0,0001) e PPL/PG (p=<0,0001). A atividade da MMP-2 de fibroblastos originários do saco herniário é maior quando se associa com a prótese de PPL/PG do que com a prótese de PPL (p=0,0328). Conclusões: As próteses de PPL e PPL/PG diminuem a atividade da MMP-2 nos fibroblastos de pele e aumentam a atividade da MMP-2 nos fibroblastos de saco herniário nas linhagens celulares formadas a partir de tecidos de indivíduos com hérnia inguinal indireta unilateral. / Aim: This study aims to evaluate in fibroblasts obtained from individuals with indirect hernia the influence of different surgical meshes [polypropylene (PPL) and polypropylene / polyglecaprone (PPL/PG)] in the in vitro activity of the metalloproteinase-2 (MMP-2). Methods: Fibroblasts lineages were created from samples of the skin and the hernial sac. The cells were cultured in 3 different environments: (a) fibroblasts only, (b) fibroblast + PPL mesh, and (c) fibroblasts + PPL/PG mesh. MMP-2 activity was measured by zymography. Results: MMP-2 activity is decreased in skin fibroblasts cultured with PPL (p=<.0001) and PPL/PG (p=<.0001) meshes when compared to isolated fibroblasts. MMP-2 activity is lower in PPL mesh group compared to the PPL/PG group (p=<.0001). MMP-2 activity is higher in skin fibroblasts compared to hernial sac lineages irrespective of the presence (p=<.0001) or absence (p=<.0001) of the meshes. MMP-2 activity is decreased in hernial sac fibroblasts cultured with PPL (p=<.0001) and PPL/PG (p=<.0001) meshes when compared to isolated fibroblasts. MMP-2 activity is higher in PPL mesh group compared to the PPL/PG group (p=<.0328). Conclusions: MMP-2 activity is decreased in skin fibroblasts cultured with PPL and PPL/PG meshes but increased in hernial sac fibroblasts cultured with PPL and PPL/PG meshes.

Made available in DSpace on 2015-07-22T20:50:51Z (GMT). No. of bitstreams: 0 Previous issue date: 2009-09-30 / Introducao: A busca por uma fonte alternativa de celulas para a Engenharia Tecidual ossea, se deve a morbidade da area doadora e maior dificuldade de expansao in vitro quando da utilizacao de celulas de linhagem osteoblastica, como as celulas da medula ossea. Portanto, a busca de outras fontes celulares para contribuir para esta terapia, se torna fundamental. Objetivo: Avaliar a influencia do fator de crescimento transformante beta1(TGF-ƒÀ1) na diferenciacao celular de fibroblastos dermicos humanos cultivados em esponja de colageno. Metodos: As esponjas de colageno foram cortadas em pecas de 16mm de diametro e 2 mm de espessura sendo distribuidas em quatro grupos denominados de acordo com o meio de cultura: CONTROLE (Padrao); TGF-ƒÀ1 (Padrao acrescido de 10ng/mL de TGF-ƒÀ1); OSTEOG. Padrao acrescido de 0,5ƒÊg/mL de acido ascorbico, 10 mMol/L de ƒÀ-glicerofosfato e 10nMol/L de dexametasona) e OSTEOG.TGF- ƒÀ1(meio osteogenico acrescido de 10ng/mL de TGF-ƒÀ1). As avaliacoes da atividade da fosfatase alcalina (FAL) e quantidade de osteocalcina (OC) foram realizadas no sobrenadante. A interacao das celulas com a esponja de colageno foi avaliada pela exame histologico e a presenca de depositos de calcio fosfato realizada pelo teste de Von Kossa, todas as avaliacoes foram realizadas no segundo, setimo, 14 ‹, 21 ‹, 28 ‹ e 56 ‹dias. Resultados: Atividade da FAL e Quantidade de OC: nao houve diferenca entre os grupos CONTROLE e TGF- ƒÀ1 em nenhuma das avaliacoes e em nenhum dos pontos de avaliacao, no entanto na comparacao com os outros dois grupos, os valores foram significativamente menores, o grupo OSTEOG.TGF- ƒÀ1 obteve valores significativamente. Interacao Celula/Esponja: em todos os grupos as celulas inicialmente estavam na superficie com posterior penetracao para o interior da esponja. Depositos Mineralizados: nao existiu a presenca nos grupos CONTROLE e TGF- ƒÀ1 e nos grupos OSTEOG. e OSTEOG. TGF- ƒÀ1 existiu a presenca de depositos a partir do 14 ‹ dia ate o 56 ‹ dia. Conclusao: O TGF-ƒÀ1 no meio osteogenico, na cultura de fibroblastos dermicos humanos em esponja de colageno, aumentou a atividade da FAL e a quantidade de OC, nao alterando a interacao celula/esponja e a presenca de depositos mineralizados de calcio fosfato na estrutura da esponja de colageno / Introduction: The research of new sources of cells for Tissue Engineering of the human bone, it is necessary because the use of the primary choice for this therapy (bone marrow cell), can result in a morbidity of the donor area and poor expansion in vitro. Therefore, it is important to seek other cellular sources to contribute to this therapy. Objective: To evaluate the influence of transforming growth factor-beta 1 (TGF-â1) in the osteogenic differentiation of human dermal fibroblasts cultured in a collagen sponge. Methods: The collagen sponges were cut in 16x2-mm sections and distributed into four groups according to the culture medium: CONTROL (DMEM culture medium); TGF-â1 (DMEM culture medium with 10 ng/ml of TGF-â1); OSTEOG (DMEM culture medium with 0.5 ìg/ml of ascorbic acid, 10 mmol/l of â-glycerophosphate and 10 nmol/L of dexamethasone); and OSTEOG.TGF-â1 (osteogenic medium with 10 ng/ml of TGF-â1). Measurements of the alkaline phosphatase (ALP) activity and the amount of osteocalcin (OC) in the supernatant, as well as measurement of the penetration of cells in the sponge by histology and measurement of calcium phosphate deposits by the Von Kossa test, were performed on days 2, 7, 14, 21, 28, and 56 . Results: ALP activity and OC level: There were no differences between the CONTROL and TGF-â1 groups in any of the measurements between any of the measurement points. However, the measured values were significantly lower than the OSTEOG and OSTEOG.TGF-â1 groups. The OSTEOG.TGF-â1 group achieved significantly higher. Interaction Cell/Sponge: in all groups the cells were at the top of sponge in the beginning and there were a penetration into the sponge up to the end of the experiments. Deposits of Calcium Phosphate: There were no presence of deposits in the CONTROL and TGF-â1 groups. There were evidence of the deposits in the OSTEOG. and OSTEG. TGF-â1 groups from the 14° day up to 56° day. Conclusion: TGF-â1 in osteogenic medium increased the ALP activity and the OC levels but did not influence the interaction cell/sponge and the presence of mineralized deposits of calcium phosphate into the collagen sponge. / TEDE / BV UNIFESP: Teses e dissertações

Introdução: A artrite reumatoide é caracterizada pela invasão de fibroblastos sinoviais no interior da cartilagem e pela erosão do osso ocasionando uma progressiva destruição da articulação. A invasão de fibroblastos in vitro é correlacionada com o dano articular na AR, entretanto pouco é sabido sobre esta regulação. O peptídeo liberador da gastrina (GRP) é um homólogo funcional da bombesina e sua sinalização através de seu receptor está envolvida em diversas funções, incluindo a resposta inflamatória. O GRP e seu receptor (GRPR) têm sido encontrados na membrana sinovial e no fluído de pacientes com AR, mas o envolvimento dos mesmos na AR não está completamente elucidado. Em paralelo, estudos tem mostrado que a sinalização GRP/GRPR está relacionada com a sinalização PI3K/AKT. Esta última, é uma via de sinalização que apresenta um papel chave em diversos processos celulares, como proliferação, migração e invasão celular. O RC-3095 é um antagonista do GRPR. Objetivo: Avaliar o envolvimento do GRP e do GRPR no comportamento invasivo dos FLS de camundongo com artrite, bem como o envolvimento do GRP na sinalização da via PI3K/AKT Métodos: FLS foram isolados das articulações de camundongos com artrite induzida por colágeno. A expressão de GRPR foi investigada por imunocitoquímica e por western blot. A proliferação celular foi avaliada pelo ensaio de sulforodamina B após o tratamento dos FLS com GRP e/ou RC-3095 (antagonista do GRP), e/ou Ly294002 (inibidor da via PI3K/AKT) e a capacidade invasora dessas células após o tratamento com GRP, RC-3095 ou Ly249002 foi avaliada utilizando um ensaio de invasão em matrigel. A fosforilação da AKT foi analisada através de western blot. Resultados: A proteína GRPR foi detectada por imunocitoquímica e western blot. A exposição ao GRP aumentou cerca de duas vezes a invasão comparado com células não tratadas (p<0,05), enquanto que o RC-3095 reverteu este efeito (p<0,001). O GRP também aumentou a expressão de AKT fosforilada. Por fim, quando adicionado Ly294002 com GRP, o mesmo preveniu o aumento da invasão induzida por GRP (p<0.001). Conclusão: Esta é a primeira vez que a expressão de GRPR está sendo demonstrado nos FLS. Além disso, este trabalho sugere que o GRP aumenta o comportamento invasor dos FLS. Este efeito ocorre em parte através da ativação da AKT. Entretanto, mais estudos devem ser realizados sobre a via GRP/GRPR, já que a mesma pode ser relevante para o desenvolvimento de terapias cujo alvo são os FLS. / Introduction: Rheumatoid Arthritis (RA) is characterized by invasion of fibroblast-like synoviocytes (FLS) into de articular cartilage and by bone erosion leading to progressive joint destruction. FLS in vitro invasiveness correlates with articular damage in RA, yet little is known about this regulation. Gastrin-releasing peptide (GRP) is a functional homologue of bombesin, and its receptor signaling is involved in several functions, including the inflammatory response. GRP and its receptor (GRPR) have been found in synovial membrane and fluid of RA patient, but their involvement with RA is not completely elucidated. In parallel, studies have shown that GRP/GRPR is related with PI3K/AKT signaling. This pathway plays a key role in multiple cellular processes such as cell proliferation, migration and invasion. RC-3095 is an antagonist of GRPR. Objective: To examine the role of gastrin-releasing peptide (GRP) and its receptor (GRPR) on the invasive behavior of fibroblast-like synoviocytes (FLS) from arthritic mice, as well as to evaluate GRP-induced signaling on PI3K/AKT pathway Methods: FLS were isolated from the joints of mice with collagen-induced arthritis (CIA). Expression of GRPR in FLS was investigated by immunocytochemistry and western blot (WB). FLS treated with GRP and/or RC-3095 (GRP antagonist), and/or Ly294002 (inhibitor of PI3K/AKT pathway) were assessed for proliferation by sulforhodamine B assay over a three-day period, and for invasion using a Matrigel-coated transwell system over 24 hours. Akt phosphorylation was assessed by WB. Results: GRPR protein was detected in FLS by immunocytochemistry and WB. Exposure to GRP increased FLS invasion by nearly two-fold, compared with untreated cells (p<0.05), while RC-3095 reversed that effect (p<0.001). GRP also increased phosphorylated AKT expression in FLS. When Ly294002 was added with GRP, it prevented the GRP-induced increased cell invasiveness (p<0.001). Conclusion: GRPR was expressed on FLS and mediates the GRP-induced increased invasiveness. This effect occurs at least in part through the AKT activation. Further understanding of the GRP/GRPR pathway could be relevant in the development of FLS-targeted therapy for RA.