During the last century, cellular biology has been mostly assessed from the biochemical point of view: studying how biochemical stimuli modify the biochemical composition of living cells. However, most of the cells that form our body constantly exert or are subjected to mechanical forces. Muscle cells exert forces during contraction, vascular endothelial cells are subjected to shear forces due to blood stream, and pulmonary cells resist cyclic deformations due to spontaneous breathing. Therefore, it appears reasonable that mechanical forces play an important role in determining cell structure, composition, and function. The continuous increase in works relating mechanical properties of cells with cellular function has shown that mechanics are as important as biochemistry at the cellular level. Even the high development of nanotechnology, techniques such as atomic force microscopy (AFM) still present important limitations when applied to biological systems. The general aim of this thesis was to improve and apply AFM methods to the measurement of mechanical properties of living cells, laying especial emphasis on the probe geometry.The studies presented in this thesis are part of the work I carried out during the last four years in the Biophysics and Bioengineering Unit at the University of Barcelona School of Medicine. The thesis can be divided into four main sections: Introduction, Aims, Experimental studies, and Conclusions. The introduction (Chapter 1) attempts to make a brief review of cellular mechanics. The specific aims are presented in Chapter 2. The first work (Chapter 3) describes the design and set-up of an AFM based system to measure the mechanical properties (viscoelasticity and adhesion) of living cells under physiological conditions. The second work (Chapter 4) describes the development and validation of a blunted pyramidal elastic model used to determine the viscoelastic properties of soft gels and living cells. The third study (Chapter 5) validates the use of FIB modified flat-ended cylindrical tips to study the mechanical properties of biopolymer gels and living cells. The last work (Chapter 6) applies the modified cylindrical cantilevers and the developed AFM system to measure elastic and adhesive properties of living cells under inflammatory conditions.

EN CATALÀ DE LA TESI DOCTORAL"Importància de l'adhesió al substrat en la mecànica cel·lular: Implicacions en neutròfils i cèl·lules endotelials microvasculars".En organismes multicel·lulars complexos com els humans, el comportament de cèl·lules individuals ve dictat en gran mesura per les interaccions amb la matriu extracel·lular (ECM). La ECM és una xarxa de proteïnes filamentoses (com ara col·lagen, fibronectina o laminina) que proporciona un substrat físic per l'adhesió cel·lular. L'adhesió a la ECM està mitjançada bàsicament per les integrines, que són un tipus de proteïnes responsable de la transmissió a l'interior de la cèl·lula tant de senyals bioquímiques com de forces. El grau d'adhesió entre cèl·lules i el seu substrat, i la forma cel·lular que en resulta, han estat reconeguts com un factor determinant en l'expressió gènica i proteica i en funcions cel·lulars com la diferenciació o la proliferació. Remarcablement, s'ha determinat que aquesta regulació de la funció cel·lular depèn de la forma cel·lular independentment del grau d'enllaç entre integrines i ECM, suggerint que algun factor apart de la senyalització bioquímica és el responsable de llegir la informació associada amb l'adhesió cèl·lulasubstrat i de provocar una certa resposta en la funció cel·lular.Un factor que podria ser responsable de detectar l'adhesió cèl·lula-substrat és la mecànica cel·lular. Certament, s'ha vist que un increment en l'extensió cel·lular (àrea que ocupa una cèl·lula sobre un substrat) està associat amb un increment de la polimerització d'actina, de la fosforil·lació de la cadena lleugera de la miosina (MLC), de la duresa cel·lular i de la contractilitat. Les cèl·lules podrien doncs respondre a canvis en la forma cel·lular incrementant la tensió mecànica del citoesquelet i activant vies de mecanotransducció, probablement involucrant la familia de GTPases Rho. Tanmateix, aquesta hipòtesi no ha estat directament verificada, i altres paràmetres (com ara la forma del nucli) podrien estar involucrats. Addicionalment, encara no existeix un estudi global que analitzi com l'adhesió al substrat (i la forma cel·lular resultant) afecta la mecànica de les cèl·lules, i quines implicacions té això en la funció cel·lular.L'objectiu d'aquesta tesi ha estat l'estudi del paper de l'adhesió al substrat en la mecànica cel·lular per dos tipus cel·lulars relacionats amb el sistema respiratori, que constitueix l'àrea d'interès del nostre grup de recerca. El primer d'aquests tipus cel·lulars ha estat els neutròfils, un tipus de cèl·lules generalment no adherents però que s'activen i s'endureixen en contacte amb cèl·lules endotelials o amb un substrat com el vidre. La mecànica de neutròfils en els seus estats passiu i activat juga un paper clau a l'hora de determinar la funció dels neutròfils en resposta a estímuls inflamatoris. Tanmateix, actualment no està clar si la mecànica de neutròfils es correspon a la d'una gota líquida o si exhibeix esmorteïment estructural. Els canvis induïts per l'activació en la mecànica de neutròfils tampoc estan clars. Per clarificar aquestes qüestions, es va mesurar la reologia de neutròfils en funció de l'adhesió al substrat, posant èmfasi en les seves implicacions en la funció d'aquestes cèl·lules en els capil·lars de la microvasculatura dels pulmons. El segon tipus cel·lular estudiat va ser el de les cèl·lules endotelials, també provinents de capil·lars de la microvasculatura dels pulmons. En aquest cas, el treball es va orientar a entendre com la forma cel·lular (controlada a través de la tecnologia coneguda com a microestructuració o "micropatterning") afecta la mecànica i la proliferació cel·lular. La comprensió de com la forma cel·lular controla la proliferació es crucial per entendre el procés de l'aniogènesi o formació de nous vasos sanguinis, el qual es dóna essencialment durant la formació embrionària i en processos patològics com la formació de tumors. Aquest estudi ens va permetre avaluar el paper de la mecànica cel·lular en la proliferació de cèl·lules endotelials i determinar la seva importància relativa. En ambdós estudis, la mecànica cel·lular va ser avaluada mitjançant la mesura del mòdul complex elàstic G* amb microscopia de forces atòmiques (AFM) seguint un procediment ja descrit. G* proporciona informació tant sobre l'elasticitat cel·lular (duresa) com sobre la viscositat, i pot ser mesurat amb AFM per un ampli rang de freqüències. Això permet una caracterització precisa de la reologia cel·lular i una avaluació de la tensió interna del citoesquelet a través de la mesura de duresa.