Les infrastructures linéaires de transports (ILT), dont les routes, sont une des principales causes du déclin de la biodiversité. Bien que les évaluations environnementales permettent de limiter ce déclin, la séquence "Eviter, Réduire et Compenser" les impacts peine à s'appliquer pleinement. En effet, la séquence ERC fait bien souvent appel à des données qualitatives en oubliant les processus biologiques et/ou écologiques et leur échelle spatio-temporelle. L'impact des routes est globalement bien documenté pour plusieurs groupes biologiques, hormis pour les chauves-souris, pourtant susceptibles d'être très fortement affectées. Par ailleurs, leur protection stricte nécessite leur prise en compte dans la séquence ERC. Pour étudier l’impact des routes, et notamment des autoroutes, je me suis concentré sur l’étude des chauves-souris afin de mesurer et quantifier leur magnitude. Pour cela, différentes méthodes développées et réutilisables par les différents acteurs de terrain seront présentées. Ainsi, dans un premier temps, je me suis intéressé à une méthode de traitement des données issues d'écoutes acoustiques et à une méthode de valorisation. Dans un second temps, nous avons appliqué ces méthodes afin (i) de connaitre quels étaient les impacts des routes sur les populations de chauves-souris et (ii) afin d'évaluer l'efficience des mesures de réductions engagées pour réduire ces impacts. Nos principaux résultats montrent que les autoroutes ont un impact négatif significatif sur l'activité de chasse et de transit pour plusieurs espèces de chauves-souris jusqu'à au moins cinq kilomètres de distance à une autoroute. De plus, l'effet des autoroutes semblerait également avoir des conséquences sur la génétique des populations. Enfin, nous avons étudié les chiroptéroducs, ouvrages dédiés aux chauves-souris visant à réduire ces impacts par l'amélioration des connectivités écologiques. Ce type d'ouvrage dédié semble être approprié lorsqu'il est situé dans des corridors écologiques fins tels que les haies. / Biodiversity is being lost at an increased rate as a result of human activities. One of the major threats to biodiversity is infrastructural development. Although the measures taken in environmental impact assessments can limit this loss, the mitigation hierarchy to "Avoid, Reduce and Offset" impacts on biodiversity is not fully functional. Indeed, the mitigation hierarchy often uses qualitative data and does not account for the biological and/or ecological processes and their different spatial and temporal scales. The impact of roads is well documented for several biological groups but not for bats whereas they are likely to be very strongly affected. Moreover, as they are strictly protected, they should be considered in the mitigation hierarchy. Therefore, through the study of bats, I investigated the effects of roads, especially major roads, and intended to measure and quantify the magnitude of their impacts. This thesis presents different methods developed to reach this objective and which may be used by stakeholders in the field. First, I intended to determine how to process data collected through passive acoustic monitoring and how to exploit these data. Then I determined what the impacts of roads on bat populations are and I proposed a method in order to assess the mitigation measures which presume to restore bat habitat connectivity. Our main results show a significant negative effect of roads on bats foraging and commuting behaviour for several species and up to at least five kilometres away from a major road. In addition, the effect of major roads also seems to have consequences on populations’ genetics. Finally, we studied bat overpasses which are structures specifically dedicated to bats and aiming at reducing the impacts of roads by improving bats’ habitat connectivity. These structures seem to be appropriate when located in narrow ecological corridors such as hedgerows.